Yazarlar Cedars-Sinai Rejeneratif Tıp Enstitüsü ve Guerin Ailesinden Samuel Oschin Kapsamlı Kanser Enstitüsü Kanser Araştırma Forumu Ödülü desteğini yanı sıra fon kabul etmek istiyorum. Açıklanan Proje Araştırma Kaynakları, Grant UL1RR033176 için Ulusal Merkezi tarafından finanse edilen bir CTSI Çekirdek Fiş şeklinde desteklenen ve Translational Bilimler, Grant UL1TR000124 ilerlemek için Ulusal Merkezi şimdi de edilmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Bu prosedür Cedars-Sinai IACUC gereklerine uygun olduğunu. Müfettişler önce işlem için kurumsal IACUC uyumunu sağlamalıdır. Bütün araçlar ve reaktifler, kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. 1.. Araçları&#39;nın hazırlanması, Çözümleri ve DNA Karışım <ol><li> Bir mikropipet çektirmesi içine 100 mm yangın parlatılmış borosilikat cam kapiller tüplerin yerleştirin. Yaklaşık 17,5 mm pipet oluşturan standart ağırlıklı çekme sağlamak için ısıtma ayarlayın. Kabaca 100 mikron çapında bir delik oluşturmak için ucu başından itibaren bir mesafe yaklaşık 8-9 mm keskin cerrahi makas ile ipuçları kesti. </li><li> Bir hisse% 1 w / kuru hızlı yeşil (20 mikron şırınga filtresi kullanılarak) süzülür nükleazsız su karıştırılarak hızlı yeşil çözüm v olun. </li><li> Tris-EDTA (TE) tampon maddesi içinde seyreltilmiş yüksek konsantre edilir saflaştırılmış endotoksin içermeyen plasmid DNA (örneğin,&gt; 3 ug / ml), izole edilir. Arzu edilen plazmidin ekleme miktarlarıKarışıma TE tamponu içinde seyreltilmiş ve (w / hızlı yeşil bir son konsantrasyon% 0.1 v hale getirmek)% 1 hızlı yeşil çözelti, bir 01:10 oranına ekleyin. Transgenlerin sağlam ifade plazmidinin bir 0.5-2.0 ug / ul son konsantrasyon kullanın. </li></ol> 2.. Hayvan Anestezi, Pipet Yükleme ve Pial Yüzey Plazmid Enjeksiyon <ol><li> 5-8 dakika boyunca (yavru yaş / ağırlığına bağlı olarak zaman) için buz üzerine yerleştirilen bir Petri tabağına yerleştirilerek doğum sonrası 1-2 günlük olan fareler üzerinde hipotermi anestezi neden. Hipotermi toe-kısma ve / veya kuyruk refleks hareketi eksikliği tarafından onaylandıktan sonra, fareler enjekte edilmeye hazır. Ağrı refleksleri belirgindir ise buz üzerine hayvanları geri yerleştirin. Hipotermi, enjeksiyon ve elektroporasyon prosedürler buna uygun anestezi korumak için zaman çok enjeksiyon işlemi ve elektroporasyon toplamda en az 2-3 dakika sürer. </li><li> Anestezi sırasında, standart bir pipet kullanarak dikkatlice pipet plasmi miktarını istenend başvuru için parafin bir film parçası üzerine (0.5-2 ul) enjekte edilmesi için karıştırın. Burada, plasmid karışımı 0.5 ul bir toplam hacim enjekte edilir. Daha sonra, bir mikro enjektör ile, dikkatli bir tüp ihtiva eden plasmid karışımı içine monte edilmiş cam kılcal pipet yerleştirin. Bu tüpün kenarlarına değmeyecek emin yaparak kırılmasını ucu önlemek için ekstra önlem almak. Yavaşça transfer kadranı geri çevirerek pipet içine çözüm aspire. Yeterli hacimde pipet içine konduktan sonra, 0 hPa nötr konuma basınç dönene kadar ileriye çevirin. </li><li> (2,2) Pipetlenen parafin filmi referans enjeksiyon yakın ucu yere, hatta Pial yüzey / meningeal alanı doldurmak için uygun basıncı sağlamak ve bir çıkartmak için mikro enjektör ayak pedalı kullanmak enjeksiyon için 300-450 hPa basınç kullanılarak parafin film üzerine hacmi. Püskürtülen miktar önceden pipetle referenc eşit oluncaya kadar buna basıncını ayarlayıne hacmi. </li><li> Uç dengelenmiş ve anestezi onaylandıktan sonra, yavrular enjekte edilmeye hazırdır. </li><li> Deneyin amacı Pial yüzey soylarının (Şekil 1A) içine aşağı doğru DNA elektroporasyon izin vermek için kafatası altında ve pial yüzey üzerinde plasmid karışımı enjekte etmektir. Korteks enjeksiyonlar için, başparmak ve daha az dominant elin parmağı kullanarak yavru basılı tutun. Kortikal hemisferlerin ve bu üstün kolikül gibi diğer yüzeysel yapıları bu yapılar (Şekil 1B) arasında kolay hedefleme sağlayan, P0 ve P2 arasında görebilir. Korteks dominant el ve hedef istediğiniz bölgeyi (vs yani motor, duyusal,) kullanılarak, serebral arterler önlemek için dikkat çekici bir cilt ve kafatası geçmiş pipet eklemek. (Sadece kafatası delme işleminden sonra daha fazla direnç eksikliği ile gösterilir) kafatası geçen ucun daha fazla nüfuz etmesini önlemek için emin olun. </li><li> Plazmaya enjekteid çözüm mikro enjektör ayak pedalını kullanarak ve emin doku (Şekil 2A) eşit olarak dağıtır olun. Not: Bu deneysel nedeniyle sıvı basınç hematom kaçınarak plazmid teslimat maksimize bir yaklaşım belirlemek çok önemlidir. Bu, enjeksiyon süresi, açı, hacim ve vasküler bozulmasını önlemek için kesin hedef site ayarlama yapılabilir. </li><li> Denemek ve yağlı kağıt veya plastik parafin filmi daha önce yapılan enjeksiyonları testi damlacıklar halinde ucu yerleştirerek enjeksiyonlar arasında kurumasını ucunu tutmak için emin olun. Bu, ucu ve tutarsız uygulama hacimlerinin tıkanma neden olabilir buharlaştırıldı ve kristalize DNA çözeltisi ucu birikmesini önlemek için gereklidir. </li></ol> 3. Elektroporasyon <ol><li> Her darbe arasında 950 msn aralıklarla, 50 milisaniye süren beş bakliyat için 135-150 V Electroporator ayarlayın. Iletkenliğini artırmak için vecilt yanan önlemek için, elektroporasyon jel ile 3 mm platin tweezertrodes kapsamaktadır. Anestezi sağlamak için bu noktada ayak-kısma ve kuyruk refleksleri kontrol edin. Duyarlı ise, uyuşturmak için birkaç dakika buz üzerine yerleştirin. </li><li> Korteks (ve birçok colliculus) enjeksiyonu için, (- ventriküler bölge elektroporasyon için kullanılır ve 10 mm elektrotlar, 7 ile karşılaştırıldığında) yavruların yaşama kabiliyetinin arttığı bir 3-mm elektrot (Şekil 2B) kullanır. Elektrot yönlendirme orta hatta (Şekil 2C) için 45-60 ° açıda olduğu şekilde göz altında kontralateral çevresinde enjekte alan ve pozitif yüklü prob üzerindeki elektrot negatif yüklü sonda yerleştirin. </li><li> Eğrilik için muhasebe zaman geçerli tetiklemek için elektroporatörü ayak pedalını kullanarak etkili yatan Pial yüzey hücrelerin içine DNA hedefleme, yavru yaşı ve ağırlığına bağlı olarak, 3-5 bakliyat için yerinde tweezertrodes tutunyarıkürelerinin. Not: negatif kutup darbe ya da daha büyük bir elektrot elektroporasyona alanını artırmak için kullanılabilir arasında enjeksiyon alanından geçer edilebilir. </li><li> Elektroporasyon hemen sonra dikkatlice yavrularından jel temizlemek ve yaklaşık 5 dakika için bir ısı lambası altına yerleştirin. </li><li> Yavrular akut siyanoz nedeniyle elektroporasyon sonra dakika içinde kendi doğal kırmızımsı-pembe renk kaybedersiniz. Kafeslerine onları dönmeden önce, doğal renk ve normal hareketinin başlatılması kurtarma için yavrular gözlemleyin. </li><li> O geri yuvasına yavrular getiriyor ve onları tımar başlar olmadığını gözlemleyerek anne ile yeniden sosyalleşmesini sağlamak. O agresif olursa, emin yavrular jel kalıntıları var ve yavrular için koku aktarmak için yatak bazı onları inkübe yok emin olun. </li></ol> 4.. Üstün kolikül Hedefleme için Değişiklikler Hedefleme: <ol><li> Inject üstün korteks olarak aynı şekilde kollikulus ama hedef bölge sadece posterior ve lambda lateral ve kabaca orta hatta yatıyor unutmayın (Şekil 3A ve 3B). Başarılı enjeksiyonları ile, plazmid karışımı doğal üstün kollikulusun hatlarını doldurur. Enjeksiyonlar başarılı bir şekilde elde edildikten sonra, hayvanlar elektroporasyon için hazırdır. </li></ol> Elektroporasyon: <ol><li> Çok benzer bir şekilde, üstün colliculus enjeksiyonlar için, üstün colliculus yüzeysel bölgesi (Şekil 3C) DNA&#39;nın sürücü, enjekte alan ve göz, burun veya çene etrafında pozitif yüklü prob üzerinde elektrodun negatif yüklü prob yerleştirmek . Bu durumda, elektrot yönlendirme orta hatta bir 25-40 ° açı ile yer almaktadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+historical+perspective+and+future+prospects.">Neural stem cells: historical perspective and future prospects.</a> Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), (2000).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+that+glitters+isn't+gold:+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses.">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li><li>Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginal+zone/layer+I+as+a+novel+niche+for+neurogenesis+and+gliogenesis+in+developing+cerebral+cortex.">The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).</li><li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genetic+targeting+of+pial+surface+neural+progenitors+and+immature+neurons+by+neonatal+electroporation.">Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation.</a> Neural Dev. 7, (2012).</li><li>Ohira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-induced+neurogenesis+of+neocortical+layer+1+progenitor+cells.">Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells.</a> Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).</li><li>Schmechel, D. E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golgi+study+of+radial+glial+cells+in+developing+monkey+telencephalon:+morphogenesis+and+transformation+into+astrocytes.">A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes.</a> Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).</li><li>Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+of+the+pial+basement+membrane+in+cortical+histogenesis.">A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis.</a> J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).</li><li>Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+neurons+of+the+human+cerebral+cortex.">The first neurons of the human cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).</li><li>Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidirectional+and+multizonal+tangential+migration+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex.</a> Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).</li><li>Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+migratory+coordinates+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+mouse+cortex.">Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex.</a> J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).</li><li>Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+route+of+tangentially+migrating+neurons+in+the+developing+neocortical+intermediate+zone.">Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone.</a> J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).</li><li>Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+cortical+layer+1.">The yin and yang of cortical layer 1.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).</li><li>Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+two+new+cortical+interneuronal+circuits.">The organization of two new cortical interneuronal circuits.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).</li><li>Endo, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+different+AMPA-type+glutamate+receptors+in+morphologically+identified+neurons+in+rat+superficial+superior+colliculus.">Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus.</a> Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).</li><li>Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinhibition+in+rat+superior+colliculus+mediated+by+GABAc+receptors.">Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors.</a> J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).</li><li>Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+waves+coordinate+patterned+activity+throughout+the+developing+visual+system.">Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system.</a> Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li><li>Boller, M., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+GABA(A)+and+GABA(C)+receptor+function+in+the+mammalian+superior+colliculus.">Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus.</a> Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex.">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).</li><li>De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+circuit+connectivity+in+postmitotic+neocortical+neurons.">In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), (2008).</li><li>Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis.">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat Commun. 3, (2012).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition.">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+monomeric+blue+fluorescent+protein+with+the+high+chemical+stability+of+the+chromophore.">An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Pial yüzey progenitörlerinin başarılı elektroporasyon için en önemli bir yönü vardır: 1) pial yüzeyine plasmid karışımı hedeflenmesi; 2) enjeksiyon sahasında hematom üretilmesini önlemek; ve 3) Ortabeyin elektroporasyon ile ilişkili mortalite kaçınarak. Uygun Pial yüzeyi hedef Pial yüzeyin nüfuz etmesini önlemek için kafatası ölçülü ve dikkatli bir delik açarak gerçekleştirilir. Hafifçe doku (yani hızlı yeşil deri ve bağ dokusu kafatası üzeri...

Sinir kök ve projenitör hücreler, memeli merkezi sinir sistemi 1, 2 mevcut bulunur. Onların doğası ve beyin ve omurilik ventriküler bölgelerini çevreleyen embriyonik ve yetişkin germinal bölgelerinde özellikleri de yoğun geçen on yılda 1-3 belgelenmiştir. Büyük ölçüde, bu nedeniyle böyle floxed alellerin veya 4 izleme retroviral soy sinir sistemi belirli Kre rekombinasyon olarak giderek kesin genetik araçlarının geliştirilmesi olmuştur. Ancak, bir ata bölge Pial yüzey atası sadece son zamanlarda herhangi bir detay 5-7 tarif edilmiş bölge-vardır ve bekliyor kapsamlı inceleme. Beynin Pial yüzeyi beynin yüzeyine ve çevredeki menenjlerin 8 arasında arabirim olarak tanımlanır. Daha sonra geliştirme, nöroepitel ve sırasında, radyal glial uç ayaklar bu yüzeye 9,10 takmak. Köknar Bazıinsan beyninin nöronal ve birçok mitoz st nöronların bu bölgede 11 &#39;de görülmektedir. Daha sonra, embriyonik nöron sırasında, kortikal nöronlar ara bölge ve subventricular bölge 12-14 kendi göç yolları ek olarak, Pial bölge hareket bilinmektedir. Bu dönemde, kök hücreleri, bu bölgesinden kültürlenebilir ve nöro-ve gliogenesis 5 aktif sitesi olarak görüntülenir. Erişkin beyinde, o internöron hipoksik meydan 7 aşağıdaki Pial yüzey progenitörlerinden doğmuş olabilir bildirilmiştir. Ancak, embriyonik ve postnatal gelişim sırasında genensis için onun için bu bölgenin katkısı nedeniyle özellikle bu bölgeyi 6 araştıran zorluk kısmen belirsiz kalmıştır. Üstün colliculus içinde ve serebral korteks, yüzeysel (ya da kortekste tabaka I) internöron temel uyarıcı nöron popülasyonlarının devre çıkış modüle eden ve bu nedenle signific katkıdaBu yapıların işlevi antly. Özellikle, tabaka 1 internöron kortikal sütun 15,16 yüzeyel ve derin tabakalara göre kapsamlı bağlantı verilen serebral korteksin üst katmanlar boyunca nöronların ateş düzenleyen Başbakan konumda bulunmaktadır. Benzer bir şekilde, yatay internöron nispeten geniş bir alan üzerinde, kortikal ve retinal elyaf, proje uyarıcı girdi almak ve uzak görsel uyaranlara yanıt 17,18 nöron popülasyonlarının inhibisyonunun aracılık ettiği iddia edilmektedir. Ayrıca, kendi morfoloji gelişmekte görme sistemi 19 desenli dalga aktivitesi potansiyel bir rol oynamak için çok uygundur. İlginçtir, interneuron gelişme ve olgunlaşma doğumdan büyük ölçüde olur. Bundan başka, bu olgunlaşma süreci nöronal aktivite ile düzenlenir bulunmuştur ve bu nedenle de fonksiyonu devre 20,21 yaşam boyu sonuçlarıyla gelişim plastisite bir substrattır. Özellikle, no özel promoterler transgenik bu hücreleri hedef olabilir tarif edilmiştir. Bölme progenitörler retrovirüs 7 ile hedef olabilir, ancak virüs üretimi, zaman alıcıdır ve hücre transdüksiyonu için gerekli olan yüksek titrelerini üretmek üzere beceri gerektirir. Bu sinir progenitörlerin 4, 22, 23, içinde sinyal yollarının hızlı ve etkili genetik sorgulama için izin verdiği Elektroporasyon nörolojik gelişim çalışmada bir rönesans yol açmıştır. Elektroporasyon, tek yönlü olarak ventriküller 4, 22, 23, çevreleyen çoğalan progenitörlerde DNA sürmek için başının dış elektrik darbeleri teslimi takiben plazmid DNA enjeksiyonu, içerir. Elektroporasyon plasmid 24 transgenlerin sentezlenmesi için hücre döngüsüne ait M fazı boyunca hücrelerin geçişini gerekli görünmektedir. Özel olarak, bulunmuştur ki, sadeceplasmidlerin elektroporasyon 8 saat içinde M faz geçen hücreler, ventriküler duvarın 24 ~ 160 um olan tüm hücrelere etkin teslimat rağmen transgenleri ifade edecektir. Nükleer geçirgenliği neden olan kimyasal maddeler postmitotik hücreleri 25 plasmidin sentezlenmesinin uyarılması gibi bu, epizomal plazmidlerin nükleer erişimi için de çekirdek zarı arıza için ihtiyaç nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Başlangıçta embriyo 22 istihdam, elektroporasyon daha sonra 26, 27, doğum sonrası beyin kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Son zamanlarda, yüzey Pial progenitörlerin 6 genetik manipülasyonu kullanmak için elektroporasyon adapte edilmiştir. Bundan başka, bu yaklaşımı kullanarak progenitörlerinin iki ayrı soylar bu bölge-internöronal ve astrositik 6 görünüşe olduğunu göstermiştir. Bu protokol sorgulama için bu hücreleri hedef için basit, hızlı ve güçlü bir şekilde ayrıntılarıBu hücrelerin gelişim düzenleyici mekanizmalar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

Son birkaç yılda Pial yüzey yaralanma sonrası da dahil olmak üzere, embriyonik perinatal ve yetişkin nöro-ve gliogenesis sırasında önemi bir germinal niş olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte, genetik olarak bu hücrelerin popülasyonları sorgulama ve soy izleme için yöntemler, özgünlüğü ya da zaman virüs üretimini tüketen olmaması nedeniyle sınırlı olmuştu. Böylece, bu bölgede ilerleme bu konumu soruşturmaların sadece bir avuç nispeten yavaş olmuştur. Elektroporasyon embriyo nöral kök hücre özelliklerini incelemek için bir on yıl için kullanılan ve son zamanlarda doğum sonrası beyinde olmuştur. İşte biz, bir uyarlanmış elektroporasyon yaklaşıma dayalı pial yüzey atalarıdır genetik manipülasyon için verimli, hızlı ve basit bir teknik açıklar. Pial yüzey elektroporasyon dolayısıyla bu hücrelerin incelenmesi için bir zaman tasarrufu ve ekonomik yaklaşımı temsil eden, bu atalarıdır uyduruk genetik etiketleme ve manipülasyon için izin verir.

Hücreleri çoğunlukla progenitorlar-ya da pial yüzeyinin yakınındaki 6 plazmid DNA&#39;nın ifade Pial yüzey elektroporasyon ile sonuçlanır. Daha spesifik olarak, elektrotların oryantasyonu plasmid hareket ve daha sonra ifade yönünü dikte kritiktir. Bu nedenle, çift elektrot yapılandırmalarında, plazmid negatif ve pozitif elektrot arasında yaklaşık düz bir vektör içinde yönlendirilir. Negatif kutup enjeksiyon yerinde üzerine yerleştirilir ve pozitif kutup negatif kutbuna ventral oldu?...

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Pial Surface Electroporation at JoVE.com

Neonatal Pial Surface Electroporation

Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Görüntüleme.  Cedars-Sinai Medical Center.  Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için. 

Video: Neonatal Pial Surface Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Yenidoğan subventricular Bölge Elektroporasyon

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying neonatal seizures and hypoxia ischemia. This manuscript describes a method for continuous video electroencephalogram (EEG) monitoring in neonatal mice to detect seizures and analyze EEG background during hypoxia ischemia. Use of video and EEG in conjunction allows description of seizure semiology and confirmation of seizures. This method also allows analysis of power spectrograms and EEG background pattern trends over the experimental time period. In this hypoxia ischemia model, the method allows EEG recording prior to injury to obtain a normative baseline and during injury and recovery. Total monitoring time is limited by the inability to separate pups from the mother for longer than four hours. Although, we have used a model of hypoxic-ischemic seizures in this manuscript, this method for neonatal video EEG monitoring could be applied to diverse disease and seizure models in rodents.

This manuscript describes a method for continuous video EEG recordings using multiple depth electrodes in neonatal mice undergoing hypoxia-ischemia.

Yenidoğan Farelerde Hipoksi-İskemi Sırasında Sürekli Video Elektroensefalogram

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

Fare Yenidoğan Beyin Mikro-BT Tarama ve Görüntü İşleme

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Yazar Spotlight: Fare Yenidoğan Beyinlerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi - Lugol&#39;un Solüsyon Kontrast Maddesi ile Bir Mikro-BT Protokolü

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...