Bu araştırma NIH hibe ile desteklenmiştir: R21AG042066. Biz ekran yakalama videoları oluştururken katkılarından dolayı Philip Schulz teşekkür etmek istiyorum.

1. Faj Üretim <ol><li> Bir biyogüvenlik kabini tüm faj üretim ve biopanning süreçlerini gerçekleştirin. Üreticinin talimatlarını kullanarak biopanning işlemi için (21 kütüphane Tomlinson I ve J kütüphaneler ve Sheets) farklı kütüphaneden fajlar parçacıkları üretin (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOT: Biz mevcut antikorların çeşitliliğini artırmak için kaydırma işleminde birden çok kütüphaneler kullanın. </li><li> Kısaca, OD 600 kadar 37 ° C&#39;de bir çalkalayıcı üzerinde 2xYT ihtiva eden,% 1 glikoz ve 200 ml ampisilin, 100 ug / ml üç kütüphane kültür bakterileri stokları, 0.4. </li><li> Tomlinson I ve J kütüphanelerin 200 ml ve levhalar kütüphanesi VCSM13 yardımcı faj 8 x 10 11 200 ml km13 yardımcı faj 8 x 10, 11 ekleyin. Çalkalamadan 37 ° C&#39;de 30 dakika için yardımcı fajla kütüphane örnekleri inkübe edin. </li><li> Santrifüj10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de kültürler ve% 0.1 glukoz ile 2xYT 200 ml ampisilin, 100 ug / ml kanamisin ve 50 ug / ml hücre pelletini. </li><li> Çalkalama ile 30 ° C&#39;de kültürlerin O / N inkübe ve daha sonra ertesi gün x g&#39;de 3300, 30 dakika boyunca dönerler. </li><li> Her kütüphaneden yüzer 200 ml 2.5 M NaCI içinde polietilen glikol (PEG) 8000, 50 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edilir. PEG çökelmesinden sonra, 3300 x g&#39;de 30 dakika boyunca tekrar çözüm dönerler. </li><li> Mikrosantrifüj tüplerine hücre peleti (topak boyutuna bağlı olarak) ve transfer için fosfat tampon salin (PBS) içinde 1-2 ml ilave edilir. </li><li> 11,600 x g&#39;de 10 dakika süre ile santrifüje kondu, ara sıra karıştırarak, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca buz üzerinde faj partikülleri inkübe edin. -80 ° C&#39;de süpernatant ve mağaza toplayın. </li><li> Dondurma önce, bir mikrosantrifüj tüpüne üç kütüphane faj partikülleri, küçük bir hacim transferi ve her bir kütüphane titreayrı ayrı konsantrasyonunu belirlemek için TG1 hücreleri kullanılarak. Aşağıda, bir kütüphane için titre işlemi tarif edilmektedir. <ol><li> 0.4 OD 600 TG1 hücreleri büyür. 6 mikrosantrifüj tüpleri PBS 990 ul ekleyin. </li><li> Ilk tüpe faj partiküllerinin 10 ul ekle. Karıştırma işleminden sonra, boru, bir 10 ul kaldırmak ve geri kalan 4 borular 2. tekrarlayın borusuna bu adımı ekleyin. </li><li> 6 tüplere TG1 hücrelerinin 200 ul ilave edin ve bu tüpler altı faj sulandırmaların her birinin 10 ul ekle. Faj parçacıkları 37 ° C&#39;de çalkalama ile 30 dakika boyunca enfekte izin verin. </li><li> Levha ampisilin, 100 ug / ml (LBA) ile agar plakaları, Luria-Bertani şöyle 100 ul hücre. 37 ° C&#39;de O / N inkübe ve daha sonra görünen kolonilerin sayısı kullanılarak pfu / ml belirler. </li></ol></li></ol> 2. Negatif biopanning Süreci NOT: biopanning sürecinde faj çok donma çözülme kaçının. Kimlikeally, bir günde mümkün olduğunca negatif kaydırma adımların birçoğu olarak yürütmek için en iyisidir. Her karşı olumlu ya da olumsuz kaydırma mermi tamamlandıktan sonra herhangi bir aşamada kirlenme durumunda faj bazı kurtarmak için önemlidir hedef. <ol><li> Sığır Serum Albumin karşı Negatif Panning 12 yuvarlar (BSA) <ol><li> 12 immunotubes PBS içinde, 1 mg / ml BSA çözeltisi 4 ml ilave edilir ve 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> (Kenara olumsuz kaydırma işleminin gelecek doğrulama için bu faj karışımı küçük bir miktarını ayarlamak) üç kütüphanelerin her birinden 1 x 10 12 faj partikülleri birleştirin. </li><li> İlk tüp BSA çözüm atın ve herhangi bir bağlanmamış BSA kaldırmak için PBS ile tüpü 2-3 kez yıkayın. </li><li> Bu, ilk boruya birleştirilen faj kütüphaneleri ekleme döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir ve bağlanmamış fajları toplar. </li><li> İkinci immunotube ile adımı 2.1.3 tekrarlayın ve bu i adım 2.1.4 toplanan faj eklemekmmunotube. Adımı yineleyin 2.1.4. </li><li> BSA çözeltisi ve her inkübasyon sonrasında toplanan bağlanmamış faj kalan 10 tüpler adımları yineleyin 2.1.3-2.1.4. </li><li> Tüm BSA faj bağlayıcı kaldırılması AFM kullanmak doğrulamak için. Adımından sonra kırılmış mika bağlı BSA 2.1.7 ayrı ayrı 10 ug / ml aşama 2.1.2 gelen faj 10 ul ve geri kalan faj, 10 ul ekle. AFM sürecinin kısa versiyonu bölüm 8 özetlenmiştir. </li><li> Bu kaydırma işleminin başarısını doğrulamak için her hedefe karşı olumsuz kaydırma sayısız mermi bitirdikten sonra faj küçük miktarda tasarruf önemlidir. </li></ol></li><li> Alfa-sinüklein Çeşitli Formlar karşı Negatif Panning 10 yuvarlar NOT: Bu projede, biz böyle (vb monomer, dimer, trimer) alfa-sinüklein gibi proteinler ve bu yüzden bu fajların herhangi ortadan kaldıracak diğer toplu formları (gol ortadan kaldırmak için bağlanabilen faj kaldırmak istiyorum mümkün olduğunca çok sayıda çapraz-reaktif fajlar). Her iki monomerik ve oligomerik formları negatif kaydırma için mevcut olacak şekilde arıtılmış alfa-sinüklein, en az 7 gün boyunca bir araya izin verin. <ol><li> PBS içinde toplu alfa-sinüklein, 500 ug / ml ile 4 immunotubes ve toplanmış alfa-sinüklein, 100 ug / ml ile 4 immunotubes hazırlamak ve 4 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Ve toplu alfa-sinüklein, 500 ug / ml tüpler birinden solüsyonu atın PBS ile yıkayın ve BSA ile kaydırma negatif 12 turdan sonra toplanan faj kitaplığı ekleyin. </li><li> Döndürücü üzerine, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin tüp ve bağlanmamış fajları toplar. </li><li> Tekrar sonra 500 ug / toplanmış alfa-sinüklein ml ve aşama 2.2.4 sonra her zaman elde bağsız faj kullanılarak toplanmış alfa-sinüklein, 100 ug / ml tüpler kalan borular 2.2.3 ve 2.2.4 adımları tekrarlayın. </li><li> Toplu alfa 500 ug / ml karşı olumsuz kaydırma ilk sonra faj kullanarak adımı yineleyin 2.1.8sinüklein ve alfa-sinüklein 100 ug / ml karşı olumsuz kaydırma sekizinci turdan sonra faj. </li><li> Karşı olumsuz bağlayıcı ortadan kaldırmak için alfa-sinüklein toplu alfa-sinüklein 500 ug / ml iki ekstra immunotubes hazırlamak ve tekrar 2.2.2-2.2.4 adımları. </li></ol></li><li> Sağlıklı İnsan Beyin Dokusu homojenatın karşı Negatif Panning 10 yuvarlar <ol><li> 1x STEN tamponu (50 mM Tris (pH 7.6), 150 mM NaCI, 2 mM EDTA,% 0.2 NP-40,% 0.2 BSA, 20 mM PMSF ve proteaz kokteyli inhibitörü), insan beyin dokusunun 28 ekleyin. 3000 rpm&#39;de 1 dakika için 24,000 rpm&#39;de santrifüj örnekleri homojenize ve supernatant toplanır. </li><li> PBS içinde insan beyin dokusunun 50 ug / ml, 2 ml ve insan beyin dokusunun 10 ug / ml 8 immunotubes 2 immunotubes hazırlamak ve 4 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Insan B için 10 ug / ml ihtiva eden daha sonra, insan beyin dokusunun 50 ug / ml içeren tüpler ile ilk 2.2.3-2.2.5 adımları tekrarlayınalfa-sinüklein karşı olumsuz kaydırma sonra toplanan bağlanmamış faj kullanarak yağmur dokusu. </li><li> 50 ug / insan beyin dokusu ml ve insan beyin dokusuna karşı olumsuz kaydırma onuncu turdan sonra faj karşı olumsuz kaydırma ilk sonra faj kullanarak adımı yineleyin 2.1.8. </li></ol></li><li> Sağlıklı immünopresipite TDP-43 karşı Negatif Panning 8 yuvarlar <ol><li> Nedeniyle, çökeltilir proteinin alt miktarına bölüm 9&#39;da açıklanan protokolünü kullanarak sağlıklı insan beyin dokusu sağlıklı TDP-43 proteini immünopresipitasyon mika kullanılarak negatif kaydırma bu mermi yürütmek. </li><li> Sekiz mika yüzeyleri bölmektedir. </li><li> İlk mika için ~ imüno protein 5 ug / ml, 100 ul ve oda sıcaklığında 5-10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Tween 20 ile% 0.1 PBS (PBST) mika 5 kez yıkayın. </li><li> Sağlıklı beyin dokusuna karşı olumsuz kaydırma sonra faj ~ 100 ul ekleyin ve 5-10 dk inkübeRT. </li><li> Adım 2.4.5 yarıda inkübasyon anda, ikinci mika kullanarak adımı 2.4.3 yürütmek. </li><li> Adım 2.4.5 faj toplayın ve% 0.1 PBST mika 5 kez yıkayın. </li><li> Adım 2.4.6 den mika yıkayın ve 2.4.7 faj ekleyin. </li><li> Faj olumsuz immunoprecipitated protein ile sekiz mika karşı panned kadar tekrarlayın 2.4.9 için 2.4.4 adımları. İlk ve negatif kaydırma sekiz turdan sonra faj kullanarak adımı yineleyin 2.1.7. </li></ol></li><li> FTD immünopresipite TDP-43 Karşı Olumsuz Panning 2 yuvarlar <ol><li> FTD insanların beyinlerinden İmmüno TDP-43 proteini. </li><li> 2 mika yüzeyleri bölmektedir. </li><li> FTB 10 ug / ml TDP-43 mika bir ila 50 ul ekle. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Mika% 0.1 PBST ile 5 kez yıkayın. </li><li> Sağlıklı TDP-43 karşı olumsuz kaydırma sonra toplanan faj 50 ul ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Ilişkisiz fajları toplayın. </li><li> Repeats ikinci mika ve 2.5.6 toplanan bağlanmamış faj ile 2.5.6 için 2.5.3 adımları. </li></ol></li></ol> Immünopresipite TDP-43 ALS Bireylerin gelen karşı 3. Olumlu Panning <ol><li> ALS hastası bireylerin beyinleri gelen immüno TDP-43 proteini. 3 mika yüzeyleri bölmektedir. ALS 10 ug / ml TDP-43 mika bir ila 50 ul ekle. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Mika% 0.1 PBST ile 5 kez yıkayın. </li><li> Sağlıklı TDP-43 mika karşı olumsuz kaydırma sonra toplanan faj 50 ul ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Ilişkisiz fajları toplayın. Ayrıca üç yıkama yöntemleri kullanılarak bağlı fajları toplamak. Ayrı bu kaydırma adımda toplanan tüm fajları tutmak önemlidir. <ol><li> Öncelikle, her bir mika için tripsin 50 ul (PBS içinde 1 mg / ml) ekleyin ve 10 dakika daha fazla inkübe edilir. Çözüm toplayın ve kaydedin. Daha sonra, her bir mika 100 mM trietilamin (TEA), 50 ul ilave edin ve 10 dakika daha fazla inkübe edilir. Coçözelti llect, 1 M Tris-HCI tampon maddesi pH 7.4 ve tasarruf eşit miktarda ilave edin. </li><li> Üçüncü olarak, doğrudan mika, 0.4 OD 600 TG1 50 ul ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. Ayrıca 0.4 OD 600 TG1 3.3.1 100 ul olmak üzere iki taşıma yöntemleri toplanan fajlarından eklemek ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li></ol></li><li> Tekrar ikinci bir mika ile 3.1 adımları. </li><li> 3.3.2 toplanan bağsız faj al. ALS TDP-43 ile ilk mika kullanarak ve ALS TDP-43 ile ikinci mika ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Mika bu ikinci set için 3.3 bütün adımları tekrarlayın. </li><li> LBA plakaları iki ALS TDP-43 mika ve plaka tripsin ile akıtılan fajlarla enfekte TG1 hücreleri birleştirin. TEA için aynı işlemi tekrarlayın ve TG1 üç plakaların toplam iki ALS TDP-43 mika gelen fajları yıkandı. NOT: Çünkü ALS ve FTD hem TDP-43 katılımı, klonların bazı izoleALS TDP-43 karşı pozitif kaydırma iki tur bu hedefe özgü olabilir, ama bazıları da FTD bağlanabilir. Daha ALS Belirli klonları izole etmek için, FTD TDP-43 (negatif kaydırma bu iki turu FTD TDP-43 reaktif olan herhangi bir hedef kaldırıldı gerekirdi çünkü) karşı olumsuz kaydırma 2 tur sonra toplanan bağlanmamış faj almak ve bu fajları kullanmak mika ALS TDP-43 antijene karşı pozitif kaydırma (3.3 ve 3.4 yukarıda açıklandığı gibi ALS TDP-43 mika hazırlamak) bir daha yuvarlak. </li><li> Bu üçüncü ALS mika ile 3.3 tüm adımları tekrarlayın ve 37 ° C&#39;de üç LBA plakaları O / N üzerinde enfekte TG1 hücreleri plaka. Ertesi gün potansiyel ALS klonları ile 6 LBA plakaları üzerinde koloni sayısını saymak. Pozitif kaydırma iki tur sonra üç LBA plakaları ile karşılaştırıldığında olumlu kaydırma üçüncü turu sonrasında potansiyel ALS klonları ile üç LBA plakaları üzerinde daha az koloniler olmalıdır. </li></ol> 4. Kültürleme ve Phage ÜrünALS karşı Potansiyel Pozitif Klonların iyon spesifik TDP-43 <ol><li> 37 ° CO / N bir çalkalayıcı üzerinde% 1 glükoz ile 2xYT 100 ul ve ampisilin, 100 ug / ml ihtiva eden 96 oyuklu plakalar içinde 6 plakalarından her bir koloni büyütün. </li><li> Ertesi gün aktarımı% 1 glükoz ile 2xYT 1 ml ampisilin, 100 ug / ml ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüplerine ALS TDP-43 proteini ile pozitif Tabaklama işleminin üçüncü turundan sonra 3 LBA plakaları klonlar ihtiva eden gözlerden elde 10 ul . </li><li> % 15 oranında bir nihai konsantrasyona kadar 96 oyuklu plakalar içinde tüm kültürlere gliserol ekleyin ve -80 ° C&#39;de plakalar dondurma. 1 ml kültür, 37 ° C&#39;de çalkalanarak 2-3 saat boyunca büyümeye izin verin. </li><li> Km13 yardımcı faj 10 9 ekleyin ve yardımcı faj çalkalanarak 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca enfekte izin verir. Santrifüj 10 dakika boyunca hücreler 3,000 xg&#39;de, 100 ug / ml ampicillin Kanam 50 ug / ml süpernatan atılır ve% 0.1 glukoz ile 2xYT 1 ml ilavegentamisin. </li><li> Kültür çalkalanarak 30 ° C&#39;de hücreler O / N. Santrifüj tüpleri 30 dakika boyunca 3.300 xg&#39;de, yeni mikrosantrifüj tüplerine süpernatant aktarmak ve her tüp PEG / NaCl ul 250 ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. 30 dakika için 3300 x g hızında tekrar santrifüj tüpleri süpernatan atılır ve her bir tüpe 100 ul PBS ilave edin. </li><li> 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. 11,600 xg&#39;de 10 dakika boyunca tüpleri Spin ve yeni tüplere süpernatant aktarın. -80 ° C&#39;de fajları saklayın. </li></ol> Potansiyel ALS Klonların 5. Sıralama <ol><li> Adımı tekrar 4.2 ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de O / N büyümeye kültürlere sağlar. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına uygun olarak klonların DNA plazmid preparatlarıyla yapınız. Ileri uygun kullanarak klonlar sırası ve primerler ters. </li></ol> ALS Özel TDP-43 Kullanma Dolaylı ELISA karşı Potansiyel Pozitif Klonlar Eleme 6. <ol><li> Her potansiyel ALS klon için yüksek bir bağlanma ELISA plaka oyuklarına ALS, FTD ve sağlıklı insan beyin dokusunun 2.5 ug / ml 100 ul ekle. Yavaş çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Plakaları% 0.1 PBST ile 3 kez yıkayın. Oyuk PBS içinde% 2 süt tozu 200 ul ilave edin ve yavaş yavaş çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yıkama adımı tekrarlayın ve sonra oyuklara PBS en az 1/100 seyreltilmiş her faj 100 ul ekleyin. Ve inkübasyondan sonra, yıkama aşamaları, her bir kuyucuğa 1/1000, anti-M13 HRP 100 ul ilave edin. Plakaları yıkayın ve ELISA Femto kemilüminesans substrat kiti kullanılarak görselleştirmek. </li></ol> 7. scFv Üretim ve Dolaylı ELISA kullanma Screening <ol><li> 0.4 OD 600 HB 2151 hücreleri büyümek. HB 2151 hücre 20 ul farklı faj 5 ul ekle. 30 dakika fajlar çalkalamadan 37 ° C&#39;de enfekte izin verin. Izgaraları içine LBA plakaları bölün, böyleceBu yaklaşık olarak 20 klon her birinin üzerinde plakanmıştır edilebilir. </li><li> Levhaya her bir faj ile enfekte bakteri 5-10 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de O / N inkübe edin. Bir sonraki gün 1,% 0.1 glukoz ile 2xYT ml 100 ampisilin ug / ml ayrı ayrı koloniler, ekleme ve OD 600 0.6 kadar 3-4 saat boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanır. </li><li> Her bir tüpe 1 M izopropiltiogalaktosit (IPTG) 1 ul ekleyin ve çalkalama ile 30 ° C &#39;de O / N inkübe edin. 10 dakika boyunca 11,600 xg&#39;de tüpler Spin ve ELISA testleri için süpernatant hasat. </li><li> ELISA testi için sulandırılmamış scFv&#39;yi eklemek dışında yerine faj 6.5, bölüm 6 aynı prosedürleri takip ve 6.6 için 1 / 1.000 9E10 HRP 100 ul ekleyin. </li></ol> 8. AFM Süreci <ol><li> Kırılmış mika hedef antijenin 10-20 ul ekleyin ve 5-10 dakika için inkübe edilir. Su ile mika 5 kez yıkayın. Mika fajlarm 10-20 ul ekleyin ve 5-10 dakika için inkübe edilir. </li><li> 5 kez tekrar wi mika yıkayıninci su ve kuru hava mika izin. AFM 1 kullanarak bağlama faj gözünüzde canlandırın. RT 29 havada bir NanoScope IIIa denetleyicisi ile AFM dokunarak modunu kullanarak AFM görüntüleme işlemini yürütün. silikon AFM sondalar 300 kHz bir rezonans frekansına ve 40 N / m arasında bulunan bir yay sabitesine sahiptir. 3.05 Hz tarama hızı ve 512 örnek / hattının bir tarama çözünürlüğü kullanın. </li><li> Tüm parçacık boyutları, her görüntü içinde karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için arka temel düzleşme görüntüleri işleyin. Faj genişliği (değil uzunluk) görüntüden görüntüye bağlı olarak bir diğer parçacık boyutları ve tarama alanına göre değişebilir, ama bu olsa da olmasa faj doğruluğu antijenine bağlanan uzlaşma asla. </li><li> Negatif kaydırma fajlann her set için AFM doğrulama sırasında mika görünür ise hiçbir fajlar negatif kaydırma sonraki seti geçmeden önce tespit edilene kadar ilave mermi gerçekleştirmek. </li></ol> Hedef Antigen 9. immünopresipitasyonu <ol><li> ISOLAT içinE, hedef antijen (TDP-43), (motorun korteks) homojenize beyin dokusunun, bir anti-TDP 43 poliklonal antikoru ve 1x Sten 1/100 seyreltme 100 ul bir Eppendorf 700 ul toplam hacmine tampon 250 ug eklemek tüp 28. </li><li> Bir döndürücüde 4 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. 1x Sten ile yıkayın A / G agaroz boncuk 2-3 kez tampon ve doku karışıma 25 ml ekleyin. , Bir döndürücü üzerinde 1.5 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 2000-4000 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve 1x STEN tamponu PBS ile 5 kez de pelet yıkayın. Pelet 1x STEN tampon 40-60 ul ekleyin ve 5 dakika boyunca kaynatın. Numunelerin sonra serin, santrifüj ve süpernatant toplamak. Immunopresipitasyon sürecinin 30 başarısını doğrulamak için SDS-PAGE ve Batı lekeleme kullanın. </li></ol> 10. nokta leke analizi <ol><li> Test edilecektir Her klon için küçük dikdörtgenler içine nitroselüloz kağıdı kesin. ALS, F, Nokta 2 ulTD ve nitroselüloz kağıt Allah&#39;a sağlıklı insan beyni doku örnekleri ve tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> PBS içinde% 5 süt tozu 1-2 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanır sağlar. Her faj 1/100 seyreltme 1 ml ekleyin ve 4 ° C&#39;de O / N sallamak verelim. % 0.5 PBST ile 10 dakika her biri için, membran 3 kez yıkayın. </li><li> Anti-M13 HRP 1 / 1,000 seyreltme 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanır sağlar. Tekrar yıkama işlemi ve Batı kemilüminesans çözüm kullanarak görüntülendi. </li></ol>

<ol>
	<li>Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+recombinant+antibodies+against+specific+protein+morphologies+using+atomic+force+microscopy+and+phage+display+technologies.">Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies.</a> Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).</li><li>Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Human+Single+Chain+Antibody+Fragment+Against+Oligomeric+&#945;-Synuclein+that+Inhibits+Aggregation+and+Prevents+&#945;-Synuclein-induced+Toxicity.">Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric &#945;-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents &#945;-Synuclein-induced Toxicity.</a> Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).</li><li>Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Morphologically+Distinct+Oligomeric+Forms+of+&#945;-Synuclein.">Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of &#945;-Synuclein.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).</li><li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+specific+for+oligomeric+beta-amyloid+stabilizes+nontoxic+form.">Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form.</a> Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).</li><li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+antibody+fragments+selective+for+specific+protein+morphologies+from+nanogram+antigen+samples.">Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples.</a> Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).</li><li>Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-oligomeric+A&#946;+Single-chain+Variable+Domain+Antibody+Blocks+A&#946;-induced+Toxicity+Against+Human+Neuroblastoma+Cells.">Anti-oligomeric A&#946; Single-chain Variable Domain Antibody Blocks A&#946;-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells.</a> Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).</li><li>Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+&#946;-Secretase+Activity+in+Alzheimer's+Disease+Cell+Models+with+Single-Chain+Antibodies+Specifically+Targeting+APP.">Inhibiting &#946;-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP.</a> Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).</li><li>Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+Tandem+Single+Chain+Antibody+Simultaneously+Inhibits+&#946;-Secretase+and+Promotes+&#945;-Secretase+Processing+of+A&#946;PP.">Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits &#946;-Secretase and Promotes &#945;-Secretase Processing of A&#946;PP.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).</li><li>Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Single-Chain+Fv+Intrabody+Blocks+Aberrant+Cellular+Effects+of+Overexpressed+[alpha]-Synuclein.">A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein.</a> Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).</li><li>Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43-mediated+neurodegeneration:+towards+a+loss-of-function+hypothesis.">TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).</li><li>Akamatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+mouse+model+for+investigating+the+properties+of+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+protein+TDP-43,+by+in+utero+electroporation.">A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation.</a> Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).</li><li>Keage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+in+the+Population:+Prevalence+and+Associations+with+Dementia+and+Age.">TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).</li><li>Honda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALS/FTLD-related+RNA-binding+proteins+TDP-43+and+FUS+have+common+downstream+RNA+targets+in+cortical+neurons.">The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons.</a> FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).</li><li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43:+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li><li>Ling, S. -. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).</li><li>Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+subcellular+localization+of+TDP-43+immunoreactivity+in+the+anterior+horns+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).</li><li>Robertson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+TDP-43+abnormalities+in+mutant+SOD1+transgenic+mice+shows+disparity+with+ALS.">Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS.</a> Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).</li><li>Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+TDP-43+in+the+G93A+mutant+SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS.">Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS.</a> Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).</li><li>Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abnormal+processing+of+TDP-43+is+not+an+upstream+event+of+reduced+ADAR2+activity+in+ALS+motor+neurons.">The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons.</a> Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+abolishes+mutant+TDP-43+induced+excitability+in+a+motoneuron-like+cellular+model+of+ALS.">Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS.</a> Neuroscience. 272, 141-153 (2014).</li><li>Sheets, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library:+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens.">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li><li>Hairul Bahara, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+antibodies+for+diagnostic+applications.">Phage display antibodies for diagnostic applications.</a> Biologicals. 41, 209-216 (2013).</li><li>Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+(Bt).">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library.">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li><li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+salivary-pellicle-binding+peptide+by+phage+display.">Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display.</a> Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).</li><li>Adamson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+antibodies+to+the+prion+protein+identified+by+phage+display.">Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display.</a> Virology. 358, 166-177 (2007).</li><li>Hebron, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+(TDP-43)+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+(HDAC6).">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li><li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM.">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li><li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus.">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li><li>Jo&#324;czyk, E., K&#322;ak, M., Mi&#281;dzybrodzki, R., G&#243;rski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages&#8212;review.">The influence of external factors on bacteriophages&#8212;review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li><li>Hammers, C. M., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Phage+Display:+Technique+and+Applications.">Antibody Phage Display: Technique and Applications.</a> J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, Parkinson&#8217;s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress ...

protein varyantlarının varlığı, Alzheimer, Parkinson, ALS ve frontotemporal demans (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 gibi nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere bir çok hastalığın ilerlemesinde bir faktör olarak implike edilmiştir , 10,11. Proteinler, beta-amiloid ve alfa-sinüklein oligomerik biçimleri, Alzheimer ve Parkinson sırasıyla 2,3,4,5 sorumlu toksik türler olduğu düşünülmektedir. TAR DNA-bağlama proteini 43 (TDP-43) agregalar ALS FTD 12,13,14 ile bağlantılı olmuştur. Bu nedenle seçici farklı protein varyantları olarak teşhis belirteçleri ve potansiyel terapötik hizmet güçlü araçlar olabilir hedefleyebilir antikorlar gibi reaktifler. Bu çalışmada, ancak bu yazıda anlatılan teknik prot geniş bir yelpazesine karşı reaktif izolasyonu için geçerli olmalıdır, seçici ALS implike TDP-43 protein varyantlarını bağlanan reaktif geliştirilmesi üzerine odaklanmıştırein varyantları arasından seçilir. TDP-43 sitoplazmik yığılması ALS 15,16,17,18,19 patolojik özellik olarak tanımlanmıştır. Bu sitozol ve çekirdeği 15,17 arasında hareket eğilimi Tipik olarak TDP-43, normal bir bireyden alınan tüm hücre çekirdeğinde bulunur. TDP-43 Ancak, ALS toplanan formlar hastalığın ilerlemesi 16,20 sırasında sitoplazmaya çekirdekten TDP-43 hareketini düşündüren çekirdeğinde bulunan düşük konsantrasyonları ile seçin nöronların sitoplazmasında ve glia tespit edilir. TDP-43 toplama ALS vakalarının çoğunda bulunan iken, mutasyonlarla bağlantılı olan% 1, toplam ALS vakalarının (veya% 15 ailesel ALS vakalarının -20%) -2% beri tüm durumlar için hesap değil süperoksit dismutaz 1 (SOD1) gen 15,17. Çünkü ALS vakalarının büyük çoğunluğunda TDP-43 önemli rolü, burada seçici olan TDP-43 varyantları bağlanabilen bu antikor bazlı reaktifler geliştirmeye odaklanmakBizim yeni AFM tabanlı biopanning teknikleri kullanılarak insan ALS beyin dokusunda mevcut. Başlangıçta biz antikor bağlanma etki çeşitli bir repertuar gerekir. Biz üç farklı faj gösterim tek zincir değişken alan antikor fragmanı (scFv&#39;ler) kütüphaneleri, (Tomlinson I ve J ve Levhalar kütüphaneler 21) birleştirdi. kaydırma işlemi negatif ve pozitif kaydırma evreye ayrılır. Kütüphanelerden fajlar ilk olarak çok sayıda hedef dışı antijenleri hariç reaktif Enterobacteria fajı sırasında negatif bir geçişle işleme tabi tutulmaktadır. Her hedef dışı antijene karşı olumsuz her panlamadan tamamlanmasından sonra, süreç dışı hedef antijenleri bağlama tüm faj kaldırıldı emin olmak için AFM görüntüleme ile izlenir. Sadece tüm reaktif fajlar kaldırılır AFM görüntüleme ile doğruladıktan sonra bir sonraki hedefe geçin yoktur. ALS karışmış TDP-43 yönlerine karşı reaktifler izole etmek için aşağıdaki negatif kaydırma antijenler kullanılmıştır:<html> 1), BSA zayıf ya da olmayan spesifik proteinlere bağlanan faj kaldırmak için; 2) toplu alfa-sinüklein toplu proteinlerin genel yapı elemanları bağlanan faj kaldırmak için; 3), insan beyin dokusu homojen halleri herhangi bir protein ya da sağlıklı bir insan beyin dokusunun ölüm sonrası örneklerdeki mevcut diğer bileşenlere bağlanan faj kaldırmak için; 4) Sağlıklı insan beyninin ile ilgili tüm TDP-43 formları bağlanan faj kaldırmak için sağlıklı insan beyninden TDP-43 immunoprecipitated; ve 5) TDP-43-olmayan ALS patoloji ile ilişkili TDP-43 türevleri bağlayan faj kaldırmak için FTD beyin homojenatlar izole immunoprecipitated. Tüm hedef dışı antijenlere karşı reaktif her faj çıkarılmasından sonra, daha sonra insan ALS beyin dokusundan imüno Bu durumda TDP-43, ilgi konusu antijen bağlayan antikor fragmanları izole edilmiştir sırasında pozitif kaydırma aşamasına ilerledi. Bu izole edilmiş antikorlar TDP-43 toplanan veya modifiye edilmiş formları, reaktif olabilir. &quot;&gt; Geleneksel faj Bio belirleme pozitif kaydırma faz 22,23 üzerinde odaklanmıştır. Genellikle ilgi konusu hedef, immobilize edilmekte, faj kütüphanesi ilave edildi ve bağlanmış fajlar. Bu amplifikasyon ve kuluçka işlemi getirici fajlar daha sonra güçlendirilir. Yıkanır ve tekrar hedefe ilave Bu işlem varyasyonları, hedef antijenleri geniş bir karşı antikor reaktifleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, genellikle pozitif bağlanma faj yüzdesini arttırmak için birçok kez tekrarlanır., genel olarak, saflaştırılmış hedef antijenin 24,25,26 büyük miktarda gerektirir, Süreç, sadece hedef antijenin eser miktarda gerektirir, oysa. 27, burada tarif edilen protokol saflaştırma ve yatay kaydırma için gerek kalmadan çok düşük konsantrasyonlarda mevcut olan seçici olarak bağlanan bir hedef antijene karşı doğrudan yapılabilir reaktifler izole etmek için de kullanılabilir Karmaşık doku örneklerinde antijen mevcut. ayrıntılı negatif kaydırma protokollerinin kullanımı doğrulanmadı gibiAFM ile arıtılmış, ya da zenginleştirilmemiş pozitif oldukları zaman antijene karşı izole edilen klonların selektif da hedef bağlanmasının sağlar. Kasturirangan ve arkadaşları (2003) hedef 5 nanogram konsantrasyonu kullanılarak oligomerik beta-amiloid reaktif antikorları izole etmek için de benzer bir negatif ve pozitif Bio belirleme işlemini gerçekleştirmiştir. Burada seçici hastalığa spesifik protein, insan doku örnekleri doğrudan varyantları bağlama reaktiflerin nesil etkinleştirmek için bu süreci genişletin. Gelecekteki çalışmalarda daha da değil sadece burada izole reaktif tanısal değerini araştırmak değil, aynı zamanda ALS tedavisi için terapötik alaka değerlendirmek niyetinde. Genel olarak, yeni ve AFM bazlı Bio belirleme teknolojisi, protein saflaştırma veya modifikasyonunu gerektirmeyen herhangi bir biyolojik madde içindeki bir hastalığa özgü bir protein değişkeni yalıtıldı için geçerli olmalıdır bile hedef antigen concentrations son derece düşüktür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:287px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:212px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:323px;">Tomlinson I and J Libraries</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sheets Library</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2xYT</td>
			<td style="width:287px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:119px;">244020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glucose</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0188-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339-25G</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">KM13 Helper Phage</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:287px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5880</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Polyethylene Glycol 8000</td>
			<td style="width:287px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">6510</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:287px;">Macron</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0404-1KG</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">PX1405-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0781-500G</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TG1 Cells</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria-Bertani Agar</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">1.10283.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">STEN buffer</td>
			<td style="width:287px;">Crystalgen Inc.</td>
			<td style="width:119px;">33429775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Immunotubes</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">470319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Mica</td>
			<td style="width:287px;">Spruce Pine Mica</td>
			<td style="width:119px;">24365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tween 20</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypsin</td>
			<td style="width:287px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-0303</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:287px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-0886</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glycerol</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0854-1L</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DNA Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:287px;">qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Non-Fat Milk Powder</td>
			<td style="width:287px;">Carnation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96-Well High Binding ELISA Plate</td>
			<td style="width:287px;">Costar</td>
			<td style="width:119px;">3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Anti-M13 HRP</td>
			<td style="width:287px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">27-9421-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:323px;">ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody</td>
			<td style="width:287px;">ProteinTech</td>
			<td style="width:119px;">10782-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">A/G Agarose Beads</td>
			<td style="width:287px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">HB 2151 Cells</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropylthiogalactoside</td>
			<td style="width:287px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">13325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">9e10 HRP</td>
			<td style="width:287px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrocellulose Membrane</td>
			<td style="width:287px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Sorvall RC 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:287px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AFM Probes</td>
			<td style="width:287px;">VistaProbes</td>
			<td style="width:119px;">T300R-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel atomic force microscopy based biopanning for isolation of morphology specific reagents against tdp-43 variants in amyotrophic lateral sclerosis

Protein varyantları TDP-43 Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) &#39;de, alfa-sinüklein de dahil olmak üzere pek çok hastalıkta önemli bir rol oynadığı için, Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı, beta-amiloid tau, bu morfoloji özel reaktifler seçici hedefleyebilir geliştirilmesi kritik bir öneme sahiptir Bu hastalığa özgü bir protein hastalık patolojisinde ve potansiyel diagnostik ve terapötik uygulamalar için bu varyantların rolünü incelemek için varyantları arasından seçilir. Burada özellikle hastalığa özgü protein varyantlarını tanıyan reaktifler izolasyonuna olanak veren, yeni atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) göre Bio belirleme yöntemleri geliştirmişlerdir. Süreç, negatif ve pozitif kaydırma aşamalarında alan iki önemli aşamaları vardır. Negatif kaydırma aşamasında, off-hedef antijenlere karşı reaktif olan fajlar özenle seçilmiş hedef dışı antijenleri bir dizi kullanarak Eksiltici kaydırma birden tur üzerinden elimine edilir. Negatif bir anahtar özelliğikaydırma faz sürecini izlemek ve tüm istenmeyen faj partikülleri kaldırılır onaylamak için AFM görüntüleme kullanmaktadır. Pozitif kaydırma fazı için, ilgi konusu hedef antijen, bir mika yüzeyi üzerinde sabit olan ve bağlanmış fajlar yıkanır ve seçici hedef antijene bağlanma fajlarından tespit etmek taranır. Eğer hedef protein varyantı uygun negatif kaydırma kontrol kullanılmıştır temin saflaştırılabilir gerek yoktur. Hatta pozitif kaydırma aşamada kullanılabilecektir karmaşık biyolojik malzemede çok düşük konsantrasyonlarda, sadece mevcut, protein varyantları hedef alır. Bu teknolojinin uygulanması sayesinde, seçici insan ALS beyin dokusunda bulunan TDP-43 protein varyantları antikorlar almıştır. Bu protokol, seçici olarak farklı biyolojik süreç ve hastalıkların çok çeşitli olan protein varyantları bağlanan üreten reaktifler için geçerli olmalıdır bekler.

Şekil 1&#39;de şematik biz immunotubes kullanarak kütüphaneden hedef dışı antijenleri bağlama faj kaldırıldı hangi olumsuz kaydırma işlemini göstermektedir. Bu ortak bir engelleme ajan ve gelecekteki immunoassay sorunlu olacağını, bu hedefle spesifik olmayan tepki vereceğini herhangi bir faj beri biz başlangıçta BSA ile başladı. Bundan sonra, toplanan protein (yani, biraraya toplanmış, alfa-sinüklein çapraz reaktif olması beklenir bir antikor TDP-43, Abeta, vs.)<...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

novel-atomic-force-microscopy-based-biopanning-for-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K Görüntüleme.  Arizona State University. Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Video: Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Biyomühendislik

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Erken Osteoartrit tespit etmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu Uygulaması

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...