Bu çalışma, Wisconsin ve Çocuk Araştırma Enstitüsü Wisconsin Juvenil Diabetesat Medical College Max McGee, Ulusal Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, ya da yazının hazırlanmasında rol oynamıştır.

1. Bir bastırma tahlil kurmadan önce, daha sonra hücre uyarılması ve bir ihtiyacı için anti-insan CD3 (klon UCHT1, nihai konsantrasyonu 1μg/ml) kat tosylactivated boncuk boncuk verimli insan kullanarak in vitro proliferasyonu tayininde kurma kaplı olup olmadığını kontrol edin T hücreleri <ol><li> Orijinal şişe, manyetik standı yer M-450 tosylactivated boncuk 1ml alın ve tüm boncuklar tüp tarafına yapıştırılır kadar tutun. Tüp manyetik stand hala tamponu çıkarın. 37, ajitasyon tekrar süspansiyon boncuk buffer1 1 ml ve anti-insan CD3 40μl eklemek °; manyetik stand tüp ve buffer1 1 ml ekleyin, tekrar tüp manyetik standında yer ve tüp manyetik standında ise buffer1 kaldırmak C&#39;de 15 dakika boyunca,% 0.1 w / v BSA ekleyin ve önümüzdeki 16 saat boyunca ajitasyon devam ediyor. </li><li> 5 dakika boyunca tampon kaldırmak ve buffer2 1 ml boncuklar tekrar süspansiyon; boncuk ° C ve bir kez, 5 dakika buffer3 içinde 2-8 ° C yukarıda açıklandığı gibi manyetik standı kullanarak 2-8, iki kez buffer2 boncuk yıkayın 4x10 8 / ml son konsantrasyon ve kullanıma hazır. </li><li> Kısım 50.000 ve 25.000 PBMC / 96 plaka triplicates ve CD3 kaplı boncuklar değişken sayısı (4x10 8 boncuk / ml, CD3 1μg/ml, örneğin 1, 2, 3, 4, 5 boncuk / hücre eklemek ) hücre başına boncuk optimal sayısını belirlemek için. 72 saat sonra kültür, 1μCi [3 H] timidin ekleyin ve 37 kuluçka ° C önümüzdeki 16 saat boyunca devam ediyor. Çoklu hasat plaka (Millipore) Hasat hücreleri, parıldamanın sıvı ve Kont NXT (Packard, CT) kullanılarak / dakika başına sayıları (CPM) okuyun. BGBM&#39;leri 5000 yukarıda boncuk / hücre oranı ancak daha az 15000 baskılayıcı fonksiyonunu kaybedebilir Tregs, aşırı uyarılma önlemek için kullanın. Genellikle 3 boncuk / hücre oranı, şu ana kadar 1-4 test edilen tüm konu gruplarında cevaplayıcı ve Treg hücreleri uyarır . </li></ol> 2. Sağlıklı donörlerin veya insan leukopacks veya genellikle yerel Kan Transfüzyon Merkezleri sorumlu sağlıklı gönüllü ve alınan buffy coat (BC) (Şekil 1) tam kan hücre izolasyonu <ol><li> M.Ö. (~ 50 ml) 01:06 PBS ile (add 250ml) seyreltilir. Şimdi 300ml toplam hacmi vardır. Yavaşça seyreltilmiş M.Ö. 25ml 15ml Ficoll-Paque üst katmanı PLUS katmanları bozmadan, 50ml Falcon tüpler ekledi. 30 dakika 4 ° C, frenler için 800xg Santrifüj (sallanan kova rotor SH-3000 ile Sorvall santrifüj 1400) kapalı. </li><li> Hücre katmanı (ara faz) dikkatli bir şekilde toplamak ve yeni bir 50ml Falcon tüpler aktarmak. PBMC DPBS ile 50ml tüpleri doldurarak yıkayın. Bir tüp içine 2 hücre pelletleri toplayın. 4 10 dakika 400xg santrifüjleyin ° C Her seferinde tek bir tüp içine 2 hücre pelletleri birleştirerek, iki kez adım yıkama tekrarlayın. Tek bir tüpe 50ml tüm hücre pelletleri birleştirin. </li><li> Tripan Mavi dışlama testi kullanılarak hücre güvenin. 180μl Tripan Mavi leke PBMC, 20μl ekleyerek Tripan Blue 1:10 seyreltme olun. İyice karıştırın ve hemen hemasitometre saymak 20μl almak. Iki kare blok, her biri 16 küçük kare içeren bulunan tüm lekesiz ve sadece mavi boyanan hücrelerin sayıları sayma. Iki numara ortalama 10 ile çarpın. Hücre / ml &#39;lik bir numara almak için bu sayı 100 ile bölün. Canlı hücreler Yüzde olarak hesaplamak [1 - (mavi hücre sayısı / toplam hücre sayısı) x100]. Yaşayabilirliği ≥% 95 ise devam edin. </li></ol> 3. CD4-T hücreleri MACS ön sıralamak <ol><li> Devam etmeden önce, yeni bir tüp içine PBMC 1 ml transfer 5000rad bu ışınlanması için hücreleri hazırlamak için medya 4ml eklemek antijen-sunan hücreler (APC) olacaktır. </li><li> PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 250xg hücreleri geri kalanı Santrifüj 10 dakika süreyle 4 ° C PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 4ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri dökün. </li><li> MACS anti-CD4 mikro 200μl ekleyin ve 4 ° C&#39;de 20 dakika için. </li><li> 250xg PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon ve santrifüj 40ml ekleyerek yıkayınız 10 dakika süreyle 4 ° C Gazlar, oda sıcaklığında PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon, 8 ml supernatant ve tekrar süspansiyon dökün. </li><li> LS sütun üzerinde yüklemeden önce Ön ayırma filtreleri kullanarak Filtre ayrı hücre süspansiyonu. </li><li> Split hücre süspansiyonu ve katman 4ml üzeri kalibre her LS kolon (deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 3ml). LS sütun MidiMACS ayırıcı sabittir. Hücre süspansiyonu, yeniden çalıştırmak flowthrough ya biterse veya PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon deggassed oda sıcaklığında 3ml eklemek ve tampon aracılığıyla çalışmasına izin önce. Daha fazla tampon temizlemek gelene kadar ekleyin. </li><li> LS sütun üzerine Pipet 5ml deggassed tampon aracılığıyla ~ 1.0ml çalıştırmanızı sağlayarak yeni bir steril 15ml toplama tüpünün içine LS Sütun MidiMACS ayırıcı ve yerden kaldırmak. Sütuna piston koyun ve yavaş yavaş geri kalanı itinhacminin. </li><li> Her iki LS sütunları ile aynı yapın ve iki CD4 + kesirler birleştirmek. 50ml PBS ve sayısı hücrelere ekleyin. Beklenen verim 5x10 8 hücrelere kadar. 2ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 10 dakika ve tekrar süspansiyon hücreleri 400xg santrifüjleyin. </li></ol> 4. Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) izolasyonu (Şekil 2) <ol><li> Aşağıdaki hücre yüzey belirteçleri (ışıktan korumak) CD işaretçileri antikorların bir kokteyl olun: 20 ul anti-insan CD8-FITC (klon RPA-T8), anti-insan CD14-FITC (klon M5E2 20 ul; LPS reseptör), 20 anti-insan CD32-FITC (klon FLI8.26 ul; FcγR tip II) ve anti-insan CD116-FITC (klon M5D12 6 ul GM CSFRα zinciri) ve alternatif olarak, 40μl karşıtı ekleyin insan CD4-APCCy7 (klon RPA-T4). </li><li> 2ml hücre süspansiyonu 5μl alın ve leke kokteyl 2μl ile leke, bu eşik (Florokrom Eksi Bir ​​FMO) 5 belirlemek için bir tüp. </li><li> Leke kokteyl ve 4 ° C 30 dakika hücre süspansiyonu ve inkübe kokteyl, anti-insan CD25-PE (IL-2Rα klon M-A251) 50 ul ekleyin. 10 dakika 10 7 / ml bir hücre konsantrasyonu ve tekrar süspansiyon hücreleri için 400xg PBS, santrifüj hücre yıkayın. </li><li> Boyanmamış hücre ve hücreler veya hücre FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ) sıralama için tazminat kontrolü olarak kullanmak için tek florokrom ile boyandı boncuk hazırlayın. </li><li> FMO tüp hücreleri Edinme kullanıcı CD25 + T hücreleri (Şekil 2a) sıralama için eşik ayarlamak için izin verecektir. FITC-pozitif hücreler, monositler, makrofajlar ve diğer tüm CD4 + T hücreleri (Şekil 2b) oluşan dışlamak için bir kapı FITC-negatif hücrelerin etrafındaki ayarlayın. </li><li> Ayrı bir arsa, CD25, CD25low ve CD25high T hücreleri-Tregs (üst, en yüksek sayıda CD25 eksprese eden hücrelerin% 1) (Şekil 2c) için geçitler çizerek. Hücre alt grupları genellikle yüksek saflıkta (Şekil 2d, 2e ve 2f) göstermektedir. </li><li> 10 dakika için 400xg hücre toplama tüpleri Santrifüj ve kaplama kadar buz üzerinde saklayın. </li></ol> 5. 200μl/well 96-plaka (düzeni Tablo 1 olarak eklenmiştir) hücre kültürü ayarlayın <ol><li> CD3 kaplı boncuklar kısım 50μl (1 mcg / ml) 3 boncuk / U-alt% 10 toplanmış insan AB serum ile eksiksiz bir medya yeniden süspanse iyi cevaplayıcı hücre, 96-kuyucuğu olarak hesaplanmıştır. (Örneğin, CD3 kaplı 2ml medya, CD3 kaplı stok boncuk final konsantrasyonu 4x10 8 / ml 7.5μl almak ve medya 2ml sulandırmak; her 50μl 75.000 beads-3beads/cell içerecektir). </li><li> 5x10 5 / ml hücre konsantrasyonunu ışınlanmış APC seyreltilir ve &quot;sadece Tregs&quot; olarak etiketlenen kuyular, Tablo &quot;sadece APC&quot; ve &quot;medya sadece&quot; dahil olmak üzere, önceden eklenmiş stimülasyon, her kuyuya 50μl eklemek (2.5 x 10 4 hücreler içeren) 1. </li><li> Tablo 1&#39;de tasarım aşağıdaki triplicates 2.5 x 10 4 / iyi CD4CD25 veya CD4CD25low T hücreleri ekleyin. </li><li> Oranı 1:10 (2,500 Treg hücreleri) co-kültürler (satır B, Tablo 1) ve &quot;sadece Tregs&quot; olarak etiketlenen kuyulara Tregs ekle ve% 5 CO 2 ile CO 2 inkübatör plaka 37 ° C&#39;de inkübe , 72 saat boyunca nem doymuş. </li><li> Darbe 1μCi [3 H] timidin ile kuyu ve inkübasyon 37 ° C Sonraki 16 saat boyunca devam ediyor. </li></ol> 6. Hasat ve sayım <ol><li> Packard filtermate döver ya da alternatif bir sistem kullanarak çoklu hasat plaka üzerinde Hasat hücreleri. </li><li> Sintilasyon sıvı (Microscint 20), son adım için hazırlık, şeffaf plastik bir kapak ile plaka hasat kapsar. </li><li> Dakika başına sayıları (CPM) Okuma / Kont NXT (Packard, BT) veya alternatif bir sistem kullanıyor. </li></ol> 7. Bastırma Bilgisayar yüzdesi <ol><li> Hücreleri triplicates kültüre edildi olarak, ortalama her durum için hesaplanır. Varyasyon katsayısı&gt;% 30 ise, uç ortalama iki kuyu yok ve sadece kopyaya. Bastırma Yüzde hesaplama ile elde edilir [(sc) / s] x% 100 = kopyaya tek kültür ve c = ko-kültür cpm. </li><li> Naif (CD25-) ve in vivo aktif (CD25low) efektör T hücreleri cevaplayıcı T hücreleri olarak kaplama, bu alt gruplarının her bastırmak için Tregs yeteneğini fark öncül dayalı bir potansiyel fonksiyonel prognostik göstergesi olarak yakalanan ve kullanılan olduğu gibi bu aktif hücrelerin bastırmak için zordur. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Büyük değişkenlik yöntemleri kullanılmış ve in vitro insan bastırma tahlil edilen sonuçlar bize tahlil 1 etkileyen koşulların kapsamlı bir çalışma gerçekleştirmek için istenir. Daha önce 6 belirlenir Teffs (1:10): Biz Tregs arasında düşük oranı göz önünde bulundurularak, Treg fonksiyonu sadece test tahlil, aynı zamanda saflık geliştirdik. Buna ek olarak, Tregs th farklıbağışıklık dengesini tehlikeye T1D geliştirmek için risk altındaki kişilerde olduğu gibi başarıyla, naif ve Şekil 3 ve daha belirgin hale gelir, önceki çalışmalarda 2,4, gösterildiği gibi sağlıklı kişilerde bile vivo aktive T hücreleri, bastırmak için EIR yeteneği . Tahlil bize sağlıklı kontrol arasındaki fonksiyon karşılaştırmak için izin verir, biz doğal (nTregs), indüklenebilir (iTregs) ve in vitro genişletilmiş nTregs baskılayıcı fonksiyon karşılaştırıldığında çalışmada çok iyi çalıştı, yeni başlangıçlı (RO) T1D ve uzun süreli ( LS ) T1D konular. Biz RO T1D konularda fonksiyonel iTregs ve genişletilmiş nTregs üretme LS T1D ve sağlıklı bireyde 7 ile karşılaştırıldığında daha iyi bir kapasiteye sahip olduğu sonucuna varmıştır. Böylece, bu testte bağışıklık dengesizliği erken ve geç devlet hem de tanıma mükemmel bir araç olarak kullanılabilir. Programı 1 şematik sunumu in vitro bastırma tayininde yer alan adımları <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 fotoğraflarla birlikte sunulan in vitro bastırma tayininde Adımları <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 FACS hücre izolasyonu Ayırıcı stratejisi. FITC-negatif hücrelerin (daha kapı vardı ve CD + CD25, CD + CD25low ve CD + CD25high olarak toplanan bir) CD25 + eşik) hücreler, c FITC-negatif olarak kapılı idi) Florokrom Eksi Bir (FMO), b göre ayarlanabilir oldu Tregs) yüzdeleri, d ile gösterilir) e sıralama sonra CD + CD25low sıralaması, sıralama sonra Tregs sıralaması FACS) FACS, ve f) sıralama sonra sıralaması CD4 + CD25-T hücrelerinin FACS <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 sağlıklı bireylerden Temsilcisi sonuçları a) ilgili tüm hücre alt grupları için tek kültür olarak sunulan sağlıklı birey (naif-CD25-, in vivo aktif-CD25low, antijen sunan hücreler APC dakikada sayar Temsilcisi (CPM) ve Her CD25 ve otolog Tregs CD25low cevaplayıcı T hücrelerinin sağlıklı kontrol olgusu sunulmuştur (n bastırma düzenleyici T hücreleri-Treg) yanı sıra cevaplayıcı T hücrelerinin ortak kültürler (CD25-veya CD25low) ve Tregs b) Yüzde = 4). Bastırılması [(sc) / s] olarak hesaplanmıştır x% 100 = kopyaya kadar tek bir kültür ve c = kopyaya ko-kültür. Cevapçı T hücrelerini bastırmak için Tregs kapasitesi hafif fark fark olmasına rağmen,. C (t-testi p = 0.08 eşleştirilmiş)) Sunan cevaplayıcı olarak CD25 ve CD25low de dahil olmak üzere, tek tek her kültür için risk konular kopyaya kadar önemli değildi T hücrelerinin yanı sıra her cevaplayıcı T hücre alt otolog her CD25 ve CD25low cevaplayıcı T hücrelerinin baskılanması Tregs (CD25-/Tregs ve CD25low/Tregs) d) Yüzde numaralı seribaşı APC ve Tregs ve ortak kültürler Tregs riskli grup (n = 4) sunulmuştur. CD25-versus CD25low cevaplayıcı T hücreleri bastırmak için Tregs kapasitesi arasındaki fark anlamlıydı (eşleştirilmiş t-testi p = 0.04). Tablo 1. Şematik in vitro bastırma tayininde kurdu <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1-3 </td><td> 4-6 </td><td> 7-9 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> sadece medya </td><td> sadece medya </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Sadece Tregs </td><td> APC sadece </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note.">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).</li><li>Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+arsenazo+III+in+the+preparation+and+characterization+of+an+albumin-linked,+gadolinium-based+macromolecular+magnetic+resonance+contrast+agent.">Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent.</a> J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).</li><li>Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+determination+of+the+number+of+water+molecules,+q,+coordinated+to+europium(III)+ions+in+solution+from+luminescence+decay+lifetimes.">On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes.</a> Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).</li><li>Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+drug+and+imaging+conjugates:+design+considerations+for+nanomedical+applications.">Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications.</a> Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).</li><li>Que, E. L., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+as+chemical+sensors+for+metals+in+biology+and+medicine.">Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).</li><li>Uppal, R., Caravan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+probes+for+cardiovascular+MR+imaging.">Targeted probes for cardiovascular MR imaging.</a> Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).</li><li>Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioresponsive,+cell-penetrating,+and+multimeric+MR+contrast+agents.">Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).</li><li>Datta, A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gd-hydroxypyridinone+(HOPO)-based+high-relaxivity+magnetic+resonance+imaging+(MRI)+contrast+agents.">Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).</li><li>Le&#244;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+MRI+agents+for+sensing+metabolism+in+vivo.">Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo.</a> Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).</li><li>Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+containing+nanosized+systems+for+MR-molecular+imaging+applications.">Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications.</a> Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).</li><li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gadolinium(III)+chelates+as+MRI+contrast+agents:+structure,+dynamics,+and+applications.">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).</li><li>Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging:+theory+and+design.">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li><li>Yoo, B., Pagel, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging.">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).</li><li>Pandya, S., Yu, J., Parker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+emissive+europium+and+terbium+complexes+for+molecular+imaging+and+sensing.">Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing.</a> Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).</li><li>Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+in+the+preparation+of+dendrimer-based+bifunctional+diethylenetriaminepentaacetic+acid+MR+contrast+agent+derivatives.">A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives.</a> Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).</li><li>Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MRI+properties+between+derivatized+DTPA+and+DOTA+gadolinium-dendrimer+conjugates.">Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).</li><li>Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents.">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li><li>Le&#244;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates.">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li><li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Tregs tek benzersiz özellik olarak, baskılayıcı fonksiyonu aynı içinde ve farklı çalışmalar arasında hastalık gelişiminin farklı aşamalarını güvenilir ve düzgün konular arasında test edilmelidir. Biz bu testinin standardizasyonu için katkı olarak laboratuvarda geliştirilen bastırma tahlil detayları sunar. Geniş optimizasyon çalışması, insan anti-CD3 kaplı boncuklar (APC olarak hücre ile birlikte 1μg/ml konsantrasyonu UCHT1 klon (piyasada mevcut 5μg/ml karşı) ile T hücre stimülasyon...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif ya da enstrüman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Tripan Mavi </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 mikro </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Ön ayırma filtreleri </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS sütun </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD4-APCCy7 (klon RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD25-PE (klon M-A251; IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD8-FITC (klon RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD14-FITC (klon M5E2; LPS reseptör) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD32-FITC (klon FLI8.26 FcγR tip II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD116-FITC (klon M5D12; GM-CSFRα zinciri) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD3 </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Ev yapımı </td><td></td><td> 0.1M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Ev yapımı </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA /% 0.1 BSA pH7.4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Ev yapımı </td><td></td><td> % 0,2 M Tris/0.1 BSA pH8.5 </td></tr><tr><td> Alexa RPMI medya </td><td> Ev yapımı </td><td></td><td> RPMI 1640 medya 2 mM L-glutamin 5 mM HEPES 100 U / mg / ml Peni / strept 0.5 mM sodyum piruvat </td></tr><tr><td> [3 H] timidin </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> insan toplanmış AB serum </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Çoklu hasat plaka </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

human in vitro suppression as screening tool for the recognition of an early state of immune imbalance

Düzenleyici T hücreleri (Tregs), self-antijenleri immün tolerans kritik arabulucular. Buna ek olarak, önemli bir enfeksiyon sonrası immün yanıt düzenleyicileri. Tregs benzersiz yüzey işaretleyici tanımlamak için çabalarına rağmen, sadece benzersiz özellik efektör T hücrelerinin çoğalması ve işlevi bastırmak için yeteneğidir. In vitro tayinlerde, sadece insan Treg fonksiyon değerlendirilmesinde kullanılabileceğini açık olmakla birlikte, otoimmün hastalıkları (Tip 1 Diyabet-T1D gibi) ihtiyacı olan kişilerde sağlıklı hücre ve hücreler izole kesitsel çalışmalardan elde edilen sonuçlar değerlendirilirken, bu sorunlu olur karşılaştırılabilir. Cevapçı oranları ve insan, antijen sunan hücrelerin sayısı ve türü (APC), in vitro bastırma tayinlerde: Cevapçı T hücreleri, stimülasyon doğası ve gücü, Treg sayısı ve türü laboratuvarlar arasında büyük bir değişkenlik yoktur. Bu değişkenliği Treg fonksiyonu zor ölçüm çalışmalar arasında karşılaştırma yapar. Treg alan sağlıklı kişilerde ve otoimmün hastalıklar ile çalışacak bir standart bastırma tahlil gerekiyor. Biz, pankreas β-hücrelerinin otoimmün yıkımı temel konularla karşılaştırıldığında sağlıklı gönüllüler izole edilen T hücrelerinin uyarılması çok az test içi değişkenlik gösterir in vitro bastırma tayininde geliştirdik . Bu parça ana hedefi, farklı konu grupları arasında karşılaştırma sağlayan in vitro insan bastırma tayininde bir tanımlamak için. Ayrıca, bu testte, küçük bir fonksiyon nTreg kaybı tasvir ve gelecekte daha da kaybı, önleyici immünomodülatör tedavi 1 yararlanabilir böylece tespit konularda tahmin etmek potansiyele sahiptir. Aşağıda, bu yordamı yer alan adımları ayrıntılı bir açıklama sağlar. Treg fonksiyonu ölçmek için kullanılan in vitro bastırma tayininde standardizasyon katkıda bulunmayı umuyoruz. Buna ek olarak, bağışıklık dengesizliği erken bir devlet ve T1D için potansiyel bir fonksiyonel biyomarker tanımak için bir araç olarak bu testte sunuyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance at JoVE.com

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize tarif<em&gt; In vitro</em&gt; Tahlil T1D geliştirmek için risk altındaki kişilerde bağışıklık dengesizlik tespit yeteneğine sahip.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

14.4K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize tarif In vitro Tahlil T1D geliştirmek için risk altındaki kişilerde bağışıklık dengesizlik tespit yeteneğine sahip.

Video: Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

Otoimmün demiyelinizasyonun Farmakolojik Müdahaleler için CNS Koruma karşı Belirlenmesi Bağışıklık Sistemi Bastırma

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...