Yazarlar Kim laboratuvar, yararlı tartışmalar ve veri paylaşımı için Zebrafish bakım ve onarım, Dr Robert Wheeler Mark Nilan geçmiş ve şimdiki üyelerine de teşekkür ve NIH hibe 3RO1GM087308-02S1 ve 1P20RR024475-01A2 ve Maine Tarım ve Orman olur finansman için Station (Yayın Numarası 3303) Deney.

1.. Zebra balığı Bakım ve Onarım <ol><li> Hayvancılık: Kitle yumurtlamaya yetişkin zebrabalıkları olarak önce 13 tarif. 14, daha önce tarif edildiği gibi kökenli embriyolar toplayın. </li><li> Mikroenjeksiyon (istenirse) gibi gen ürünlerini aşırı ifade edilmesi için gen ürünleri ya da mRNA demonte morfolino oligonükleotitler ile Microinject 1-4 hücre aşamasında embriyoların zebra balığı, daha önce tarif edilen 15. <ol><li> Mock yeterli bir havuz korumak kontrolleri enjekte (en az 48 oturma, sahte deneysel manipüle balık 96 kuyu mikroplağı doldurmak için gerekli olan, kumanda balık ve 48 yaşam enjekte). </li></ol></li><li> Embriyoların bakımı: yumurta su içinde 28 ° C&#39;de derin petri tabaklarında embriyolar büyümek istenilen gelişimsel aşamada (a solunum burst cevabını zebra balığı embriyolar bu protokolü kullanılarak tespit edilebilir değildir kadar (60 ug / ml Instant Ocean Deniz Tuz suda otoklava damıtılmış) daha genç 2 gün) gübreleme 12 sonrası. Not: o olmuştur1-fenil-2-tiyoüre (PTU) veya golden/slc24a5 mutant zebrabalıkları kullanımı ya aracılığıyla zebra balığı embriyolarının pigmentasyonu önlemek önemli PMA (yayınlanmamış veriler, 48, 72 de test edilmiş embriyolar, ve 96 ile floresan uyarılmasını değiştirmediğini bserved hpf). <ol><li> Plastik bir transfer pipet ile günlük ölü embriyolar çıkarın. </li><li> Dikkatle eski yumurta suyu süzün ve her gün yeni yumurta su ile doldurmak. </li></ol></li><li> Dechorionate embriyolar: Deney gününde, embriyolar gibi dechorionate (embriyoların chorions hala ise) önce iki ince forseps 14 (bu, solunum patlaması deneyi de yetişkin zebrabalıkları 12 ve böbrek için ayrıntılı protokoller kesilerek böbrekler üzerinde gerçekleştirilebilir kullanılarak tarif yetişkin zebrafish diseksiyon önce) 16,17 tarif edilmiştir. </li></ol> 2. Çözüm Hazırlığı <ol><li> H2DCFDA bir stok solüsyonu hazırlayın: H2DCFDA 1 mg tartılır. <ol><li> Di1 mg / ml stok çözelti yapmak için, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1 ml H2DCFDA arasında ssolve 1 mg. </li><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, bu stok çözeltinin 22 ul alikotları olun. </li><li> Alüminyum folyo H2DCFDA stok solüsyonu hacimde sarın ve her H2DCFDA ışığa duyarlı olduğu için mümkün karanlıkta tutmak. </li><li> 3 aya kadar -20 ° C&#39;de saklayın H2DCFDA alikotları. </li></ol></li><li> DİKKAT - phorbol myristate asetat (PMA) bir stok solüsyonu hazırlayın: uygun kişisel koruyucu donanım (örneğin eldiven, gözlük ve maske) kullanarak PMA 1 mg tartılır. <ol><li> 1 mg / ml stok çözelti yapmak için DMSO içinde 1 ml PMA çözülür. </li><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 11 ul alikotları olun. </li><li> 3 aya kadar -80 ° C &#39;de PMA stok çözeltisi saklayın alikotları. </li></ol></li><li> H2DCFDA bir çalışma çözeltisi hazırlayın: Deney gününde, 1 ve 1 parça H2DCFDA stok solüsyonu ekleyerek bir H2DCFDA çalışma çözeltisi yapmakbölüm DMSO (500 ug / ml nihai konsantrasyon H2DCFDA). Örneğin, H2DCFDA stok çözeltisinden 20 ul ekleyin ve bir folyo 20 ul DMSO 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü tamamladı. </li><li> PMA bir çalışma çözeltisi hazırlayın: Deney gününde, serbest su (20 ug / ml PMA son konsantrasyon), nükleaz 49 kısım 1 parça PMA stok solüsyonu ekleyerek bir PMA çalışma çözeltisi hazırlanır. Örneğin, bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 490 ul nükleaz içermeyen su içinde 10 ul PMA stok çözelti seyreltik. </li><li> H2DCFDA bir dozlama çözeltisi hazırlandı: Deney gününde, yumurta su içinde 1 ug / ml H2DCFDA bir nihai konsantrasyonuna sahip bir çözelti elde H2DCFDA dozlama. Dozaj solüsyonların hacimleri, arzu edildiği gibi hazırlanan tadil edilmiş, ancak reaktiflerin son konsantrasyonları muhafaza emin olabilir. Böbrekler, yerine yumurta su (fenol kırmızısı olmaksızın,% 50 DMEM,% 50 F-12), Dulbecco değiştirilmiş Eagle medium/F-12 aynı hacimde kullanın. H2DCFDA 5 ml yapmakçözelti dozaj, konik santrifüj tüpü folyo ile sarılmış ve &#39;H&#39; etiketli bir 15 ml 5 yumurta ml su (ya da DMEM/F-12) transfer etmek için bir 5 ml serolojik pipet kullanın. <ol><li> Konik tüp &#39;H&#39; etiketli ve atın 15 ml yumurta su (veya DMEM/F-12) 10 ul çıkarın. </li><li> (Bu hacim 48 embriyo veya böbrek örneklerinde (tam 96 kuyu mikrolevhanın yarısı için yeterlidir) karıştırmak için &#39;H&#39; ve vorteks etiketli 15 ml konik tüp içine H2DCFDA çalışma çözeltisi 10 ul ekleyin ve bu kuyular düzeyi ölçümleri sağlayacak eşiğe). </li></ol></li><li> H2DCFDA + PMA bir dozlama çözeltisi hazırlandı: Deney gününde, son konsantrasyonları ile bir H2DCFDA + PMA dozlama solüsyonu yapmak: H2DCFDA - 1 ug / ml ve PMA - 400 ng / ml. , H2DCFDA + PMA dozlama çözeltisi 5 ml yapmak &#39;H + P&#39; etiketli yeni bir 15 mL konik tüp içine 5 yumurta ml su (ya da DMEM/F-12) transfer etmek için bir 5 ml serolojik pipet kullanın. <ol><li> _ 110 Kaldır6, konik tüp &#39;H + P&#39; olarak, atmak 15 ml yumurta, su (ya da DMEM/F-12) ile başlatılmıştır. </li><li> H2DCFDA çalışma çözeltisinin 10 ul, etiketli 15 ml konik tüp &#39;H + P&#39; ve karıştırmak için girdap (bu hacim 48 numune ya da tam bir 96 çukurlu mikrolevhanın diğer yarısı için yeterlidir içine PMA çalışma çözeltisi 100 ul ekle .) </li></ol></li><li> Buz üzerinde dozlama çözüm tutun. </li></ol> 3. Mikroplaka Okuyucu Programlama <ol><li> Mikrolevha okuyucu Güç: enstrüman hazırlayın. <ol><li> Işık kaynağı ısıtın. </li><li> Örn Uyarımı&#39;nı: floresan okumak için bir program kurmak 485 nm; Emisyon: 528 nm; Optik Pozisyon: Üst 510 nm; Hassasiyet: 65, önce okuma için bir 5 saniye sallayarak adım. </li></ol></li></ol> 4. 96 Peki Mikroplate Set Up (bkz. Şekil 2) <ol><li> Malzemeleri toplayın: dechorionated embriyolar, siyah 96 kuyu mikrolevhanm, P200 pipet ve yemekleri ile eldeipuçları, H2DCFDA ve H2DCFDA + PMA dozaj çözümleri ile buz kovası, çok kanallı P200 pipet, iki steril rezervuarlar, alüminyum folyo, ve makas. </li><li> 96 çukurlu bir mikrolevhanm her kuyuya Transferi Bir embriyo: kullanımlar makas, bir pipet kesmek şekilde açıklıktan uygun embriyolar veya böbrekler. <ol><li> Arzu edildiği gibi (her farklı için pipet değiştirme gerekli değildir 100 ul bir P200 pipet ayarlamak ve siyah, 96 gözlü mikroplaka kuyuların kadar yumurta içine suyun (ya da DMEM/F-12) ile birlikte bir embriyo transferi embriyo deneysel bir durum içinde örnek, ama) deneysel koşullar arasında ipuçlarını değiştirmek gerekli olabilir. Bu toplanan verilerin çarpık eğilimi olarak, artık chorions aktarılmasını önlemek için emin olun. Böbreklerin transferi için, (100 ul&#39;ye ayarlanır) daha büyük bir hacim pipet kullanılabilir ve gerekirse pipet uçları, daha büyük bir delik boyutu elde etmek için kesilebilir. Bu embriyo ya da böbrek numune olmadan kuyu birleştirmek için gerekli olabilir, fakat olabilirBazı deneysel manipülasyonlar kontrol etmek için dozaj çözümleri. </li></ol></li><li> Dozajlama çözümleri ekle: steril 25 ml&#39;lik hazne içine H2DCFDA dozaj çözüm dökün. <ol><li> Eş zamanlı olarak, 96 gözlü mikroplaka (H2DCFDA 500 ng / ml nihai konsantrasyon) ile ilgili bir kolon içine H2DCFDA dozlama çözeltisinin 100 ul pipet için bir çok kanallı pipet P200 ve sekiz ipuçlarını kullanın. </li><li> (Genellikle altı sütun ya da 48 kuyu bütün bir 96 sıra mikroplağı dolum varsa) istediğiniz gibi birçok sütun için bu (ipuçları değişen gerekli değildir) tekrarlayın. Kontrol embriyo örnekler ve deneysel olarak manipüle embriyo numunelerin yarısı yarısına bu solüsyonu (örneğin, bir 96 oyuklu mikro-plaka kurmak Şekil 2&#39;de gösterilmiştir, bu oyuklar (turuncu renkli), PMA ile uyarılan olmayan örneklerde eşiğe veriler sağlayacaktır) . </li><li> Yeni bir steril 25 mi rezervuara H2DCFDA + PMA dozlama çözeltisi dökün. </li><li> Bir çok kanallı pipet P200 ve simult sekiz ipuçlarını kullanınerişmesi (ipuçları değiştirme gerekli değildir, H2DCFDA-500 ng / ml PMA-200 ng / ml &#39;lik nihai konsantrasyonlar) 96 gözlü mikroplaka (Şekil 2&#39; de renkli kırmızı), geri kalan sütun halinde H2DCFDA + PMA dozlama çözeltisinin 100 ul pipet . </li></ol></li><li> Alüminyum folyo ile örtünüz. </li><li> De her bir çözüm homojenizasyonu için 150 rpm&#39;de, yaklaşık 20 saniye boyunca mikroplak çalkalayın. </li><li> Okumak değilken 28 ° C&#39;de inkübe mikroplağı. </li></ol> 5. Floresan Kantitasyonu <ol><li> Zamanda mikroplak oku = aşama 3.1.2 &#39;de tarif edilen parametreler kullanılarak PMA eklenmesinden sonra 0 sa. <ol><li> Ölçümlerinin istenilen zaman aralığında her birkaç dakikada alarak devam veya daha sonraki bir zaman noktasına kadar 28 ° C folyo sarılı mikroplağı inkübasyon ve ardından (örneğin 4 saat PMA eklenmesinden sonra) istenen bir zamanda uç nokta ölçü almak. </li></ol></li><li> Plastik bir t kullanınKuyulardan embriyolar almak için ransfer pipet. </li><li> Hayvan bakımı ve kullanım protokolü tricaine MS222 örneğin daldırma göre embriyolar Euthanize. </li><li> Biyolojik tehlikeli atık konteynerine mikroplakadan ve diğer tek kullanımlık malzemelerin imha. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> Eğer floresan değerleri (PMA, Tablo 1 eklenmesinden sonra örneğin 4 saat) karşılaştırmak istiyorum hangi zaman noktasında karar verin. </li><li> Bireysel PMA-kaynaklı kontrol grubunun floresans değerlerinden ortalama un kaynaklı kontrol grubunun floresan Değ.Çıkar. </li><li> Ve PMA olmadan deney grubu için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Iki sütun, kontrol + PMA grubu ve deney + PMA grupta (Tablo 2) bu normalize floresan değerleri saklayın. </li><li> Kontrol + PMA uzakta dışarı normalize floresan değerleri için ortalamalar ve standart sapmalar hesaplayınp ve deney + PMA grubudur. </li><li> (Tablo 2) istatistiksel önemini belirlemek için bir paylaşılmamış t-testi kullanılarak normalize floresan değerleri karşılaştırın. </li><li> Grafik kontrol grubu ve + PMA uygun standart sapmalar hata çubukları ile yansıtma deney + PMA grubu anlamına gelir. </li><li> Grafiği ve şekil açıklamasında anlamlılık düzeyini (Şekil 2) kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Medzhitov, R., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity:+Impact+on+the+Adaptive+Immune+Response.">Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response.</a> Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Maturation+of+the+Immune+System+in+Zebrafish,+Danio+rerio:+A+Gene+expression+Profiling.">Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling.</a> In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).</li><li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Profiling+and+Functional+Analyses+of+the+Zebrafish+Embryonic+Innate+Immune+Response+to+Salmonella+Infection.">Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection.</a> J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).</li><li>Ordas, A., Hegedus, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Sequencing+of+the+Innate+Immune+Transcriptomic+Response+of+Zebrafish+Embryos+to+Salmonella+Infection.">Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection.</a> Fish &amp; Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transgenic+Zebrafish+Model+of+Neutrophilic+Inflammation.">A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation.</a> Blood. 13, 3976-3978 (2006).</li><li>Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+Inflammation+by+Retrograde+Chemotaxis+of+Neutrophils+in+Transgenic+Zebrafish.">Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+Promoter+Transgenes+Direct+Macrophage-Lineage+Expression+in+Zebrafish.">mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish.</a> Blood. 4, 56-56 (2011).</li><li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Zebrafish+is+Mediated+by+the+Cystic+Fibrosis+Transmembrane+Conductance+Regulator.">Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.</a> Infect. Immun. 11, 4542 (2010).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Reveals+Role+of+Phagocyte+Oxidase+in+Limiting+Filamentous+Growth.">Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth.</a> Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).</li><li>Rotman, J., van Gils, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+of+Innate+Immune+Gene+Expression+in+Zebrafish+using+Reverse+Transcription+-+Multiplex+Ligation-Dependent+Probe+Amplification.">Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification.</a> BMC Research Notes. 4, (2011).</li><li>d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Chemically+Induced+Inflammation+Assay+in+Zebrafish.">A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish.</a> BMC Biology. 8, 151 (2010).</li><li>Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Respiratory+Burst+Assay+using+Zebrafish+Kidneys+and+Embryos.">Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos.</a> Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).</li><li>Avdesh, A., Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+Care+and+Maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+Laboratory:+An+Introduction.">Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Brothers, K. M., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Larvae.">Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney.">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish.">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).</li><li>Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Unconventional+Behavior+of+Neutrophils+in+Developing+Zebrafish.">Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li><li>Davidson, A. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'Definitive'+(and+'Primitive')+Guide+to+Zebrafish+Hematopoiesis.">The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis.</a> Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).</li><li>Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Stimuli+Change+Expression+of+Genes+and+Neutrophil+Function+in+Fathead+Minnow+Pimephales+promelas+Rafinesque.">Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque.</a> Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Scale+Gradient+of+Hydrogen+Peroxide+Mediates+Rapid+Wound+Detection+in+Zebrafish.">A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish.</a> Nature. 459, 996-1000 (2009).</li><li>Thisse, B., Pflumio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+zebrafish+genome+during+embryogenesis.+(NIH+R01+RR15402).">Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402).</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2001).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Release+Clones:+A+High+Throughput+Expression+Analysis.">Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis.</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Table+18.4.">Table 18.4.</a> The Molecular Probes Handbook. , .</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Fagositlerin birincil işlevi patojenleri tespit yutmak ve yok etmektir. Uygun bir solunum patlamaları üretmek için fagositoz yeteneği bu işlev için kritik öneme sahiptir. Böylece, solunum patlaması tepkisinin ölçümü kişi ve / veya deneysel manipülasyonlar tepki olarak grupları arasında genel olarak doğuştan gelen bağışıklık sağlık ve fonksiyon karşılaştırma yapmak için bir yöntemdir. Burada biz neden ölçmek ve tek tek zebra balığı embriyoların gruplar arasındaki solunum patlaması...

Doğal ve adaptif bağışıklık: Bağışıklık sistemi iki koldan oluşur. Doğuştan bağışıklık evrimsel adaptif bağışıklık daha eskidir. Omurgalılar hem doğal ve adaptif şubeleri sahip iken Omurgasız anda, sadece doğuştan bağışıklığı olması düşünülmektedir. Adaptif bağışıklık belirli patojenlere karşı özel ve uzun süreli bağışıklık sağlamasına rağmen, doğuştan gelen bağışıklık istilacı bakteri, virüs ve mantarlar için hemen bir yanıttır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir önemli yönü yabancı istilacıları yutmak ve yok etmek fagositlerce (örneğin makrofajlar, nötrofiller) iltihabı ve işe sonuçlanan sitokin ve kemokin salınımını içerir. Başarılı doğuştan gelen bağışıklık tepkileri içerir: mikroorganizmalara (1) tanıma, uygun sinyalizasyon kaskadlar (sitokinler ve kemokinlerin örn. ayırıcı) (2) indüksiyon; fagositik hücrelerin (3) düzgün gelişimi yeterli / numaraları; (4) Enfeksiyon bölgelerinde fagositlerin göç; patojenlerin (5) yutulma ve sardı mikroorganizmaların (6) imha. Bu adımlardan herhangi birinde bir eksiklik bunalan ana yol ve enfeksiyona yenik olabilir. Tüm bitki ve hayvanlarda patojenlere karşı ilk savunma hattı olduğu için sağlam bir doğal immün yanıt organizmaların sağlığı için çok önemlidir. Omurgalılarda, aynı zamanda adaptif bağışıklık tepkisini 1 güçlendirir. Bu nedenle, biz daha iyi anlamak ve onun işlevini optimize etmek için doğal immün yanıtın tüm yönleriyle değerlendirmek mümkün olduğu önemlidir. Çoğu model organizma Arabadopsis dan C arasında değişen, doğuştan gelen bağışıklık incelemek için kullanılır kültürlenmiş insan hücrelerine farelerine Drosophila için elegans. Doğuştan gelen bağışıklık çalışma zebrafish (Br.rerio) model sistemi kullanmanın bir avantajı, zebra balığı, doğal ve adaptif hem im ile, bir omurgalı olmasıdırimzalamıstır, henüz doğal ve adaptif bağışıklığın gelişmesi geçici ayrılmış edilir. Adaptif bağışıklık tamamen işlevsel hale gelene kadar Zebra balığı yaklaşık 4-6 hafta sonrası döllenme 2 oluştuğu, sadece enfeksiyona karşı koruma için doğuştan bağışıklık güveniyor. Genetik manipülasyon, optik berraklık ve hızlı, dış gelişimi için araçlara ek olarak, zebra balığı embriyoların savunma prensibi modu olarak doğuştan gelen bağışıklık in vivo olarak doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin karmaşıklıklarını çalışma için hangi basitleştirilmiş bir model sağlar. Çoklu protokolleri zebrafish embriyolarda doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin farklı yönleriyle değerlendirmek için geliştirilmiştir. Mikrodiziler ve RNAseq zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ile ortaya sitokin profilleri insanlarınkine benzeyen ve aynı zamanda doğal bağışıklık 3,4 beklenmedik genleri olduğunu ileri sürmüşlerdir onaylamıştır. Zebra balığı embriyo ve floresan, Transgen ve şeffaflıkpatojen ve zebrabalıkları ic suşları gerçek zamanlı in vivo dinamik konak-patojen etkileşimleri görselleştirme için izin verir. Nötrofil spesifik miyoloperoksidaz promoter 5,6 veya makrofaj özgü MPEG1 promoter 7 kontrolü altında GFP sentezleyen transgenik zebra balığı embriyolarının görselleştirmek ve ölçmek phagocyte göç lokalize enfeksiyonlar 8 siteleri yanı sıra fagositoz ve yıkımı ve görselleştirmek için mümkün kılmıştır floresan 8,9 patojenler etiketli. Zebrafish embriyoları, aynı zamanda, yüksek verimli deneyler ve kimyasal ekranlarının üretimi için uygundurlar. Bu duruma göre, enfeksiyon 10 ve kimyasal olarak neden olduğu hasarı 11 bölgelerine göç fagosit üzerine transcriptome analizi, yüksek verimli yöntemleri yakın zamanlarda geliştirilmiştir. Yukarıda listelenen tekniklerin hiçbiri nicel fagositlerce patojen imha son aşamasını değerlendirmek. Bu son aşamayuttu patojenleri öldürmek bir solunum patlaması (yani ROS üretimi ve diğer toksik bileşikler) içerir. Enzimi NADPH oksidaz fagositik hücrelerde ROS önemli bir kaynağıdır. Oksijene elektron transferi NADPH oksidaz enzimi sonuç alt birimlerin montajı, süperoksit anyonlar üreten. Daha sonra enzimatik reaksiyon yoluyla, süperoksit sonra hidrojen peroksit ve hidroklorik asitten (Şekil 1A) dönüştürülebilir. Bu patojenler öldürür ve bu nedenle, zebra balığı embriyoların solunum patlaması potansiyelinin ölçümü genel olarak doğuştan gelen bağışıklık sağlık göstergesidir fagositlerin solunum patlaması olduğunu. Bireysel embriyolar zebrafish 12 gruplar halinde solunum patlamaları ve ölçmek için bir floresan bazlı bir deney geliştirilmiştir. Bu deney, bir ticari olarak temin edilebilir, hücre-geçirgen boyanın floresan olmayan, indirgenmiş formu kullanır. Bu boya, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diasetat (H2DCFDA), floresan dönüştürülüroksidasyon üzerine cent bileşik, 2 &#39;, 7&#39;-diklorofloresandiasetat (DCF),. Fagosit solunum patlaması tarafından üretilen çeşitli ROS H2DCFDA okside ve floresan 24 üretebilirsiniz. Floresans görünümü zebrabalıkları grupları arasında solunum patlaması yanıtı ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Protein kinaz C agonist forbol miristat asetat (PMA) kimyasal olarak ROS üretimi için NADPH oksidaz uyarılması ve bu nedenle floresan okumaları (Şekil 1 B) arttırmak için kullanılır. Burada, bu zebra balığı embriyo solunum patlaması deneyinin değiştirilmiş ve optimize edilmiş bir versiyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu deney, zaman ve / veya deneysel manipülasyonlar (örneğin, morfolino aracılığında protein yok etme) tepki olarak tek zebrafish embriyoların gruplar arasındaki solunum patlamaları ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntemin kullanılması, diğer zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık deneyleri ile bağlantılı olarak, karmaşık ve kritik ilişkin daha eksiksiz bir görüntü sağlayacakDoğuştan gelen bağışıklık tepkisi.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

Fagosit solunum patlaması patojen enfeksiyonuna karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir parçası olan ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini içerir. ROS zehirlidir ve fagosite mikroorganizmaları öldürmek için işlev görürler. Fagosit türevi ROS in vivo miktar güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi için bir organizmanın yeteneği ile ilgili bilgi sağlar. Burada fagosit solunum patlaması kimyasal indüksiyon üzerine tüm Zebra balığı embriyolarının ROS ölçmek ve karşılaştırmak için bir protokol açıklar. Bu yöntem, ROS tarafından oksidasyonu ve onu takiben floresan haline olmayan bir floresan bileşik kullanır. Bireysel embriyolar, zebra balığı, bir mikroplaka oyuklarına pipetle ve solunum patlaması bir kimyasal uyarıcı ile ya da olmadan, bu flüorojenik alt-tabaka içinde inkübe edilir. Her çukurdaki floresans bir mikro levha okuyucusu kullanarak arzu edilen zaman noktalarında ölçülür. Floresans okumaları floresan arka plan ortadan kaldırmak için ayarlandı ve daha sonra işbirliği vardıreşleştirilmemiş t-testi kullanılarak mpared. Bu yöntem, farklı gelişim aşamalarında ve bu protein demonte, aşırı ekspresyonuna veya farmakolojik maddeler ile tedavi olarak deneysel manipülasyonlar tepki olarak zebrafish embriyoların solunum patlama potansiyelinin karşılaştırma sağlar. Bu yöntem aynı zamanda yetişkin zebrafish böbrekler ve diğer bazı balık türleri ikinci bütün Dissected böbrek veya hücre preparasyonlarda solunum patlaması yanıtını izlemek için kullanılabilir. Biz bu protokolün göreceli basitlik ve uyum mevcut protokolleri tamamlayacak ve daha doğuştan gelen bağışıklık tepkisini anlamaya çalışırlar araştırmacıların ilgi olacağına inanıyoruz.

Burada, biz 48 de Zebra balığı embriyolarının solunum patlaması yanıtı (yabani tip, AB arka) karşılaştıran veri ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) sağlar. Bizim kontrol grubu ve deney grubu olarak 72 hpf embriyolar gibi davranıyordu 48 hpf embriyolar. Kullanılan örneklem büyüklüğü 24 un kaynaklı embriyolar ve gelişim aşamasında başına 24 PMA-kaynaklı embriyolar oldu. (Bağıl Floresan Birimleri (RFU) in) Ham floresan okumaları 4 saat PMA eklenmesinden sonra mikroplak okunmasıyla elde e...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish at JoVE.com

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Doğuştan gelen bağışıklık tepkisi patojen enfeksiyonuna karşı koruma sağlar organizmalar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin önemli bir bileşeni, fagosit solunum patlaması, istila eden mikroorganizmaları öldürmek reaktif oksijen türleri oluşturur. Biz, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi kimyasal uyarılmaktadır zaman üretilen reaktif oksijen türleri rakamlarla bir solunum patlaması tahlili tarif eder.

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.5K Görüntüleme.  University of Maine.  Doğuştan gelen bağışıklık tepkisi patojen enfeksiyonuna karşı koruma sağlar organizmalar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin önemli bir bileşeni, fagosit solunum patlaması, istila eden mikroorganizmaları öldürmek reaktif oksijen türleri oluşturur. Biz, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi kimyasal uyarılmaktadır zaman üretilen reaktif oksijen türleri rakamlarla bir solunum patlaması tahlili tarif eder. 

Video: Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Bir fare modeli için değerlendirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı Staphylococcus aureus enfeksiyon

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...