Yazarlar Cedars-Sinai Rejeneratif Tıp Enstitüsü ve Guerin Ailesinden Samuel Oschin Kapsamlı Kanser Enstitüsü Kanser Araştırma Forumu Ödülü desteğini yanı sıra fon kabul etmek istiyorum. Açıklanan Proje Araştırma Kaynakları, Grant UL1RR033176 için Ulusal Merkezi tarafından finanse edilen bir CTSI Çekirdek Fiş şeklinde desteklenen ve Translational Bilimler, Grant UL1TR000124 ilerlemek için Ulusal Merkezi şimdi de edilmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Bu prosedür Cedars-Sinai IACUC gereklerine uygun olduğunu. Müfettişler önce işlem için kurumsal IACUC uyumunu sağlamalıdır. Bütün araçlar ve reaktifler, kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. 1.. Araçları&#39;nın hazırlanması, Çözümleri ve DNA Karışım <ol><li> Bir mikropipet çektirmesi içine 100 mm yangın parlatılmış borosilikat cam kapiller tüplerin yerleştirin. Yaklaşık 17,5 mm pipet oluşturan standart ağırlıklı çekme sağlamak için ısıtma ayarlayın. Kabaca 100 mikron çapında bir delik oluşturmak için ucu başından itibaren bir mesafe yaklaşık 8-9 mm keskin cerrahi makas ile ipuçları kesti. </li><li> Bir hisse% 1 w / kuru hızlı yeşil (20 mikron şırınga filtresi kullanılarak) süzülür nükleazsız su karıştırılarak hızlı yeşil çözüm v olun. </li><li> Tris-EDTA (TE) tampon maddesi içinde seyreltilmiş yüksek konsantre edilir saflaştırılmış endotoksin içermeyen plasmid DNA (örneğin,&gt; 3 ug / ml), izole edilir. Arzu edilen plazmidin ekleme miktarlarıKarışıma TE tamponu içinde seyreltilmiş ve (w / hızlı yeşil bir son konsantrasyon% 0.1 v hale getirmek)% 1 hızlı yeşil çözelti, bir 01:10 oranına ekleyin. Transgenlerin sağlam ifade plazmidinin bir 0.5-2.0 ug / ul son konsantrasyon kullanın. </li></ol> 2.. Hayvan Anestezi, Pipet Yükleme ve Pial Yüzey Plazmid Enjeksiyon <ol><li> 5-8 dakika boyunca (yavru yaş / ağırlığına bağlı olarak zaman) için buz üzerine yerleştirilen bir Petri tabağına yerleştirilerek doğum sonrası 1-2 günlük olan fareler üzerinde hipotermi anestezi neden. Hipotermi toe-kısma ve / veya kuyruk refleks hareketi eksikliği tarafından onaylandıktan sonra, fareler enjekte edilmeye hazır. Ağrı refleksleri belirgindir ise buz üzerine hayvanları geri yerleştirin. Hipotermi, enjeksiyon ve elektroporasyon prosedürler buna uygun anestezi korumak için zaman çok enjeksiyon işlemi ve elektroporasyon toplamda en az 2-3 dakika sürer. </li><li> Anestezi sırasında, standart bir pipet kullanarak dikkatlice pipet plasmi miktarını istenend başvuru için parafin bir film parçası üzerine (0.5-2 ul) enjekte edilmesi için karıştırın. Burada, plasmid karışımı 0.5 ul bir toplam hacim enjekte edilir. Daha sonra, bir mikro enjektör ile, dikkatli bir tüp ihtiva eden plasmid karışımı içine monte edilmiş cam kılcal pipet yerleştirin. Bu tüpün kenarlarına değmeyecek emin yaparak kırılmasını ucu önlemek için ekstra önlem almak. Yavaşça transfer kadranı geri çevirerek pipet içine çözüm aspire. Yeterli hacimde pipet içine konduktan sonra, 0 hPa nötr konuma basınç dönene kadar ileriye çevirin. </li><li> (2,2) Pipetlenen parafin filmi referans enjeksiyon yakın ucu yere, hatta Pial yüzey / meningeal alanı doldurmak için uygun basıncı sağlamak ve bir çıkartmak için mikro enjektör ayak pedalı kullanmak enjeksiyon için 300-450 hPa basınç kullanılarak parafin film üzerine hacmi. Püskürtülen miktar önceden pipetle referenc eşit oluncaya kadar buna basıncını ayarlayıne hacmi. </li><li> Uç dengelenmiş ve anestezi onaylandıktan sonra, yavrular enjekte edilmeye hazırdır. </li><li> Deneyin amacı Pial yüzey soylarının (Şekil 1A) içine aşağı doğru DNA elektroporasyon izin vermek için kafatası altında ve pial yüzey üzerinde plasmid karışımı enjekte etmektir. Korteks enjeksiyonlar için, başparmak ve daha az dominant elin parmağı kullanarak yavru basılı tutun. Kortikal hemisferlerin ve bu üstün kolikül gibi diğer yüzeysel yapıları bu yapılar (Şekil 1B) arasında kolay hedefleme sağlayan, P0 ve P2 arasında görebilir. Korteks dominant el ve hedef istediğiniz bölgeyi (vs yani motor, duyusal,) kullanılarak, serebral arterler önlemek için dikkat çekici bir cilt ve kafatası geçmiş pipet eklemek. (Sadece kafatası delme işleminden sonra daha fazla direnç eksikliği ile gösterilir) kafatası geçen ucun daha fazla nüfuz etmesini önlemek için emin olun. </li><li> Plazmaya enjekteid çözüm mikro enjektör ayak pedalını kullanarak ve emin doku (Şekil 2A) eşit olarak dağıtır olun. Not: Bu deneysel nedeniyle sıvı basınç hematom kaçınarak plazmid teslimat maksimize bir yaklaşım belirlemek çok önemlidir. Bu, enjeksiyon süresi, açı, hacim ve vasküler bozulmasını önlemek için kesin hedef site ayarlama yapılabilir. </li><li> Denemek ve yağlı kağıt veya plastik parafin filmi daha önce yapılan enjeksiyonları testi damlacıklar halinde ucu yerleştirerek enjeksiyonlar arasında kurumasını ucunu tutmak için emin olun. Bu, ucu ve tutarsız uygulama hacimlerinin tıkanma neden olabilir buharlaştırıldı ve kristalize DNA çözeltisi ucu birikmesini önlemek için gereklidir. </li></ol> 3. Elektroporasyon <ol><li> Her darbe arasında 950 msn aralıklarla, 50 milisaniye süren beş bakliyat için 135-150 V Electroporator ayarlayın. Iletkenliğini artırmak için vecilt yanan önlemek için, elektroporasyon jel ile 3 mm platin tweezertrodes kapsamaktadır. Anestezi sağlamak için bu noktada ayak-kısma ve kuyruk refleksleri kontrol edin. Duyarlı ise, uyuşturmak için birkaç dakika buz üzerine yerleştirin. </li><li> Korteks (ve birçok colliculus) enjeksiyonu için, (- ventriküler bölge elektroporasyon için kullanılır ve 10 mm elektrotlar, 7 ile karşılaştırıldığında) yavruların yaşama kabiliyetinin arttığı bir 3-mm elektrot (Şekil 2B) kullanır. Elektrot yönlendirme orta hatta (Şekil 2C) için 45-60 ° açıda olduğu şekilde göz altında kontralateral çevresinde enjekte alan ve pozitif yüklü prob üzerindeki elektrot negatif yüklü sonda yerleştirin. </li><li> Eğrilik için muhasebe zaman geçerli tetiklemek için elektroporatörü ayak pedalını kullanarak etkili yatan Pial yüzey hücrelerin içine DNA hedefleme, yavru yaşı ve ağırlığına bağlı olarak, 3-5 bakliyat için yerinde tweezertrodes tutunyarıkürelerinin. Not: negatif kutup darbe ya da daha büyük bir elektrot elektroporasyona alanını artırmak için kullanılabilir arasında enjeksiyon alanından geçer edilebilir. </li><li> Elektroporasyon hemen sonra dikkatlice yavrularından jel temizlemek ve yaklaşık 5 dakika için bir ısı lambası altına yerleştirin. </li><li> Yavrular akut siyanoz nedeniyle elektroporasyon sonra dakika içinde kendi doğal kırmızımsı-pembe renk kaybedersiniz. Kafeslerine onları dönmeden önce, doğal renk ve normal hareketinin başlatılması kurtarma için yavrular gözlemleyin. </li><li> O geri yuvasına yavrular getiriyor ve onları tımar başlar olmadığını gözlemleyerek anne ile yeniden sosyalleşmesini sağlamak. O agresif olursa, emin yavrular jel kalıntıları var ve yavrular için koku aktarmak için yatak bazı onları inkübe yok emin olun. </li></ol> 4.. Üstün kolikül Hedefleme için Değişiklikler Hedefleme: <ol><li> Inject üstün korteks olarak aynı şekilde kollikulus ama hedef bölge sadece posterior ve lambda lateral ve kabaca orta hatta yatıyor unutmayın (Şekil 3A ve 3B). Başarılı enjeksiyonları ile, plazmid karışımı doğal üstün kollikulusun hatlarını doldurur. Enjeksiyonlar başarılı bir şekilde elde edildikten sonra, hayvanlar elektroporasyon için hazırdır. </li></ol> Elektroporasyon: <ol><li> Çok benzer bir şekilde, üstün colliculus enjeksiyonlar için, üstün colliculus yüzeysel bölgesi (Şekil 3C) DNA&#39;nın sürücü, enjekte alan ve göz, burun veya çene etrafında pozitif yüklü prob üzerinde elektrodun negatif yüklü prob yerleştirmek . Bu durumda, elektrot yönlendirme orta hatta bir 25-40 ° açı ile yer almaktadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+historical+perspective+and+future+prospects.">Neural stem cells: historical perspective and future prospects.</a> Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), (2000).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+that+glitters+isn't+gold:+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses.">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li><li>Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginal+zone/layer+I+as+a+novel+niche+for+neurogenesis+and+gliogenesis+in+developing+cerebral+cortex.">The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).</li><li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genetic+targeting+of+pial+surface+neural+progenitors+and+immature+neurons+by+neonatal+electroporation.">Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation.</a> Neural Dev. 7, (2012).</li><li>Ohira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-induced+neurogenesis+of+neocortical+layer+1+progenitor+cells.">Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells.</a> Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).</li><li>Schmechel, D. E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golgi+study+of+radial+glial+cells+in+developing+monkey+telencephalon:+morphogenesis+and+transformation+into+astrocytes.">A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes.</a> Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).</li><li>Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+of+the+pial+basement+membrane+in+cortical+histogenesis.">A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis.</a> J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).</li><li>Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+neurons+of+the+human+cerebral+cortex.">The first neurons of the human cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).</li><li>Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidirectional+and+multizonal+tangential+migration+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex.</a> Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).</li><li>Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+migratory+coordinates+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+mouse+cortex.">Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex.</a> J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).</li><li>Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+route+of+tangentially+migrating+neurons+in+the+developing+neocortical+intermediate+zone.">Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone.</a> J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).</li><li>Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+cortical+layer+1.">The yin and yang of cortical layer 1.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).</li><li>Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+two+new+cortical+interneuronal+circuits.">The organization of two new cortical interneuronal circuits.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).</li><li>Endo, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+different+AMPA-type+glutamate+receptors+in+morphologically+identified+neurons+in+rat+superficial+superior+colliculus.">Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus.</a> Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).</li><li>Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinhibition+in+rat+superior+colliculus+mediated+by+GABAc+receptors.">Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors.</a> J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).</li><li>Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+waves+coordinate+patterned+activity+throughout+the+developing+visual+system.">Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system.</a> Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li><li>Boller, M., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+GABA(A)+and+GABA(C)+receptor+function+in+the+mammalian+superior+colliculus.">Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus.</a> Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex.">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).</li><li>De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+circuit+connectivity+in+postmitotic+neocortical+neurons.">In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), (2008).</li><li>Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis.">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat Commun. 3, (2012).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition.">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+monomeric+blue+fluorescent+protein+with+the+high+chemical+stability+of+the+chromophore.">An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Pial yüzey progenitörlerinin başarılı elektroporasyon için en önemli bir yönü vardır: 1) pial yüzeyine plasmid karışımı hedeflenmesi; 2) enjeksiyon sahasında hematom üretilmesini önlemek; ve 3) Ortabeyin elektroporasyon ile ilişkili mortalite kaçınarak. Uygun Pial yüzeyi hedef Pial yüzeyin nüfuz etmesini önlemek için kafatası ölçülü ve dikkatli bir delik açarak gerçekleştirilir. Hafifçe doku (yani hızlı yeşil deri ve bağ dokusu kafatası üzeri...

Sinir kök ve projenitör hücreler, memeli merkezi sinir sistemi 1, 2 mevcut bulunur. Onların doğası ve beyin ve omurilik ventriküler bölgelerini çevreleyen embriyonik ve yetişkin germinal bölgelerinde özellikleri de yoğun geçen on yılda 1-3 belgelenmiştir. Büyük ölçüde, bu nedeniyle böyle floxed alellerin veya 4 izleme retroviral soy sinir sistemi belirli Kre rekombinasyon olarak giderek kesin genetik araçlarının geliştirilmesi olmuştur. Ancak, bir ata bölge Pial yüzey atası sadece son zamanlarda herhangi bir detay 5-7 tarif edilmiş bölge-vardır ve bekliyor kapsamlı inceleme. Beynin Pial yüzeyi beynin yüzeyine ve çevredeki menenjlerin 8 arasında arabirim olarak tanımlanır. Daha sonra geliştirme, nöroepitel ve sırasında, radyal glial uç ayaklar bu yüzeye 9,10 takmak. Köknar Bazıinsan beyninin nöronal ve birçok mitoz st nöronların bu bölgede 11 &#39;de görülmektedir. Daha sonra, embriyonik nöron sırasında, kortikal nöronlar ara bölge ve subventricular bölge 12-14 kendi göç yolları ek olarak, Pial bölge hareket bilinmektedir. Bu dönemde, kök hücreleri, bu bölgesinden kültürlenebilir ve nöro-ve gliogenesis 5 aktif sitesi olarak görüntülenir. Erişkin beyinde, o internöron hipoksik meydan 7 aşağıdaki Pial yüzey progenitörlerinden doğmuş olabilir bildirilmiştir. Ancak, embriyonik ve postnatal gelişim sırasında genensis için onun için bu bölgenin katkısı nedeniyle özellikle bu bölgeyi 6 araştıran zorluk kısmen belirsiz kalmıştır. Üstün colliculus içinde ve serebral korteks, yüzeysel (ya da kortekste tabaka I) internöron temel uyarıcı nöron popülasyonlarının devre çıkış modüle eden ve bu nedenle signific katkıdaBu yapıların işlevi antly. Özellikle, tabaka 1 internöron kortikal sütun 15,16 yüzeyel ve derin tabakalara göre kapsamlı bağlantı verilen serebral korteksin üst katmanlar boyunca nöronların ateş düzenleyen Başbakan konumda bulunmaktadır. Benzer bir şekilde, yatay internöron nispeten geniş bir alan üzerinde, kortikal ve retinal elyaf, proje uyarıcı girdi almak ve uzak görsel uyaranlara yanıt 17,18 nöron popülasyonlarının inhibisyonunun aracılık ettiği iddia edilmektedir. Ayrıca, kendi morfoloji gelişmekte görme sistemi 19 desenli dalga aktivitesi potansiyel bir rol oynamak için çok uygundur. İlginçtir, interneuron gelişme ve olgunlaşma doğumdan büyük ölçüde olur. Bundan başka, bu olgunlaşma süreci nöronal aktivite ile düzenlenir bulunmuştur ve bu nedenle de fonksiyonu devre 20,21 yaşam boyu sonuçlarıyla gelişim plastisite bir substrattır. Özellikle, no özel promoterler transgenik bu hücreleri hedef olabilir tarif edilmiştir. Bölme progenitörler retrovirüs 7 ile hedef olabilir, ancak virüs üretimi, zaman alıcıdır ve hücre transdüksiyonu için gerekli olan yüksek titrelerini üretmek üzere beceri gerektirir. Bu sinir progenitörlerin 4, 22, 23, içinde sinyal yollarının hızlı ve etkili genetik sorgulama için izin verdiği Elektroporasyon nörolojik gelişim çalışmada bir rönesans yol açmıştır. Elektroporasyon, tek yönlü olarak ventriküller 4, 22, 23, çevreleyen çoğalan progenitörlerde DNA sürmek için başının dış elektrik darbeleri teslimi takiben plazmid DNA enjeksiyonu, içerir. Elektroporasyon plasmid 24 transgenlerin sentezlenmesi için hücre döngüsüne ait M fazı boyunca hücrelerin geçişini gerekli görünmektedir. Özel olarak, bulunmuştur ki, sadeceplasmidlerin elektroporasyon 8 saat içinde M faz geçen hücreler, ventriküler duvarın 24 ~ 160 um olan tüm hücrelere etkin teslimat rağmen transgenleri ifade edecektir. Nükleer geçirgenliği neden olan kimyasal maddeler postmitotik hücreleri 25 plasmidin sentezlenmesinin uyarılması gibi bu, epizomal plazmidlerin nükleer erişimi için de çekirdek zarı arıza için ihtiyaç nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Başlangıçta embriyo 22 istihdam, elektroporasyon daha sonra 26, 27, doğum sonrası beyin kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Son zamanlarda, yüzey Pial progenitörlerin 6 genetik manipülasyonu kullanmak için elektroporasyon adapte edilmiştir. Bundan başka, bu yaklaşımı kullanarak progenitörlerinin iki ayrı soylar bu bölge-internöronal ve astrositik 6 görünüşe olduğunu göstermiştir. Bu protokol sorgulama için bu hücreleri hedef için basit, hızlı ve güçlü bir şekilde ayrıntılarıBu hücrelerin gelişim düzenleyici mekanizmalar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

Son birkaç yılda Pial yüzey yaralanma sonrası da dahil olmak üzere, embriyonik perinatal ve yetişkin nöro-ve gliogenesis sırasında önemi bir germinal niş olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte, genetik olarak bu hücrelerin popülasyonları sorgulama ve soy izleme için yöntemler, özgünlüğü ya da zaman virüs üretimini tüketen olmaması nedeniyle sınırlı olmuştu. Böylece, bu bölgede ilerleme bu konumu soruşturmaların sadece bir avuç nispeten yavaş olmuştur. Elektroporasyon embriyo nöral kök hücre özelliklerini incelemek için bir on yıl için kullanılan ve son zamanlarda doğum sonrası beyinde olmuştur. İşte biz, bir uyarlanmış elektroporasyon yaklaşıma dayalı pial yüzey atalarıdır genetik manipülasyon için verimli, hızlı ve basit bir teknik açıklar. Pial yüzey elektroporasyon dolayısıyla bu hücrelerin incelenmesi için bir zaman tasarrufu ve ekonomik yaklaşımı temsil eden, bu atalarıdır uyduruk genetik etiketleme ve manipülasyon için izin verir.

Hücreleri çoğunlukla progenitorlar-ya da pial yüzeyinin yakınındaki 6 plazmid DNA&#39;nın ifade Pial yüzey elektroporasyon ile sonuçlanır. Daha spesifik olarak, elektrotların oryantasyonu plasmid hareket ve daha sonra ifade yönünü dikte kritiktir. Bu nedenle, çift elektrot yapılandırmalarında, plazmid negatif ve pozitif elektrot arasında yaklaşık düz bir vektör içinde yönlendirilir. Negatif kutup enjeksiyon yerinde üzerine yerleştirilir ve pozitif kutup negatif kutbuna ventral oldu?...

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Pial Surface Electroporation at JoVE.com

Neonatal Pial Surface Electroporation

Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Görüntüleme.  Cedars-Sinai Medical Center.  Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için. 