Yazarlar, yararlı tartışmalar için bu tekniği Joseph LoTurco ve Dennis Selkoe teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar, bu araştırma desteği için, Amerikan Sağlık Yardım Vakfı bağışçılar teşekkür ederim.

Utero elektroporasyon protokolün temel Kriegstein laboratuar 1, 2 vallahi başka bir makalede ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu teknik ilk Osumi laboratuar 3 açıklanan ve bizim protokol LoTurco laboratuar 4 geliştirilen bir dayanmaktadır. Biz protokol nöronal sürecin sonucudur gen fonksiyonu çalışma utero elektroporasyon geçerli olduğu bir açıklama ile takip en önemli ayrıntıları odaklanarak sıçan embriyoların utero elektroporasyon için protokol genel bir bakış, sağlayacaktır. 1 utero Elektroporasyon <ol><li> DNA ve yükleme iğneler hazırlanması Utero electroporations için ilk adım, DNA enjekte etmek istediğiniz yapıları belirlemek için denemenizi tasarlamak için . Bu yöntem hem misexpressing veya ilgi genleri aşağı vurma için yararlıdır. Misexpressing veya eksprese eden bir gen planlıyorsanız, nöronal prekürsör hücrelerinin aktif bir yararlanıcı kullandığınızdan emin olun. Biz tavuk beta-aktin organizatörü ve CMV arttırıcı 5 oluşur CAGGS organizatörü, tavsiye ederiz. Sadece küçük bir alt hücreleri utero elektroporasyon kullanarak transfekte yılından bu yana başarıyla electroporated bu hücrelerin takip edebilir, böylece bu gibi GFP olarak plazmid floresan protein kodlama için kritik öneme sahiptir. Plazmid kodlama GFP için, biz mikrolitrelik başına 0.5 mikrogram konsantrasyonda DNA hazırlanması önerilir. ShRNA yapıları için, biz verimli olarak mcL sonuçlar başına 0.5-1.0 mg ilgi gen yıkmak bulduk. Aşırı ekspresyonu veya misexpression için, genin boyutu ve deney için çağırdığı ifade düzeyine bağlı olarak, mikrolitrelik ortalama 1.0 ve 3.0 mikrogram arasında kullanılacak. DNA&#39;lar bir Qiagen endotoksin ücretsiz hazırlık kiti kullanılarak hazırlanan ve 1 x PBS içinde seyreltilir. Biz, bu nedenle, enjeksiyon için 10 mcL DNA karışımı hazırlar hayvanların çöp embriyonik beyin başına yaklaşık 0.5-1.0 mcL enjekte. Enjekte edilen DNA takip böylece DNA Fast Green 1 mcL ekleyin. Doğru şekli iğneler çekilmesi önemli bir adım. Walantus ve ark. DNA sağlamak için farklı bir sistem kullanır ve böylece iğne hazırlık sonra bizim 1,2 slighly farklı. Iğne çekmek için kullandığınız ayarları, sizin sahip olduğunuz iğne çektirmenin marka bağlıdır. Biz David Kopf Model 750 kullanın. Kullandığımız ayarları: Isı 1: 9.0, Isı 2: 0, solenoid: 0, Filament boyutu 3.0 mm, Isıtıcı Yakınlık: 3 mm, Süre: 10 sn. Bir kez çekti, biz, ucu açılması büyük bir bölümü mesafenin 11 mm olduğu gibi ~ 45 derecelik açı bir jilet ile iğne kesti. Daha sonra iğne arka uç DNA yükleyin. Daha sonra mısır yağı ile iğne kalan boşluğu doldurmak. DNA enjeksiyon için, biz bir Picospritzer III kullanın. Her iğne için kesilir tam konik bağlı olarak, 4.0 &#39;dan 6.0&#39; a Picospritzer ayarlayın. Biz iğne DNA dışarı attıktan basınçlı hava sağlamak için bir ayak pedalı kullanır. </li><li> Ameliyat için hayvanların hazırlanması Biz sadece bu ameliyatlar için patojen free Sprague Dawley rat kullanın. Birkaç diğer laboratuvarları genotipleri de değişen fareler kullanın. Burada, biz E15 sıçan embriyoların elektroporasyon için protokol göstermek ancak in utero elektroporasyon E13 ve E18 yaşları arasında sıçan rutin olarak yapılır açıklanmaktadır. Erken evre elektroporasyon korteksin derin katmanları hedefleri olsa da, sonraki aşamada electroporations daha yüzeysel katmanları hedefliyoruz. Ameliyat başlamadan önce Hayvanlar buprenorfin bir ameliyat öncesi doz (0.05-0.1 mg / kg) verilmiştir. Hayvan anestezi için birden fazla seçenek vardır. Rutin intraperitoneal ketamin (40-80 mg / kg) ve xylazine (5-10 mg / kg) 1,2 Walantus ve ark. Isofuorane inhalasyon kullanır. Hayvanlar tamamen anestezisiz ve tepkisiz olmasını sağlamak için her zaman bir ayak tutam yapılmalıdır. Hayvanlar cerrahi işlem boyunca ısıtmalı pad üzerinde tutulur. Hayvan kürk kesi bölgesi traş ve iyot ile üç kez izledi etanol ile üç defa yıkanır. Kas bir kesi ile, orta hatta sadece yanal deride bir kesi yapılır. Rahim boynuzları çok dikkatli bir şekilde maruz kalmaktadır. Bunlar, parmaklarınızı kullanarak vücut boşluğuna hafifçe dışarı alay vardır. Dışarıdan vücut boşluğunda ise embriyolar steril PBS ile sulu tutun. </li><li> DNA enjekte ve elektroporasyon Bu cerrahisine ilk başladığınızda, en zor kısmı lateral ventriküller doldurmak böylece DNA enjekte gereken yere tanıdık olma, ve doğru bölgeyi vurmak için iğne enjekte etmek için ne kadar derin alışmak. Ident böylece Embriyolar hafifçe parmak uçlarınızla manipülenerede baş gösteren rakamları ve yakından bakarsanız, orta hat dikiş görmek mümkün olacak. Bu lateral ventrikül nerede olduğunu belirlemek için kullanabileceğiniz genel bir dönüm noktası olarak hizmet vermektedir. Biz rahim duvarı ve lateral ventrikül içine DNA enjekte edilir. Lateral ventrikül DNA / boya karışımı ile doludur kadar DNA birden fazla bakliyat yapılır - DNA enjeksiyon kontrol etmek için bir footpedal kullanın. Daha sonra embriyo kafasının iki tarafında kürek elektrotlar ve embriyo baş arasında nabız sunmak için başka bir footpedal kullanın. Elektrot yerleştirme korteksin hangi bölgede electroporated belirlenmesinde kritik önem taşımaktadır. DNA negatif yüklü olduğundan, DNA bir ücret kürekler boyunca ortadan pozitif elektrot doğru gidecek. Elektrotları tam yerleştirme bağlı olarak, hücrelerin farklı alt hedef olacaktır. Biz, beyin üzerinde dorsal medial pozisyonları yakın pozitif elektrot rutin olarak yerleştirin. Ancak, LoTurco laboratuar güzel, beyin daha fazla ventral lateral bölgelerde elektrotlar koyarsanız lateral kortikal akışı 6 kortikal-striatal sınır ve hit hücrelerinin hücreleri hedef olduğunu gösterdi. Her embriyo electroporated olabilir ve DNA yapıları farklı kombinasyonlar, her embriyo kullanılabilir. </li><li> Sütür ve post-operatif bakım Elektroporasyon ardından tüm embriyoların rahim boynuzları dikkatli bir şekilde vücut boşluğunda iade edilir ve kas tabakası ve cilt dikilir. Bu teknik, Walantus et al 1,2 ana hatlarıyla . Anestezi kurtarmak kadar Hayvanlar sürekli olarak izlenir ve analjezik buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) her 8-12 saatte bir uygulanır. </li></ol> 2. Kültürleme Electroporated Kortikal nöronlar <ol><li> Electroporated beyinleri Hasat ve electroporated bölge diseksiyon Utero elektroporasyon aşağıdaki in vivo analizleri için, hayvanlar yetişkinlik doğum sonrası erken elektroporasyon aşağıdaki 24 saat herhangi bir zaman noktasında hasat edilebilir. Ancak, kültür birincil nöronlar E16 az elektroporasyon takip eden 24 saat hasat. Şu anda, electroporated embriyolar GFP saptanabilir düzeylerde ifade edilmektedir. Hayvanlar karbondioksit inhalasyon ve hızlı dekapitasyon kullanılarak ötenazi. Rahim Embriyolar disseke ve kalsiyum katyonları ile HBSS yerleştirilen embriyoların hangi DNA plazmid electroporated izlerini tutmak. Bu süzülmüş HBSS, steril tüpler ve levhaları ve diseksiyon için otoklavlanmış araçlar kullanmak için kritik öneme sahiptir. Korteks disseke ve meninksler bir başlık bir mikroskop kullanılarak kaldırıldı. Bu korteks sonra GFP görselleştirmek için kapasiteye sahip bir diseksiyon mikroskop altında görülmektedir. Korteksin GFP pozitif bölgeleri tespit ve ue korteks GFP pozitif bölgelerde kesip Vanna makası, bir çift vardır. Bu parçalar, 15 ml konik bir tüp içinde kalsiyum katyonları olmadan HBSS yerleştirilir. </li><li> Nöronlar Dissociating ve kaplama HBSS tüm GFP pozitif bölgelerde disseke sonra,% 0.25 tripsin ile değiştirilir ve 5 dakika boyunca 37 derece inkübe edilir. Tripsin, kaldırılır kaplama ortam (DMEM +% 5 FBS + Penn / strep + glutamin), ve hücreleri ayırmak triturated 5-7 kez değiştirilmelidir. Kullanılan Hacimler miktar doku mevcut üzerine bağlıdır. Disosiye hücreler daha sonra CC2 kaplı odasına slaytlar kaplanmıştır. Kaplama medya 1.5 mL hacmi iki oda slaytlar için, plaka odasına ortalama 200,000-350,000 hücreleri. 4 saat sonra, kaplama medya aspire edilir ve odasına Nöronal başına 1.5 ml kültür ortamı (Neurobasal medya + B27 takviyesi + glutamax + gentamisin) ile değiştirilir. </li></ol> 3. Nöronal Süreç Analizi akıbet <ol><li> Tespit ve immün kültürlerin Bu hücrelerin genetik manipülasyon kısa vadeli effecs ölçmek için, biz, üç gün sonra in vitro birincil nöronlar hasat . Birincil nöronlar ilave analizler için uzun kültür, medya yarısı her üç günde bir değiştirilmesi gerekmektedir. Kültürleri tespit odalarından medya aspirat ve 15 dakika için% 4 paraformaldhyde nöronlar düzeltmek. Ardından fiksasyon, hücreler PBS içinde iki kez yıkanır ve sonra engelleme solüsyonu (% 2 eşek serum% 0,1 Triton PBS X-100) bir saat koymak Hücreler daha sonra 1 saat süreyle primer antikor inkübe edilir. Nöronal sürecin sonucudur analizler için, nöronlar tanımlamak için anti-beta tubululin antikor - beta II tubulin immün neruonal hücre gövdesi, dendritler ve aksonlar etiketler. Hücreler daha sonra beş dakika süreyle PBS içinde üç defa yıkanır, sonra, DAPI çekirdekleri counterstaining ve montaj üç PBS yıkar takip, Cy3-anti fare 1 saat süreyle inkübe. </li><li> Ölçme neurite uzunluk GFP pozitif, beta-III tubulin pozitif nöronların Görüntüler Zeiss Axioskop MC100 kamera sistemi ile elde edilir. Birçok değişken neurites, dallanma, tüm neurites uzunluğu, en uzun neurite süresi de dahil olmak üzere bu GFP pozitif hücrelerin kontrol edilebilir, hücre soma boyutu, vb Biz yıkmak veya genlerin aşırı ekspresyonu üzerine nöronal bir süreci akıbet analiz etmek için bu yöntemi kullandık nöronal sürecinin uzunluğu odaklanarak, nörogelişimsel ve nörodejenerasyon ile ilgili. Nöronal süreçlerin sonucudur ölçmek için, biz Axiovision LE 4.4 yazılımı (Zeiss) kullanın. Bu yazılım kapsamında, &quot;taslak&quot; aracı seçmek için bir seçenek yoktur. Bu aracı kullanarak, her bir nöron sürecinin uzunluğu izlemek için bilgisayarınızın fareyi kullanabilirsiniz. Bu sizin neurites doğru bir önlem almak için kullanmakta olduğunuz amacı tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bu analizler için, genellikle bir 20x objektif kullanın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Sprague Dawley çöp büyüklüğü 6 ve 14 embriyolar arasında değişmektedir bulduk. Biz genellikle tüm embriyoların electroporate. Her embriyo DNA&#39;ların farklı bir kombinasyonu ile electroporated olabilir. Ancak, genellikle, dissociating ve kaplama önce aynı durum ve havuz bu beyinleri en az dört beyinleri electroporate. Biz bu tekniği ile yaklaşık% 75 electroporated beyinleri dorsal medial veya ventral lateral korteks (Şekil 1) olsun, korteks istenen bölgeye yönelik olduğunu bulduk. Buna ek olarak, E13-14 hedef Tbr1 olumlu katmanı VI nöronlar gibi derin katman nöronların erken electroporations bulundu, bir süre sonra electroporations pozitif hedef CTIP2, TBR1 negatif tabaka V hücreleri, ve hala daha sonra electroporations hedef Brn2 olumlu layer II / III hücreleri. Kortekste nöronal alt tipi özellikleri farklı belirleyicileri ve açıklama mükemmel bir açıklaması, Moleneaux ve ark 7 bir makale bulundu . Şekil 2&#39;de, 15.5 veya 17.5 embriyonik gün ya electroporated ve postnatal 5. günde hasat beyinleri koronal bölümleri gösterir. Oct6 için immün kırmızı ile gösterilir. Hedef hücre tabakası popülasyonları onaylamak için kültür belirteçleri immunostain. Biz aynı çöp her embriyo hücrelerinin aynı hücre tabakası nüfusu hedef bekleyebilirsiniz bulduk (diğer bir deyişle, daha sonra diğer teknik varyasyonlar yerine embriyonik timepoint hedefleme bağlıdır). Kültür, pozitif GFP hücrelerinin yüzde yaygın GFP pozitif bölgesi (Şekil 3) dışarı Anatomi zaman ne kadar muhafazakar bağlı olarak değişebilir. Ancak, biz çok muhafazakâr ve hücrelerin sadece GFP pozitif yama, en yüksek oranda% 5-10 uymalarını teşrih bile electroporated korteks bölge diseksiyon olmasına rağmen, sadece tek bir katman hücre hedeflenmelidir. Bu düşük transfeksiyon effciency süreçleri analiz olduğunu electoporated hücreye ait olan belirlenmesinde yardımcı olur. Kaplama hücreleri bu yüksek yoğunlukta heathier kültürlerin katkıda bulunan, ancak, süreç ait olduğunu ayırt etmek zordur GFP negatif hücreler (Şekil 3) hücre gövdesi. Electroporated hücrelerin ince süreçlerin görülmeye sorun varsa, (Invitrogen gelen ya GFP ifade artırmak için electroporating GFP DNA konsantrasyonu artırabilir, ya da bir anti-GFP antikor kullanarak ayrışmış hücreleri immunostain ) Cy2 ikincil antikor ile birlikte. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 E15.5 Sprague-Dawley rat plazmid GFP ile electroporated ve üç gün sonra hasat edildi. Elektrot yerleştirme dayanarak, korteksin farklı bölgelerinde hedefleniyor. AF show GFP floresan bütün beyinlerinde. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. E15.5 (A) veya E17.5 (B) Sprague-Dawley sıçan GFP postnatal 5. günde plazmid ve hasat ile electroporated edildi. Brain kesitli, koronal bir vibratome (100 mikron bölümleri) kullanarak sabit ve Oct6 (kırmızı) ile immunohistokimyasal edildi. A ve B ile immunohistokimyasal bölümden konfokal görüntüleri göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 E15.5 Sprague-Dawley sıçan plazmid GFP ile electroporated. Elektroporasyon takiben 24 saat, beyin hasat ve GFP-pozitif, electroporated bölgelerinde video açıklandığı gibi, disseke ve ayrışmış edildi. In vitro olarak 3 gün sonra, hücreler sabit ve immunohistokimyasal BIII-tubulin (kırmızı) ve çekirdekleri DAPI (mavi) (A, C) ile boyama. Uzun neurite uzunluğu Axiovision yazılımı kullanılarak ölçüldü(B, D).

<ol>
	<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain.">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference.">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1.">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li></ol>

Primer nöronal kültürlerin in vitro çalışmada neurite akıbet kantitatif analizler için izin verir . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur nasıl etkilediğini araştırmak için, shRNA ya da misexpression yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanara...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cortical Neuron Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14185-052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14065-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630-080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dishes and Vials:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>
</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-547-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-554-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Tools:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91402-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Forceps</td>
<td>
</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11273-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11255-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Miscellaneous:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hand-Held Tally Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z169021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plating Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11960-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Growth Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NEUROBASAL Medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum-Free Supplement </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX -I Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin Reagent Solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunostaining:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fixative, Washes, and Blocking Buffer:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>017-000-121 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibodies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>beta-III tubulin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>MAB1637</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAP2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB15452</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy3 anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>715-166-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy2 anti-chicken</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>703-226-155 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>D3571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide Preparation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC2 Coated Two-Chamber Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>154852</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 x 60 mm Micro Cover Glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48393-106 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear nail polish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72180</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>995-2949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>4015809TV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>1118217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BTX square wave electroporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BTXECM830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tweezertrodes, 7 mm, platinum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450488</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons

Primer nöronal kültürlerin in vitro çalışmada, kantitatif analizler için neurite akıbet sağlar . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur, shRNA veya cDNA yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir nasıl etkilediğini araştırmak için. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanarak transfekte vardır. Utero elektroporasyon embriyonik kemirgen korteks DNA yapıları tanıtmak için kullanılması hedeflenen hücreleri belirli altkümelerini sağlar: elektroporasyon korteksin erken embriyonik korteks hedefleri derin katmanları, geç embriyonik timepoints az elektroporasyon daha yüzeysel katmanları hedefleri. Ayrıca, dorsal karşı ventral-lateral medial korteks bölgelerinin hedef bireysel embriyolar sonuçları başkanları arasında elektrot diferansiyel yerleştirme. Elektroporasyon ardından, transfekte hücreler, disseke ayrışmış, ve neurite akıbet kantitatif analiz için in vitro kaplı olabilir. Burada, kortikal hücrelerin altkümelerini nöronal sürecin sonucudur kantitatif ölçmek için bir adım-adım yöntemi sağlar. Utero elektroporasyon protokolün temel Kriegstein laboratuar 1, 2, diğer iki vallahi makalelerde detaylı olarak tarif edilmiştir . Biz en önemli ayrıntıları odaklanarak nöronal sürecin sonucudur gen fonksiyonu çalışmaya utero elektroporasyon geçerlidir protokolün bir açıklama ile takip utero elektroporasyon için protokol genel bir bakış, sağlayacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons at JoVE.com

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

17.6K Görüntüleme.  Brigham and Woman's Hospital and Harvard Medical School. Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

Video: In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Nörobilim

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...