Yazarlar prosedürünün başlangıç ​​ayarı için Emilie Mairey ve Emmanuel Donnadieu teşekkür etmek istiyorum.

1. İnsan konak hücre ve bakteri kültürü <ol><li> Geçit 1 ve% 5 (v / v) CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör 37 ° 9 arasında Kültür HUVECs. Passage hücreleri tek akış odaları (μ-Slaytlar VI) 75 cm 2 kültür şişeler ve deneysel kültürler bakım kültürleri sağlamak için tripsin / EDTA ile% 80 izdiham yaklaşım. </li><li> Geçişli olması şişeler, orta Çekme, 10 ml PBS ile hücrelerin yıkamak çekilme ve 1,5 ml tripsin / EDTA ile değiştirin. Hücreler 37 ° C inkübatör bir hücre kültürü az 5 dakika ayırmak için izin verin </li><li> Hücrelerin, hücre kültür ortamı 10 ml, 15 ml toplama tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri (200 gr),. Endo-SFM 4 ml% 10 ile desteklenen hücreler Askıya Alma (v / v) FBS ve üreticinin talimatlarına göre, bir Malassez odasında onları saymak. </li><li> Kanal (3x10 toplam 4) içine 30 ml süspansiyon başına 1x10 6 HUVEC hücrelerinin ul tanıtmak ve hücrelerin 3 saat 37 ° uymak ° nemlendirilmiş bir inkübatör,% 5 (v / v) CO 2 bir atmosfer sağlar . Kuyuları doldurmak için ek bir hacmi, Endo-SFM 120 ul ekleyin. Hücreler bir akışkan tek tabaka (Şekil 2) oluşturmalıdır. </li><li> N. büyütün Kellogg&#39;un takviyeleri ve 37 ° 5 mg / ml &#39;lik kloramfenikol, °% 5 içeren bir nemli bir atmosfer C (v / içeren GCB agar plakaları GFP (bir IPTG-indüklenebilir promotör kontrolü altında bu durumda gerginlik 8013 ifade GFP), ifade meningitidis v) 16 saat boyunca CO 2. </li></ol> 2. Bireysel bakteriler ilk yapışma hücreleri ev sahipliği yapacak <ol><li> Önceden ısıtılmış Endo-SFM 37 120 dakika için% 10 (v / v) FBS ve inkübe içeren ° C% 5 (v / içeren nemli bir atmosferde bir OD600 0.05 GCB agar plaklarına yetişen bakteri konsantrasyonu ayarlayın. v) altında CO 2, nazik sallayarak (130 rpm). Neden bütün kuluçka dönemi için kültür ortamı içine 1 mM IPTG ekleyerek GFP ifade. </li><li> 37 örnek sıcaklığını korumak için ısıtmalı bir platform ° C ile donatılmış bir inverted mikroskop aşamasında tek μ-Slayt yerleştirin. </li><li> % 2 ile desteklenmiş önceden ısıtılmış Endo-SFM (v / v) FBS steril bir cam behere dökün ve bu ortamda 50 ml steril bir şırınga doldurun. &quot;Giriş&quot; tüp şırıngaya takın ve orta getirerek doldurun. </li><li> Odasına hava tanıtan önlemek için, bakım, μ-Slide &quot;giriş&quot; boru bağlayın. Sonra, dikkatli bir şekilde yapıştırmayın, diğer ucunu da &quot;çıkış&quot; tüp ve &quot;çıkış&quot; oda yaklaşık 1 cm mesafe orta kanal doldurun. </li><li> Bakteriyel OD600 ölçün ve 0.15 ila% 2 (v / v) FBS içeren Endo-SFM ayarlayabilirsiniz. Bireysel bakteriler bakmak için, herhangi bir agrega bakteriyel örnek dinç vorteks bozulacak gerekir. </li><li> Endo-SFM Yeri 100 ul rezervuar içine% 2 (v / v) FBS orta ile desteklenmiş ve 100 ul kalan bakteri agrega örnekleme önlemek için vortekslenmiş bir çözüm yukarıdan alınan bakteri çözüm ekleyin. </li><li> Μ-Slayt 200 ul hacmi odasına bakteri enjekte stopcock çevirerek dikkatlice tanıtmak. </li><li> % 2 içeren Endo-SFM (v / v) FBS, bakımı, 37 ° C ısıtılmış platform, 0.044 dynes / cm 2 15 dakika yapışması ile uyumlu bir kayma gerilmesi ile bir şırınga pompası kullanarak odasına tanıtın </li></ol> Video 1 veya 3 rakam örneği için Bkz. Bu adımdan sonra, bölüm 3, 4 veya 6 ya kadar hareket ettirin. 3. Konak hücreleri için bireysel bakterilerin ilk yapışma Niceleme <ol><li> 15 dakika boyunca ilk yapışma sonra sıvı hala dolaşımda iken, rastgele on alanları görüntüler elde. </li><li> ImageJ yazılım 8, adherant bakterilerin alan başına ortalama sayısı erişmek için kullanarak elde edilen görüntüleri analiz eder. Aşağıdaki şekilde yapılır: her şeyden önce, her bir görüntü hücrelerin arka plan en aza indirerek, bireysel kalarak floresan bakteri vurgulamak için &quot;Image&quot; menüsünde bulunan &quot;Eşik&quot; penceresini kullanarak eşiklenir. Sonra, her bir bakteri, Plug-In &quot;Hücre Sayacı&quot; (kullanarak sayılır <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Her görüntü için verileri bir Excel tablo ve alan başına yapışık bakterilerin ortalama sayısı ölçmek için ortalaması alınır. </li></ol> 4. Konak hücreleri için yapışık bireysel bakterilerin akış direnci Ölçüm <ol><li> Programı şırınga pompası, 3, 100 dynes / 5 dakika boyunca cm 2 arasında değişen kayma stres oluşturmak için set- up. </li><li> 5 dakika sonunda, adım 3.1 &#39;de açıklandığı gibi rastgele seçilen on alanları kazanmak, ancak akışı ile pr durduedinimi IOR. </li><li> Adım 3.2 &#39;de açıklandığı gibi elde edilen görüntüleri analiz ve alan başına kalan bakteri sayısı ortalaması ölçmek. </li></ol> 5. Microcolony için izole bir yapışkan bakteri büyüme Ölçüm <ol><li> Endo-SFM% 10 (v / v) FBS, bakımı, 37 ° C ısıtılmış platformu ile, birkaç saat için seçilen kayma gerilmesi ile bir şırınga pompası kullanılarak odasına içeren tanıtın Her 5 dakikada bir kare gerçek zamanlı video mikroskopi için kayıt görüntüler. </li><li> Video mikroskopi ardından, şırınga pompası kapatarak kayma gerilmesi durdurmak, 2-3 ek görüntüleri kazanmak ve daha sonra yazılım üzerinde görüntü elde etme sırası durdurmak. Bakteri oluşumunu bir örnek video 2 görülebilir. </li></ol> 6. Yapışık bakteriyel mikrokoloniler akış direnci ölçümü <ol><li> Hücresel yüzey oluşumuna büyük mikrokoloniler sonra (step5.2) akış uygulamadan önce 2-3 hücreler görüntüleri (faz kontrast) ve bakteri (GFP-floresans) kazanmak. Deney geri kalanı için, satın alma protokolü sadece floresan izleyecektir. </li><li> Her 5 saniyede bir kare 5 dakika (300-100 dynes / cm 2) ve kayıt görüntüleri için yüksek kayma gerilmesi uygulanması. </li><li> Kayma gerilmesi şırınga pompası kapatarak durdurun, 2-3 ek görüntüler elde edin ve sonra yazılım üzerinde görüntü elde etme sırası durdurmak. </li><li> Sonra, &quot;çıkış&quot; tüp ilk çıkarın ve dikkatli bir şekilde, kanal boşalmasını önlemek için ve ardından &quot;giriş&quot; tüp çıkarmadan önce kuyuları doldurmak için, önceden ısıtılmış taze orta ekleyin. </li><li> Kantitatif bakteriyel direnç kayma stres etkisini belirlemek için, aşağıdaki gibi bir kaplama tahlil yapılabilir: kalan orta toplamak ve μ-Slayt kanal (hem yıkar kalan orta kaldırır 120 ul, PBS ile iki kez yıkayın Ayrıca toplanan). </li><li> 37 ° &#39;de 5 dakika süreyle 50 ul tripsin / EDTA ilavesi ile enfekte olan hücreleri ayırın ve bu müstakil örnek önceki adımda toplanan süspansiyon ile karıştırın. </li><li> PBS ve plaka GCB agar plakları üzerine üç nüsha halinde 10 ul fraksiyonu, seri dilüsyonları, 37 plaka inkübasyondan sonra, ertesi gün koloni oluşturan birim (CFU) sayısı belirlemek amacıyla gerçekleştir ° bir kuluçka C % 5 (v / v) CO 2. </li></ol> Videolar 3 ve 4 pilV mutant vahşi tip suşu karşılaştırın. 7. Mikrokoloniler gelen Bakteriyel dekolmanı <ol><li> 2.1 ve 2.8 için gerekli adımları tekrarlayarak akış odasında hücreleri enfekte ve enfeksiyon 30 dakika boyunca devam etmek için izin verir. </li><li> 2 dakikalık bir süre için 10 dynes / cm 2 akımını artırarak bağlanmamış bakteri çıkarın ve enfeksiyon 2s için devam etmek için izin verir. </li><li> 0.15 dynes / cm 2 akış azaltın. </li><li> Her saat, orta akışını odasına çıkan bir damla toplamak. </li><li> GCB agar plaklarına örnekleri ve plaka bunları seri dilüsyonları gerçekleştirin. </li><li> 37 plaka inkübasyondan sonra ertesi gün sayısı koloni oluşturan birim (CFU), ° C,% 5 (v / v), CO 2 ile bir inkübatör belirleyin . </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> Şekil 1: Farklı adımları prosedürü akış varlığı gözlenen ve ölçülebilir bir hücresel tek tabaka. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> Şekil 2: (kayma gerilmesi yokluğu) bir deney başında akışını odasında Endotel hücre tek tabaka. Hakkında 50 endotel hücreleri, bir alt-konfluent tek tabaka düzenlenmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> Şekil 3: hücre yüzeyinde bakterilerin ilk yapışma grafik gösterimi. Üç alanlar için Değerler (0044 dynes / cm 2) bekleniyor alan-alan varyasyon bir fikir vermek için gösterilir. Video 1 (0044 dynes / cm 2) zamanın bir fonksiyonu olarak hücresel tek tabaka bakterilerin ilk yapışma Görselleştirme. GFP-ifade bakteriler akan orta yönünü takip ediyoruz. Film 60 kat hızlanır, gerçek video süresi 10 dakikadır. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Video 2 ilk yapışma bakteri sonra 7 saatlik bir süre için (1000 kat hızlandırılmış) hücre yüzeyinde tomurcuklanmaya izin verildi . <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Video 3 Silahların Yayılmasının Önlenmesi sonra hücresel yüzey mekanikmikrokoloniler al direnç ama vahşi tip mikrokoloniler dayanıklı hızlandırılmış 60 kat, 5 dakika 10 dynes / cm 2 kesme stres düzeyini artırarak tarafından test edildi . <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> PilV mutant tarafından oluşturulan video 4 mikrokoloniler akışını artırmak (10 dynes / cm 2) tarafından bozulur. Bu mutant mikrokoloniler altında plazma zarı yeniden şekillenme ikna etmek için başarısız olur ve böylece daha artmış shear stresin (video 60 kat hızlanır) 5 son derece hassas. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kayma gerilmesi ve genellikle biyoloji mekanik yönlerini önemi giderek kabul edilmektedir. Örneğin lenfositler yapışma ve damar duvarının üzerinde yuvarlanan süreci proteinlerin selektin ailesi son derece adapte yapıştırıcı özellikleri, bu süreç içinde kayma gerilmesi tanıtan kabul edilmiştir. Gram-negatif bakteriler Neisseria meningitidis yukarıda açıklanan prosedür uygulandı ancak geniş bir yelpazede patojenlerin uygulanabilir olmalıdır. Kayma gerilmesi önemi diğer patojenler ve diğer enfeksiyon siteleri için de gösterilmiştir. Bakteriyel yapışma kayma gerilmesi klimalı üropatojen Escherichia coli (UPEC) 9 bulundu FimH adhesin çalışma ile tarif edilmiştir. Selektinler benzer şekilde, FimH ve konak hücre reseptör arasındaki etkileşimi kesme bağlı mekanik kuvvetlerin 9 ve enterotoksijenik E.coli CfaE adhesin güçlendirilmelidir gösterildi bağımlı bir kayma ile bağırsak epitel hücrelerine yapışma aracılık etmek de bildirilmiştir mekanizması 10. Streptococcus agalactiae pili 11 akış koşulları altında epitel hücreleri bu patojen bağlılık için gerekli olduğunu bu bölümde açıklanan laminer akış odasına tahlil protokol kullanarak bildirdi. Bu çalışmalar bizim akışı odasına tahlil kayma gerilmesi koşulları altında konak hücre-patojen etkileşimleri araştırmak için faydalı bir araç olduğunu teyit etmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 akış kiti </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Şırınga Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon Boru R3603 3.2 x 4.8mm </td><td> Fisher-Bilimsel </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Erkek luer 3-yollu valfli, 2 dişi luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Şırınga pompası </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Ters mikroskop Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD veya ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ yazılımı </td><td> NIH </td><td> SORULAR VE CEVAPLAR ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

Bakteriyel enfeksiyonlar sırasında patojen ve ev sahibi arasındaki etkileşimlerin bir dizi oluşur. Patogenezinde konak hücre yüzeyine bakteriyel yapışma genellikle ilk ve belirleyici bir adımdır. Deneysel yapışma çoğunlukla statik koşullarda eğitim olmasına rağmen yapışma aslında akan sıvı varlığında gerçekleşir. Bakteri ve ev sahibi arasında ilk karşılaştığında genellikle mukus epitel hücrelerinin yüzeyi boyunca akan mukozal düzeyde, ağız, akciğer, bağırsak, göz, vs meydana gelir. Daha sonra enfeksiyon, patojenlerin bazen hayatı tehdit eden septisemi, sepsis ve menenjit gibi hastalıklara neden kan dolaşımını erişmek. Bu enfeksiyonların bir belirleyici özelliği, bu patojenlerin kan dolaşan varlığı endotel hücreleri ile etkileşim yeteneği. Patojen mekanik bir güç üretir, çünkü, örneğin sıvı, mukus veya kan akan varlığı, yapışma belirler. Sıvı bir akan etkisi karakterize etmek için genellikle dynes / cm 2 olarak ifade sabit bir duvarına yakın hareket eden bir sıvı, birim alan başına sarf teğet güçtür kayma gerilmesi, kavramı ifade eder. Kayma gerilmesi Şiddetleri farklı damarları türüne göre büyük farklılıklar gösterir, boyut, organ, konumu vb (0-100 dynes / cm 2). Kılcal damarlarda kan dolaşımı çok düşük kayma gerilmesi değerlerine ulaşmak ve hatta geçici olarak birkaç dakika 1 birkaç saniye arasında değişen dönemlerde durdurabilirsiniz. Arteriollerde spektrum kayma gerilmesi Diğer taraftan 100 dynes / cm 2 2 ulaşabilirsiniz. Örneğin gibi farklı biyolojik süreçlerin kayma gerilmesi etkisi açıkça lökositlerin endotel 3 ile etkileşim sırasında kanıtlanmıştır. Bakteriyel yapışma sürecinde bu mekanik parametre dikkate almak için tek bir akış kullanımı odasının 4 dayalı deneysel bir prosedür avantaj aldı. Konak hücrelerine akış odasında yetiştirilen ve floresan bakterilerin bir şırınga pompası tarafından kontrol akış tanıtıldı. Biz başlangıçta bakteriyel patojen Neisseria meningitidis, septisemi ve menenjit sorumlu bir Gram-negatif bakteri soruşturma duruldu. Bize bakterilerin yeteneği üzerinde kayma stres üzerindeki etkilerini incelemek için izin prosedürü burada açıklanan hücre yüzeyinde 5 prolifere hücreler 1, uymak ve yeni siteler 6 (Şekil 1) kolonize ayırmak için. Tamamlayıcı teknik bilgiler referans 7 bulunabilir. Burada sunulan Kesme gerilmesi değerleri, literatürde bulunan değerleri temsil etmek için önceki deneyimi 1 ve dayalı seçildi . Protokol geniş bir yelpazede çalışma hedeflerine bağlı olarak belirli ayarlamalar ile patojenler için geçerli olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion at JoVE.com

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Görüntüleme.  INSERM U970. Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.

Video: Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...