Yazarlar prosedürünün başlangıç ​​ayarı için Emilie Mairey ve Emmanuel Donnadieu teşekkür etmek istiyorum.

1. İnsan konak hücre ve bakteri kültürü <ol><li> Geçit 1 ve% 5 (v / v) CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör 37 ° 9 arasında Kültür HUVECs. Passage hücreleri tek akış odaları (μ-Slaytlar VI) 75 cm 2 kültür şişeler ve deneysel kültürler bakım kültürleri sağlamak için tripsin / EDTA ile% 80 izdiham yaklaşım. </li><li> Geçişli olması şişeler, orta Çekme, 10 ml PBS ile hücrelerin yıkamak çekilme ve 1,5 ml tripsin / EDTA ile değiştirin. Hücreler 37 ° C inkübatör bir hücre kültürü az 5 dakika ayırmak için izin verin </li><li> Hücrelerin, hücre kültür ortamı 10 ml, 15 ml toplama tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri (200 gr),. Endo-SFM 4 ml% 10 ile desteklenen hücreler Askıya Alma (v / v) FBS ve üreticinin talimatlarına göre, bir Malassez odasında onları saymak. </li><li> Kanal (3x10 toplam 4) içine 30 ml süspansiyon başına 1x10 6 HUVEC hücrelerinin ul tanıtmak ve hücrelerin 3 saat 37 ° uymak ° nemlendirilmiş bir inkübatör,% 5 (v / v) CO 2 bir atmosfer sağlar . Kuyuları doldurmak için ek bir hacmi, Endo-SFM 120 ul ekleyin. Hücreler bir akışkan tek tabaka (Şekil 2) oluşturmalıdır. </li><li> N. büyütün Kellogg&#39;un takviyeleri ve 37 ° 5 mg / ml &#39;lik kloramfenikol, °% 5 içeren bir nemli bir atmosfer C (v / içeren GCB agar plakaları GFP (bir IPTG-indüklenebilir promotör kontrolü altında bu durumda gerginlik 8013 ifade GFP), ifade meningitidis v) 16 saat boyunca CO 2. </li></ol> 2. Bireysel bakteriler ilk yapışma hücreleri ev sahipliği yapacak <ol><li> Önceden ısıtılmış Endo-SFM 37 120 dakika için% 10 (v / v) FBS ve inkübe içeren ° C% 5 (v / içeren nemli bir atmosferde bir OD600 0.05 GCB agar plaklarına yetişen bakteri konsantrasyonu ayarlayın. v) altında CO 2, nazik sallayarak (130 rpm). Neden bütün kuluçka dönemi için kültür ortamı içine 1 mM IPTG ekleyerek GFP ifade. </li><li> 37 örnek sıcaklığını korumak için ısıtmalı bir platform ° C ile donatılmış bir inverted mikroskop aşamasında tek μ-Slayt yerleştirin. </li><li> % 2 ile desteklenmiş önceden ısıtılmış Endo-SFM (v / v) FBS steril bir cam behere dökün ve bu ortamda 50 ml steril bir şırınga doldurun. &quot;Giriş&quot; tüp şırıngaya takın ve orta getirerek doldurun. </li><li> Odasına hava tanıtan önlemek için, bakım, μ-Slide &quot;giriş&quot; boru bağlayın. Sonra, dikkatli bir şekilde yapıştırmayın, diğer ucunu da &quot;çıkış&quot; tüp ve &quot;çıkış&quot; oda yaklaşık 1 cm mesafe orta kanal doldurun. </li><li> Bakteriyel OD600 ölçün ve 0.15 ila% 2 (v / v) FBS içeren Endo-SFM ayarlayabilirsiniz. Bireysel bakteriler bakmak için, herhangi bir agrega bakteriyel örnek dinç vorteks bozulacak gerekir. </li><li> Endo-SFM Yeri 100 ul rezervuar içine% 2 (v / v) FBS orta ile desteklenmiş ve 100 ul kalan bakteri agrega örnekleme önlemek için vortekslenmiş bir çözüm yukarıdan alınan bakteri çözüm ekleyin. </li><li> Μ-Slayt 200 ul hacmi odasına bakteri enjekte stopcock çevirerek dikkatlice tanıtmak. </li><li> % 2 içeren Endo-SFM (v / v) FBS, bakımı, 37 ° C ısıtılmış platform, 0.044 dynes / cm 2 15 dakika yapışması ile uyumlu bir kayma gerilmesi ile bir şırınga pompası kullanarak odasına tanıtın </li></ol> Video 1 veya 3 rakam örneği için Bkz. Bu adımdan sonra, bölüm 3, 4 veya 6 ya kadar hareket ettirin. 3. Konak hücreleri için bireysel bakterilerin ilk yapışma Niceleme <ol><li> 15 dakika boyunca ilk yapışma sonra sıvı hala dolaşımda iken, rastgele on alanları görüntüler elde. </li><li> ImageJ yazılım 8, adherant bakterilerin alan başına ortalama sayısı erişmek için kullanarak elde edilen görüntüleri analiz eder. Aşağıdaki şekilde yapılır: her şeyden önce, her bir görüntü hücrelerin arka plan en aza indirerek, bireysel kalarak floresan bakteri vurgulamak için &quot;Image&quot; menüsünde bulunan &quot;Eşik&quot; penceresini kullanarak eşiklenir. Sonra, her bir bakteri, Plug-In &quot;Hücre Sayacı&quot; (kullanarak sayılır <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Her görüntü için verileri bir Excel tablo ve alan başına yapışık bakterilerin ortalama sayısı ölçmek için ortalaması alınır. </li></ol> 4. Konak hücreleri için yapışık bireysel bakterilerin akış direnci Ölçüm <ol><li> Programı şırınga pompası, 3, 100 dynes / 5 dakika boyunca cm 2 arasında değişen kayma stres oluşturmak için set- up. </li><li> 5 dakika sonunda, adım 3.1 &#39;de açıklandığı gibi rastgele seçilen on alanları kazanmak, ancak akışı ile pr durduedinimi IOR. </li><li> Adım 3.2 &#39;de açıklandığı gibi elde edilen görüntüleri analiz ve alan başına kalan bakteri sayısı ortalaması ölçmek. </li></ol> 5. Microcolony için izole bir yapışkan bakteri büyüme Ölçüm <ol><li> Endo-SFM% 10 (v / v) FBS, bakımı, 37 ° C ısıtılmış platformu ile, birkaç saat için seçilen kayma gerilmesi ile bir şırınga pompası kullanılarak odasına içeren tanıtın Her 5 dakikada bir kare gerçek zamanlı video mikroskopi için kayıt görüntüler. </li><li> Video mikroskopi ardından, şırınga pompası kapatarak kayma gerilmesi durdurmak, 2-3 ek görüntüleri kazanmak ve daha sonra yazılım üzerinde görüntü elde etme sırası durdurmak. Bakteri oluşumunu bir örnek video 2 görülebilir. </li></ol> 6. Yapışık bakteriyel mikrokoloniler akış direnci ölçümü <ol><li> Hücresel yüzey oluşumuna büyük mikrokoloniler sonra (step5.2) akış uygulamadan önce 2-3 hücreler görüntüleri (faz kontrast) ve bakteri (GFP-floresans) kazanmak. Deney geri kalanı için, satın alma protokolü sadece floresan izleyecektir. </li><li> Her 5 saniyede bir kare 5 dakika (300-100 dynes / cm 2) ve kayıt görüntüleri için yüksek kayma gerilmesi uygulanması. </li><li> Kayma gerilmesi şırınga pompası kapatarak durdurun, 2-3 ek görüntüler elde edin ve sonra yazılım üzerinde görüntü elde etme sırası durdurmak. </li><li> Sonra, &quot;çıkış&quot; tüp ilk çıkarın ve dikkatli bir şekilde, kanal boşalmasını önlemek için ve ardından &quot;giriş&quot; tüp çıkarmadan önce kuyuları doldurmak için, önceden ısıtılmış taze orta ekleyin. </li><li> Kantitatif bakteriyel direnç kayma stres etkisini belirlemek için, aşağıdaki gibi bir kaplama tahlil yapılabilir: kalan orta toplamak ve μ-Slayt kanal (hem yıkar kalan orta kaldırır 120 ul, PBS ile iki kez yıkayın Ayrıca toplanan). </li><li> 37 ° &#39;de 5 dakika süreyle 50 ul tripsin / EDTA ilavesi ile enfekte olan hücreleri ayırın ve bu müstakil örnek önceki adımda toplanan süspansiyon ile karıştırın. </li><li> PBS ve plaka GCB agar plakları üzerine üç nüsha halinde 10 ul fraksiyonu, seri dilüsyonları, 37 plaka inkübasyondan sonra, ertesi gün koloni oluşturan birim (CFU) sayısı belirlemek amacıyla gerçekleştir ° bir kuluçka C % 5 (v / v) CO 2. </li></ol> Videolar 3 ve 4 pilV mutant vahşi tip suşu karşılaştırın. 7. Mikrokoloniler gelen Bakteriyel dekolmanı <ol><li> 2.1 ve 2.8 için gerekli adımları tekrarlayarak akış odasında hücreleri enfekte ve enfeksiyon 30 dakika boyunca devam etmek için izin verir. </li><li> 2 dakikalık bir süre için 10 dynes / cm 2 akımını artırarak bağlanmamış bakteri çıkarın ve enfeksiyon 2s için devam etmek için izin verir. </li><li> 0.15 dynes / cm 2 akış azaltın. </li><li> Her saat, orta akışını odasına çıkan bir damla toplamak. </li><li> GCB agar plaklarına örnekleri ve plaka bunları seri dilüsyonları gerçekleştirin. </li><li> 37 plaka inkübasyondan sonra ertesi gün sayısı koloni oluşturan birim (CFU), ° C,% 5 (v / v), CO 2 ile bir inkübatör belirleyin . </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> Şekil 1: Farklı adımları prosedürü akış varlığı gözlenen ve ölçülebilir bir hücresel tek tabaka. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> Şekil 2: (kayma gerilmesi yokluğu) bir deney başında akışını odasında Endotel hücre tek tabaka. Hakkında 50 endotel hücreleri, bir alt-konfluent tek tabaka düzenlenmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> Şekil 3: hücre yüzeyinde bakterilerin ilk yapışma grafik gösterimi. Üç alanlar için Değerler (0044 dynes / cm 2) bekleniyor alan-alan varyasyon bir fikir vermek için gösterilir. Video 1 (0044 dynes / cm 2) zamanın bir fonksiyonu olarak hücresel tek tabaka bakterilerin ilk yapışma Görselleştirme. GFP-ifade bakteriler akan orta yönünü takip ediyoruz. Film 60 kat hızlanır, gerçek video süresi 10 dakikadır. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Video 2 ilk yapışma bakteri sonra 7 saatlik bir süre için (1000 kat hızlandırılmış) hücre yüzeyinde tomurcuklanmaya izin verildi . <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Video 3 Silahların Yayılmasının Önlenmesi sonra hücresel yüzey mekanikmikrokoloniler al direnç ama vahşi tip mikrokoloniler dayanıklı hızlandırılmış 60 kat, 5 dakika 10 dynes / cm 2 kesme stres düzeyini artırarak tarafından test edildi . <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> PilV mutant tarafından oluşturulan video 4 mikrokoloniler akışını artırmak (10 dynes / cm 2) tarafından bozulur. Bu mutant mikrokoloniler altında plazma zarı yeniden şekillenme ikna etmek için başarısız olur ve böylece daha artmış shear stresin (video 60 kat hızlanır) 5 son derece hassas. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kayma gerilmesi ve genellikle biyoloji mekanik yönlerini önemi giderek kabul edilmektedir. Örneğin lenfositler yapışma ve damar duvarının üzerinde yuvarlanan süreci proteinlerin selektin ailesi son derece adapte yapıştırıcı özellikleri, bu süreç içinde kayma gerilmesi tanıtan kabul edilmiştir. Gram-negatif bakteriler Neisseria meningitidis yukarıda açıklanan prosedür uygulandı ancak geniş bir yelpazede patojenlerin uygulanabilir olmalıdır. Kayma gerilmesi önemi diğer patojenler ve diğer enfeksiyon siteleri için de gösterilmiştir. Bakteriyel yapışma kayma gerilmesi klimalı üropatojen Escherichia coli (UPEC) 9 bulundu FimH adhesin çalışma ile tarif edilmiştir. Selektinler benzer şekilde, FimH ve konak hücre reseptör arasındaki etkileşimi kesme bağlı mekanik kuvvetlerin 9 ve enterotoksijenik E.coli CfaE adhesin güçlendirilmelidir gösterildi bağımlı bir kayma ile bağırsak epitel hücrelerine yapışma aracılık etmek de bildirilmiştir mekanizması 10. Streptococcus agalactiae pili 11 akış koşulları altında epitel hücreleri bu patojen bağlılık için gerekli olduğunu bu bölümde açıklanan laminer akış odasına tahlil protokol kullanarak bildirdi. Bu çalışmalar bizim akışı odasına tahlil kayma gerilmesi koşulları altında konak hücre-patojen etkileşimleri araştırmak için faydalı bir araç olduğunu teyit etmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 akış kiti </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Şırınga Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon Boru R3603 3.2 x 4.8mm </td><td> Fisher-Bilimsel </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Erkek luer 3-yollu valfli, 2 dişi luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Şırınga pompası </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Ters mikroskop Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD veya ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ yazılımı </td><td> NIH </td><td> SORULAR VE CEVAPLAR ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

Bakteriyel enfeksiyonlar sırasında patojen ve ev sahibi arasındaki etkileşimlerin bir dizi oluşur. Patogenezinde konak hücre yüzeyine bakteriyel yapışma genellikle ilk ve belirleyici bir adımdır. Deneysel yapışma çoğunlukla statik koşullarda eğitim olmasına rağmen yapışma aslında akan sıvı varlığında gerçekleşir. Bakteri ve ev sahibi arasında ilk karşılaştığında genellikle mukus epitel hücrelerinin yüzeyi boyunca akan mukozal düzeyde, ağız, akciğer, bağırsak, göz, vs meydana gelir. Daha sonra enfeksiyon, patojenlerin bazen hayatı tehdit eden septisemi, sepsis ve menenjit gibi hastalıklara neden kan dolaşımını erişmek. Bu enfeksiyonların bir belirleyici özelliği, bu patojenlerin kan dolaşan varlığı endotel hücreleri ile etkileşim yeteneği. Patojen mekanik bir güç üretir, çünkü, örneğin sıvı, mukus veya kan akan varlığı, yapışma belirler. Sıvı bir akan etkisi karakterize etmek için genellikle dynes / cm 2 olarak ifade sabit bir duvarına yakın hareket eden bir sıvı, birim alan başına sarf teğet güçtür kayma gerilmesi, kavramı ifade eder. Kayma gerilmesi Şiddetleri farklı damarları türüne göre büyük farklılıklar gösterir, boyut, organ, konumu vb (0-100 dynes / cm 2). Kılcal damarlarda kan dolaşımı çok düşük kayma gerilmesi değerlerine ulaşmak ve hatta geçici olarak birkaç dakika 1 birkaç saniye arasında değişen dönemlerde durdurabilirsiniz. Arteriollerde spektrum kayma gerilmesi Diğer taraftan 100 dynes / cm 2 2 ulaşabilirsiniz. Örneğin gibi farklı biyolojik süreçlerin kayma gerilmesi etkisi açıkça lökositlerin endotel 3 ile etkileşim sırasında kanıtlanmıştır. Bakteriyel yapışma sürecinde bu mekanik parametre dikkate almak için tek bir akış kullanımı odasının 4 dayalı deneysel bir prosedür avantaj aldı. Konak hücrelerine akış odasında yetiştirilen ve floresan bakterilerin bir şırınga pompası tarafından kontrol akış tanıtıldı. Biz başlangıçta bakteriyel patojen Neisseria meningitidis, septisemi ve menenjit sorumlu bir Gram-negatif bakteri soruşturma duruldu. Bize bakterilerin yeteneği üzerinde kayma stres üzerindeki etkilerini incelemek için izin prosedürü burada açıklanan hücre yüzeyinde 5 prolifere hücreler 1, uymak ve yeni siteler 6 (Şekil 1) kolonize ayırmak için. Tamamlayıcı teknik bilgiler referans 7 bulunabilir. Burada sunulan Kesme gerilmesi değerleri, literatürde bulunan değerleri temsil etmek için önceki deneyimi 1 ve dayalı seçildi . Protokol geniş bir yelpazede çalışma hedeflerine bağlı olarak belirli ayarlamalar ile patojenler için geçerli olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion at JoVE.com

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Görüntüleme.  INSERM U970. Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.