Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibe GM086822 Enstitüleri tarafından finanse edildi. Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Washington Nanoteknoloji Kullanıcı Tesisi Üniv (NTUF)) ve uzman teknik yardım için Andrea Slade (Bruker AXS). DNA AFM görüntüleme Üniversitesi yapıldı. Washington NTUF, Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı üyesi. 2xGal4 2xGRE-luciferease plazmid lütfen Dr. Keith Yamamoto (California Üniv, San Francisco) laboratuvar tarafından sağlanmıştır.

1. Yabancı maddelerden arındırılmış yansıması DNA ve protein örneklerinin hazırlanması <ol><li> Görüntülü ve yer olarak uygun bir sulu tampon biyomoleküllerin izole edin. Görüntülenecek Proteinler kullanarak saflaştırılmış sıvı kromatografi 6 olabilir, immunoadsorption antikor ve pelet 1,2 kaldırılması, ya da Profinity tam bir arınma ve etiketini çıkarma 7 (Şekil 2A) izledi . Miniprep arıtma (Şekil 2B) tarafından görüntülendi DNA molekülleri izole edin. </li><li> SDS-PAGE ve western blot kullanarak görüntülü protein örneklerinin bileşimi ve saflığı onaylayın. DNA dizisi ve saflık bir kısıtlama sindirmek ve agaroz jel elektroforezi tamamlayarak onaylayın. </li><li> Mika için numune bağlılığı teşvik etmek için bir AFM adsorpsiyon tampon örnekler inkübe edin. Protein örnekleri için, 10 mM HEPES tamponu kullanılıyor olabilir. Ek düşük iyonik kuvvet tuzları veya diğer kofaktör de eklenebilir. DNA örnekleri, kalsiyum katyon (örneğin Mg 2 + veya Ni 2 +) mika yüzeye adsorbsiyon teşvik etmek. DNA için uygun Mg 2 + içeren tampon 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Alternatif bir Ni 2 + tampon, 10 mM Hepes, pH 6.8, 10 mM NiCl 2 . </li><li> Adsorpsiyon tampon 5 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon için örnek seyreltilir. Hafifçe karıştırın. Mikroskop hazırlanan edilirken buz üzerinde saklayın. </li></ol> 2. Montaj AFM prob <ol><li> Sıvı hücre prob tutucu ilgili konsol yükleme yerleştirme istasyonu üzerine yerleştirin. </li><li> Görüntüleme için kullanılan keskin nitrür kolunu (SNL) prob uzun, kalın konsol (&#39;B&#39; konsol olarak anılacaktır) bulun. Dikkatle ucu dik kalmasını sağlayarak, sıvı hücre prob tutucu transfer. Teknik not: prob transit ise Extreme bakımı, herhangi bir yükseklikte bırakarak olarak ödenmelidir konsol veya ucu zarar veya zarar verebilir. Microlever SNL (MSNL) prob SNL prob alternatif olarak kullanılıyor olabilir. </li><li> Yerleştirme istasyonu prob tutucu çıkarın ve konsol sağlam ve düzgün bir şekilde sıvı hücre prob tutucu oturduğundan emin olmak için bir ışık mikroskop altında incelenmesi. </li><li> Dikkatle tırtıllı kafa vidalı kelepçe sıkma aleti dovetail montaj AFM baş kaldırmak. Teknik not: AFM baş işlenirken çok titizlikle, hatta kısa bir mesafe (kurtağzı montaj doğru şekilde oturduğundan değilse örneğin) bırakarak, ödenmesi gereken önemli hasara neden olabilir. </li><li> AFM başını ters çevirin ve dört iğne üzerine sıvı hücre prob tutucu AFM kafa tabanına sıkıca itin. AFM kafası alet dovetail montaj içine dikkatlice dönün. Cihazın içine AFM baş tutturmak için tırtıllı kafa vidalı kelepçe bırakın. </li></ol> 3. Konsol ucu Konumlandırılması lazer hizalama ve fotodetektör ayarlayarak <ol><li> AFM enstrüman yazılımı kullanarak, onboard ışık mikroskobu kollarını hareket ettirerek konsol ucu bulun. Gerekirse uç kimlik geliştirmek için mikroskop aydınlatma ayarlayın. Cihaz yazılımı görüntülenen crosshair&#39;i yakın içine konsol ucu sonuna getirin. </li><li> Konsol ucu yazılım optik kontrol yukarı ve aşağı okları ayarlayarak odak noktası haline getirin. Optik ayarlama, yavaş (S) veya orta (M) hız kullanın. </li><li> Lazer, lazer ayarlama düğmeleri kullanarak konsol ucu aynı hizaya getirin. Kırmızı lazer nokta, beyaz aydınlatma spot içinde ayar düğmeleri kadar hareket ettirin. Lazer konsol ucu üzerine getirilinceye kadar zig-zag desen kullanarak konsol kol boyunca iz. Düzgün hizalanmış, güçlü bir yansıması nokta AFM başın ön penceresinde görünecektir. </li><li> Merkezi AFM kafasına fotodetektör düğmeleri ayarlayarak fotodetektör. Bu cihaz yazılım fotodetektör ekran crosshair&#39;i lazer nokta uyumlu hale getirecektir. Gözlenen sinyal toplamı yaklaşık 4-6 olmalıdır. </li></ol> 4. Konumlandırma AFM baş ve ayar konsol <ol><li> AFM tutucu plakası tepesinde manyetize numune tutucu bir metal AFM örnek diske bağlı mika taze bölünmüş bir yaprak yerleştirin. Bu kurulum öncesinde görüntüleme Adım 1 hazırlanan DNA veya protein örnek AFM kafa pozisyonu kullanılacaktır. <ol><li> Teknik not: manyetize olan numune tutucu ve sıvı hücre prob tutucu, mekanizmalar ve prob sahipleri tespit diğer örnek daha kalındır. Mika-numune tutucu montaj ve AFM kafa arasında yeterli boşluk varsa, cihaz yazılımı birkaç kez çekilme simgesini seçerek AFM başını yukarı hareket ettirin. </li></ol></li><li> Örnek disk ilk görüntüleme için konumlandırılmış böylece AFM tutucu plakası döndürün. Mika substrat AFM başlık altında merkezli olduğundan emin olun. </li><li> Doğru AFM baş aşağı hareket ettirincihaz yazılım odak yüzey kontrolü kullanarak mika örnek disk yüzeyi. Z motor orta (M) hızını seçin ve yüzeye doğru devam AFM baş mika üzerinde yaklaşık 2 mm kadar. Şu anda, prob ve yüzey (ucu çökmesini olarak anılacaktır) arasında ani temastan kaçınmak için yavaş (S) Z motor hızı kullanarak geçin. </li><li> Mika yüzey veya ucu yansıması farklı özellikler Odak kadar prob mika substrat yüzeyine yakın taşımak için devam edin. Cihazın yazılımı simgesi: yüzey ve &quot;odak noktası&quot; kullanarak ucu yansıması odak düzlemleri arasında geçiş. </li><li> Cihazın yazılımı ayar simgesini seçin ve konsol ayarlamak. Önerilir SNL ve MSNL konsol probları rezonans frekansı 20-60 kHz. Ofset% 5 tepe seçin. Teknik not: Yeterli konsol ayarı yeterli örnek görüntüleme için çok önemlidir. </li></ol> 5. Görüntüleme mika örnek yüzey <ol><li> Mika yüzeye prob meşgul. İlk tarama boyutu 10 mm ve 1 Hz tarama hızı ayarlayın. İntegral kazanç ve oransal kazanç başlangıçta sırasıyla 0.2 ve 0.4 olarak ayarlanmış olabilir. Iz var ve tekrarlanırken taramaları kabaca örtüştüğü için gerektiği gibi kazanımlar ayarlayın. Genlik set azaltılması, sonda ve mika arasındaki etkileşimi artırmak ve katılımı sağlamak. </li><li> 10 mikron alanında tam bir tarama görüntüler yakalayın. 1, büyüklükleri 5 ila tarama, ve 0.5 mikron ve her bir alanın tam görüntü yakalamak azaltın. Gerekli kazanç ve tarama hızı ayarlayın. Mika yüzey görüntülerini yakalama, DNA ve protein içeren örnekler için karşılaştırma için bir temel sağlar. </li><li> Cihazın yazılımı boşa simgesine tek bir tıklama ile prob ayırın. </li></ol> 6. Görüntüleme biyomoleküllerin <ol><li> Adım 1 hazırlanan DNA veya protein örnek hafifçe karıştırın ve görüntülü mika yüzeye yüklemek için hazırlamak. Taze adsorpsiyon tampon 45 ul (son örnek konsantrasyon = 0.5 mg / ml) ile hazırlanan örnek 5 ul karıştırın. </li><li> Mika yüzeye direkt olarak 0.5 mikrogram / ml biyomolekülün içeren bir çözüm dikkatlice 50 ul ekleyin. Bu prob veya AFM kafa hareket ettirmeden yapın ve örnek çözümü sağlamak (ancak pipetlemeyin ucu) prob ile temas yapar. </li><li> Pause 5 dakika örnek biyomoleküllerin mika yüzey uymak için izin vermek. </li><li> 5 dakika, pipetlemeyin sıvı hücre prob tutucu içine adsorpsiyon tampon ek 50-100 ul bitiminde prob AFM başkanı veya pipetlemeyin ucu ile mika dokunmayın dikkatli olmak. Bu formu ve bir menisküs AFM sıvı dokunarak modu görüntüleme için izin. Şekil 3 sıvı hücre, konsol, örnek, numune tutucu ve menisküs son düzenleme gösterir. </li><li> Fotodetektör yeniden ayarlayınız ve gerekli olarak konsol için lazer yeniden hizalayın. Teknik not: prob ucu ve lazer hizalama incelemekte prob tutucu örnek tampon ekleyerek kaynaklanan kırınım nedeniyle karmaşıktır. Elle gerekirse, konsol retune. </li><li> Cihazın yazılımını kullanarak prob yeniden meşgul. Dikey saptırma, integral kazanç ve gerektiğinde oransal kazanç ayarlayın. Bu mika bölümü hemen önce örnek ve yakalama görüntüleri ekleyerek taranan yeniden görüntüleme süreci başlayacaktır. </li><li> Ilgi alanları tanımlamak için (500 nm-10 mikron) tarama boyutu artırın. Zoom-in ve görüntü çözünürlüğü artırmak için 0.5 Hz tarama hızı azaltmak </li><li> Görüntüleme tamamlandıktan sonra, cihaz yazılımı simgesini çekilme birkaç kez seçilmesi prob boşa. AFM demontaj sıvı hücre veya numune disk önce baş ve örnek disk arasında yeterli mesafe olun. </li><li> Iyice artık adsorpsiyon tampon buharlaşır olarak oluşan tuz kristalleri önlemek için, saf su ile sıvı hücre prob tutucu ve örnek disk durulayın. Basınçlı hava ile kurutun. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: AFM görüntüleri örnek olarak Şekil 4&#39;te sunulmaktadır . Mika substrat (A) DNA ve protein adsorbe hangi üzerine moleküler düz bir yüzey sağlar. Görüntüleme mika önce biyomolekülün örnekleri görüntüleme gürültü bir negatif kontrol ve değerlendirme sağlar. Ayrıca konsol düzgün bir şekilde ayarlanmıştır ve sonraki örnek görüntüleme başarılı olacağına güvence düzeyi sağlar. Çift iplikli plazmid DNA (B, D), varsayımsal olarak supercoiled, asimetrik görünüm ve üniforma önceden normaldi mika substrat üzerine yatırılması ile kolayca tanımlanır. Sağduyulu parçacık boyutları (C, E) Protein kompleksleri de mika substrat benzersiz ayırt edilebilir. Partikül büyüklüğü farklılıkları örnek heterojenite gösterir ve protein kompleksi stokiyometri veya biyokimyasal aktivite yaklaştırmak için yararlı olabilir. Yanlısı genel çapraz şekli ve tutarlı bir yönelimPanel C görülen protein parçacıkları, proteinler expectedly mika substrat üzerinde rastgele bir moda odaklı olduğu gibi bir görüntüleme eserdir. Gözlenen artifakı Olası nedenleri fiziksel bir ucu anormalliği ya da çok hızlı bir tarama hızı AFM görüntüleme. Ucu konvolüsyon (Şekil 1B gösterilen) mutlak uzunluk ölçü hesaplamaları engellerken, x ve y eksenleri, yükseklik ölçümü (z ekseni) ve bağıl x ve y değerleri görüntülü biyomoleküllerin biyofiziksel özellikleri tahmin etmek için yine de faydalı olabilir. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: modu atomik kuvvet mikroskobu (AFM) vurma şematik sunumu. A, mikroskop. Konsol, sonunda mika substratın yüzey üzerinde tarar gibi dolaşacaktır ve aşağı keskin bir ucu biyomoleküler kompleksleri emilir. Tarayıcı x ve y doğrultularında hareket ettikçe, bir lazer ışını, üzerine oturtulmuş biyomoleküler kompleksleri üzerinden geçerken ucu hareket dikey (z) mesafe harita bir pozisyon duyarlı fotodiyot dedektörü üzerine konsol arka yansır mika. B. ucu konvolüsyon neden x ve y yönlerinde görüntü Distorsiyon. Geleneksel silisyum nitrür ucu nominal yarıçapı Görüntülenecek parçacıklar daha büyük, ve ucu temas örnek kenarından yüzeye erişir. İpucu konvolüsyon görüntülü x ve y yönünde daha büyük görünmesini zerrelerden değil z yönünde sonuçlanır. Bu etki, küçük bir nominal uç yarıçaplı ipuçları kullanımı minimize edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2: İllüstrasyon immunoadsorbed protein ve DNA numune hazırlama. Immunoadsorbed GR A, Yayın monoklonal antikor (mAb) protein A-sepharose (PAS) pelet • hsp70 protein kompleksi. MAb epitopu içeren bir peptid ile immunopellet kuluçka karmaşık supernatant ve AFM tarafından görüntülenmiştir alınacak izin, pelet GR • hsp70 protein kompleksi serbest kolaylaştıracaktır. B, AFM görüntüleme için DNA hazırlanması, kalsiyum katyon adsorpsiyon tampon kullanımını gerektirir. Kalsiyum katyonu mika substrat için DNA yakınlığı artar. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3: AFM baş, sıvı hücre prob tutucu, örnek, numune tutucu ve tampon menisküs Final düzenleme. A, Bakım, mika yüzey üzerine pipetlemeyin ucu ve AFM baş, sıvı arama, ve mika yüzeyler arasındaki fiziksel temas önlemek için örnek ve ek tampon yatırma alınmalıdır. B, A. tampon menisküs sıvı hücre prob tutucu örnek diskten yayılan Büyütme. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4: mika substrat Atomik kuvvet mikrograflar (A) tampon çözeltisi 2xGal4-2xGRE luciferease plazmid DNA 8 (B, D) ve GR • hsp70 protein kompleksleri (C, E). Mika, DNA ve protein görselleştirme ile karşılaştırmak için bir kontrol görüntü olarak hizmet vermektedir. GR • hsp70 protein kompleksleri ile astarlanmalıdır mAb rakip antikor (Şekil 2A gösterilen) ile antikor-boncuk pelet serbest hsp70 ve GR immunoadsorption tarafından hazırlanmıştır. DNA geleneksel plazmid miniprep tarafından hazırlanmıştır. Paneller A, B, ve C eşdeğer bir büyütme (ölçek bar = 200 nm), Paneller D ve E (ölçek bar = 40 nm).

<ol>
	<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein.">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li><li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions:+a+theoretical+and+experimental+study.">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li><li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nick-sensing+DNA+3'-repair+enzyme+from+Arabidopsis.">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification.">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li><li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release.">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li><li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ.">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li><li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging.">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels.">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery.">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li></ol>

AFM, sulu ve yakın-fizyolojik tamponlu çözümleri gerçek zamanlı olarak görüntüleme bireysel kaplanmamış biyomoleküllerin yapabilen eşsiz bir mikroskopik tekniğe sağlar. Bu görünüm için bireysel proteinler ve DNA molekülleri, yanı sıra multiprotein kompleksleri ve protein-DNA kompleksleri izin verir. AFM ile Görüntüleme makromoleküler parçacıklar değerlendirmek için örnek homojenlik ve gözlenen parçacıkları oluşturan bileşenlerin fiziksel olarak düzenleme tanımlamak için yararlı olabilir. Bu yaklaşım, bireysel makromoleküler parçacıkları gözlemleyerek immunoprecipitation deneyleri, poliakrilamid jel elektroforezi ve faiz 10 3 -10 11 ayrı biyomoleküler kompleksleri temsil eden önemli bir özetleyici veri sağlayan boyutu dışlanma kolon kromatografisi, gibi geleneksel biyokimyasal teknikleri, faydalı bir yardımcı olabilir bir örnek. Multiprotein karmaşık stokiyometri, biyomoleküler etkileşimleri ve kofaktör gereksinimleri üzerinde yapılan araştırmalar, tüm AFM kullanılarak incelenmiştir olabilir. Burada sunulan yöntem, özel ilgi biyofiziksel soruları karşılamak için adapte edilebilir. Örneğin, tampon değişimi yapabilen bir sıvı hücre prob tutucu kullanarak, kofaktör gereksinimleri protein kompleksi oluşumu için tahlil etmek mümkün olabilir. Hatta yakın gerçek zamanlı ve görüntülü sırasında DNA-protein meclisleri kuruldu ve ayrışmış olabilir. Hipotez bağlayıcı protein ile karıştırılarak özel ilgi dizileri (olası bir yanıt elemanları veya yeni protein bağlayıcı dizisi gibi), DNA ve moleküller arası etkileşimlerin doğrudan kanıt görüntülü olabilir. Kuru örnekleri numune sulu çözeltiler ve lineer DNA standları ve kapalı daire DNA plazmid bu şekilde 3,9 imaged her ikisi de yerine kullanılmaktadır Vurma modunda AFM görüntüleme önemli ölçüde daha az karmaşık. Burada sunulan yöntem, daha fizyolojik bir görüntüleme ortamı sağlamak amacıyla tamponlu çözümler örnekleri kullanır. Diğer göze çarpan görüntüleme proteinlerin yöntemleri alanında kızılötesi mikroskopi 10 yakınlarındaki de dahil olmak üzere, göz önüne alınmalıdır. AFM ile sanatçılı immunoadsorption tamamlayıcı kullanımı köklü biyokimyasal teknikler kullanarak, sayısız protein kompleksleri hazırlamak için bir fırsat sağlar ve daha sonra tahliye immunoadsorbing antikor-boncuk pelet onları görselleştirmek. Örneğin, karmaşık bir boyut ve stoichiometries tahmin etmek için bu yaklaşım kullanarak immunoadsorbed GR 2 hsp70 moleküler şaperon protein 1 dynein motor proteinin yanı sıra, dernek için test edilmiştir . Partikül büyüklüğü ve biyofizik özellikleri (örneğin, katılık) AFM görüntülü örnekleri 11,12 gözlenen biyomoleküllerin kimlik ascertaining yararlı olmuştur. Bu hedef biyomolekülün varsa, hedef ve neden bir tanecik boyutunu artırmak bağlamak istiyorsunuz etkileşim biyomolekülün (örneğin bir ligand veya monoklonal antikor), ek biyomolekülün kimliğini onaylamak için de mümkündür.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Boyut 3100 </td><td> Bruker </td><td> Boyut 3100 </td></tr><tr><td> Boyut Akışkan Hücresi </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Keskin nitrür kolunu (SNL) silisyum nitrür AFM prob </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever keskin nitrür kolu (MSNL) silisyum nitrür AFM prob </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> NanoScope AFM enstrüman yazılımı </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Metal AFM örnek diskler </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Sınıf V1 Mika diskler, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), bireysel protein, DNA molekülleri, protein-protein kompleksleri, ve DNA-protein kompleksleri görselleştirmek için sağlar. Nanometreden mikrometre arasında değişen traversler görüntü alanlarında, herhangi bir noktada substrat yüzeyinde dinlenme makromoleküllerin yükseklik ölçme nano ölçekli bir prob, mikroskop konsol ucunda. Elektrostatik kuvvetler gevşek rastgele yönlerde yüzeye tutunur ve görüntüleme izni, proteinler, lipidler, ve nükleik asitlerin neden olur. Oluşturulan veriler, makromoleküllerin üç boyutlu parçacıklar ayrık boyutları (Şekil 1) 1,2 olarak çözmek bir topografik harita, benzerler . Vurma modunda AFM, DNA ve proteinler gibi nispeten yumuşak biyomalzemeler görüntüleme izin konsol tekrarlanan bir salınım içerir. AFM diğer nano ölçekli mikroskopi teknikleri üzerinde kayda değer faydalar bireysel yakın fizyolojik tamponlu koşulları dahil olmak üzere gerçek-zamanlı olarak, boyama veya kaplama yansıması için örnek olmadan sulu tamponlar, proteinler ve makromoleküler kompleksleri görselleştirmek için göreceli bir adaptasyon. Burada sunulan DNA ve çözüm tamponlu bir immunoadsorbed transkripsiyon faktörü (yani glukokortikoid reseptör, GR) (Şekil 2) görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. Immunoadsorbed proteinler ve protein kompleksleri antikor epitop ve sonra görüntülü (Şekil 2A) ile rekabet immunoadsorbing antikor-boncuk pelet ayrılabilir. Bu görüntüleme için önce ilgi biyomoleküllerin biyokimyasal manipülasyon için izin verir. Bir kere, saflaştırılmış DNA ve proteinler karışık olabilir ve ortaya çıkan etkileşim kompleksi de görüntülü olabilir. Mika DNA bağlayıcı Ni 2 gibi 3, kalsiyum katyon gerektirir + veya Mg 2 +, protein aktivitesi korumak henüz örnek tamponlar eklenebilir. Benzer bir yaklaşım kullanarak AFM, bireysel DNA ipliklerini bağlı RNA polimeraz 4 ve onarım enzimi 5, de dahil olmak üzere bireysel enzimler, görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu deneyler, protein-protein ve DNA-protein biyofiziksel etkileşimlerin moleküler düzeyde yer alan önemli bir içgörü sağlar. AFM Görüntüleme bireysel makromoleküler parçacıklar, parçacık homojenlik belirlemek için ve görüntülü parçacıkları oluşturan bileşenlerin fiziksel olarak düzenleme belirlemek için yararlı olabilir. Bu yöntem GR bağlayabilirsiniz GR-hastabakıcı protein kompleksleri 1,2 ve DNA ipliklerini görünüm için geliştirilen iken, çeşitli kaynaklardan görüntüleme DNA ve protein örneklerinin geniş uygulanan olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

visualization-recombinant-dna-protein-complexes-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K Görüntüleme.  Seattle University. Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Video: Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Biyomühendislik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Erken Osteoartrit tespit etmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu Uygulaması

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...