Hücre ve dokuların biyomekanik özellikleri işlevlerini ve canlılıklarını düzenler. AFM elastikiyet ölçümleri dayalı hücresel düzeyde osteoartrit erken nicel sağlar. AFM, numuneye zarar vermeden ve yüksek çözünürlük, güvenilirlik ve hassasiyetle ölçümlerin hücresel düzeyde kazanılmasını sağlar.
Biyomekanik özellik değişiklikleri osteoartrit erken ortaya çıkar. Eklem kıkırdağının lokal elastikiyetinin ölçülmesi, lokal doku dejenerasyonunun derecesi hakkında geçerli sonuçlar alabilmektedir. İnsan diz eklemi içindeki dejeneratif değişiklikleri değerlendirmek için, önce eklem kıkırdağının subkondral kemikten bir bütün olarak kesilmesi için neşter kullanın ve kıkırdak örneğini Cryotome cihazında düşük sıcaklık altında donan cryotome toputamına suda çözünür katıştırma ortamına yerleştirin.
Örnek dondurulduğunda, eklem kıkırdağının en üst tabakasından 35 mikrometre kalınlığında doku kesiti elde etmek için standart bir Cryotome kullanın ve her bölümü tek tek cam slaytlara toplayın. Tüm bölümler elde edildiğinde, suda çözünen gömme ortamını çıkarmak için numuneleri yıkama başına beş dakika boyunca taze PBS'de üç kez durulayın. Yıkamadan ilk slaytı çıkarın.
Bundan sonra, tek tek AFM uyumlu Petri kaplarına kesit başına iki ila üç damla biyouyumlu numune tutkalı ekleyin. Numuneden fazla çözeltiyi çıkarın ve kurutulmuş bölümün kenarlarını tutkal noktalarına hafifçe bastırın. İki dakika sonra, Leibovitz'in L-15 ortamı ile l-glutamin olmadan bağlanmış dokuları dikkatlice kapatın ve numuneler analiz edilene kadar bulaşıkları hücre kültürü kuvöze yerleştirin.
AFM cihazını hazırlamak için, AFM tutucudaki sıvı bir ortamda ölçüm yapmak için bir gaz bloğunu üst yüzeyin tutucuya paralel olduğunu ayarlayın ve seçilen kantili cam bloğun yüzeyine dikkatlice monte etmek için cımbız kullanın, böylece mikrosferli AFM ucu parlatılmış optik düzlem üzerinde çıkıntı lar. Cam bloktaki kantili stabilize etmek için, metalik yaybloğun oluğuna doğru kaydırın ve yay ile birlikte cantilever'in üst kısmını bağlamak için cımbız kullanın. Cam bloğu afm kafasına dikkatlice yerleştirin ve entegre kilitleme mekanizması yla bloğu sabitleyin.
Ardından AFM kafasını kantilever ile afm cihazına monte edin ve yay sola bakacak şekilde. Numuneyi AFM cihazına monte etmek için, numune Petri kabını AFM numune tutucuya yerleştirin ve Petri kabı ısıtıcısını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Yaklaşık 20 dakika sonra, cihaz yazılımını ve lazer hizalama ve yaklaşım parametre ayar pencereleri açın.
Daha sonra, step motor, lazer ışığı ve CCD kamera açın ve cantilever tamamen orta batırılmış kadar 100 mikrometre adımda kantili düşürmek için step motor fonksiyonu kullanın. Lazeri cantilever'in üzerine yönlendirmek için ayar vidalarını kullanın ve yansıyan ışının fotodedektörün ortasına düşmesi için lazer ışınını ayarlamak için AFM cihaz vidalarını kullanın. Lazer kantili ayarlandıktan sonra, toplam sinyalini bir volt veya yukarıya, yanal ve dikey sapmaları sıfıra yakın ayarlamak için fotodedektörü gerektiği gibi ayarlayın.
Kalibrasyon kuvveti eğrisini elde etmek için, tabloda belirtildiği gibi yaklaşım parametreleri ile bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın. Doku kültürü çanak altına ulaşıldıktan sonra, 100 mikrometre tarafından kantilever geri. Çalışma parametrelerini tabloda belirtildiği şekilde ayarlayın.
Ve bir ölçüm başlatmak ve bir kalibrasyon kuvvet ilerleme mesafesi eğrisi elde etmek için çalıştır'a tıklayın. Kuvvet eğrisi şekilde gösterildiği gibi elde edilir. Kalibrasyon kuvveti uzaklık eğrisinde, geri çekilen eğrinin doğrusal sığdırımı için bölgeyi seçin.
Doğrusal uyum yerine oturtülduktan sonra, değerler yazılım tarafından kaydedilir. Daha sonra ölçümler 37 santigrat derece sıcaklıkta orta düzeyde yapıldığından, fizyolojik koşulları mümkün olduğunca yakından taklit etmek için yazılımdaki sıcaklık değişkenini 37 dereceye ayarlayın. Kıkırdak örnek bölümlerinde konversite desenleri belirlemek için, bulmak ve faz kontrast mikroskop üzerinde osteoartritik diz eklem kıkırdağının belirli hücresel desenleri belirlemek için, sağlıklı doku alanları gösteren tek dizeleri içerebilir, doku dejenerasyonu başlangıcı gösteren çift dizeleri, gelişmiş doku dejenerasyonu belirtileri olan küçük kümeler, ve büyük kümeler, son aşama doku yıkımı göstergesidir.
İstenilen belirli bir desen belirlendikten sonra, perisellüler matris ölçümleri için, kantilever'i hücrelere yakın konumlandırın ve matris türü başına seçilen desen başına iki site ölçer, olası yanlışlıklariçin yeterince büyük bir örnek boyutu da dahil olmak üzere ölçüm alanı başına dokuz kez. Ölçülecek örüntünün hücresel matrisine odaklanın ve bu noktada bilgisayar faresini düzeltin. Ardından, sondaya odaklanın ve sondanın ucunu daha önce bilgisayar oku tarafından düzeltilen noktaya taşıyın.
Hücre dışı matriks ölçümlerini yapmak için, herhangi bir hücresi olmayan bir bölge seçin ve bir geri çekilme nin ardından bir yaklaşım gerçekleştirin, böylece kantilin doku üzerinde 100 mikrometre yukarı konumlandırılması nı sağlayabilir. Ardından, cantilever'in kalibrasyonu yla elde edilen ayar noktası parametresini kullanarak ölçümleri başlatmak için çalıştır'ı tıklatın. Elde edilen verileri işlemek için, AFM aygıtından elde edilen verilerle uyumlu veri işleme yazılımını açın ve kuvvet mesafesi eğrilerini işlemek için yazılımdaki Hearst modelini seçin.
Poisson oranını 0,5'e, uç şeklini küresel olarak ve uç yarıçapını 12,5 mikrometreye ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra sonuçlar döşeyecek ve Young's Modülü yazılım tarafından hesaplanacaktır. Dizeleri çift dizeleri ve küçük büyük kümeler için fizyopatolojik model boyunca, hem hücre dışı hem de perisellüler matriks elastik modüler dizeleri ve çift dizeleri arasında dışında her desen değişikliği arasında önemli ölçüde azalır.
Buna ek olarak, hücre dışı-perisellüler matriks oranı önemli ölçüde değişmezken, hücre dışı ve perisellüler matrisler arasındaki mutlak elastikiyet farklılıklarında belirgin bir azalma gözlenmektedir. Elastikiyet değerleri girinti derinliği veya kantilever uç özellikleri gibi çeşitli koşullara bağlıdır. Bu nedenle AFM, aynı deneysel kurulumdaki farklı koşulları karşılaştırmak için en uygun olandır.
AFM numunenin yerel elastikiyetini ölçtuğu için, hassas ölçümlere izin vermek ve cantilever hasarından kaçınmak için bölümlerin yerinde sabitlenmiş olması gerekir. Doku elastikiyet değişikliklerinden sorumlu süreçleri daha fazla analiz etmek için, ilgi proteinlerin yapısının biyokimyasal nicelifikasyonbatı lekeleri veya ELISA'lar aracılığıyla yapılabilir.
