Silikon Usta Kalıp İmalat Litografi Malzemeler: <ul><li> 75 mm Silikon gofret </li><li> SU-8 2 Negatif rezist (Microchem Boston, MA) </li><li> N2 </li></ul> Yöntem: <ol><li> 2 saat boyunca 120 ° C&#39;de Si levhası dehydrate. </li><li> 7 dakika UV ozon tedavi yüzeyi organik kaldırın. </li><li> N2 darbe yüzey parçacık kaldırmak için. </li><li> Uygula SU-8 yüzeyinin% 70 (75 mm gofret ~ 10 ml) kapsayacak şekilde 2. </li><li> 300 dev / s hızlanma ile 20 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de Spin. </li><li> 95 ° C&#39;ye kadar oda sıcaklığında bir ocak ve rampa gofret yerleştirin </li><li> Fotorezist Softbake 15 dakika boyunca 95 ° C </li><li> Sel gofret maruz 20 - 25 mJ/cm2 doz 365 nm (I-line) alt tabaka oluşturur. </li><li> Uygula SU-8 ikinci fotorezist katman için 2. </li><li> 300 dev / s hızlanma yaklaşık 11 mikron kalınlık film için 20 saniye boyunca 550 rpm&#39;de Spin. </li><li> 65 ° C&#39;ye kadar oda sıcaklığında bir ocak ve rampa gofret yerleştirin </li><li> 65 ° C&#39;de 5 dakika gofret Softbake. </li><li> 65 ocak Rampa ° C - 95 ° C </li><li> Gofret Softbake 55 dakika için 95 ° C </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında serin gofret. </li><li> Gofret mPAD maske aynı hizaya getirin ve 95 için maruz - 365 nm (I-line) 100 mJ/cm2 doz. </li><li> 95 ° C&#39;ye kadar oda sıcaklığında bir ocak ve rampa gofret yerleştirin </li><li> Maruziyet sonrası 95 ° C fotorezist fırında 25 dakika </li></ol> Geliştirmek Malzemeler: <ul><li> 100mm cam yemekleri (5) </li><li> Propilen glikol, metil eter asetat (PGMEA) </li><li> Isopropanol (IPA) </li><li> N2 </li></ul> Yöntem: <ol><li> Kimyasal bir kaput, PGMEA (2), IPA ve Hekzan (2) beş yemekleri ile doldurun. </li><li> 10 saniye süreyle 1. PGMEA gofret tutun </li><li> 50 saniye için gofret çalkalayın </li><li> PGMEA, menisküs 2. PGMEA gofret aktarın. </li><li> 5 saniye çalkalayın. </li><li> PGMEA, menisküs IPA gofret aktarın. </li><li> 20 saniye çalkalayın. </li><li> 1. IPA gofret aktarın. </li><li> 5 saniye çalkalayın. </li><li> 2. IPA gofret aktarın. </li><li> 5 saniye çalkalayın. </li><li> IPA menisküs ile hızla 2. IPA gofret kaldırmak ve kuru N2 </li><li> Desen kontrol edin. </li><li> 120 ° C 14-20 saat süreyle çapraz bağ SU-8 Hardbake gofret. </li><li> Elmas kesici ile gofret Zar </li><li> Epoksi kullanarak bir cam slayt Mount gofret </li><li> Gofret Fluorosilanize (çoğaltma kalıplama talimatlara bakın) </li></ol> MPADS, Çoğaltma kalıplama Negatif Kalıp Malzemeler: <ul><li> Tek kullanımlık alüminyum ağırlığındaki tekne </li><li> Polidimetilsiloksan (PDMS) kaide ve sertleştirici (Dow, Midland, MI) </li><li> Razorblade </li><li> Silan: (tridecafluoro-1 ,1,2,2 tetrahyrooctyl)-1-trichlorosilane </li><li> Cam slayt </li><li> Cam Pasteur Pipet </li></ul> Yöntem: <ol><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat süreyle vakum altında ağırlık ve gazını PDMS 10:01 karıştırın. </li><li> Place silikon ana kalıp alüminyum tekne. </li><li> 50 - 60 gr alüminyum tekne ana kalıp üzerinde PDMS dökün. </li><li> Degas, vakum altında kabarcıklarını çıkarmak için 30 dakika boyunca. </li><li> N2 hızlı patlama ile PDMS yüzey hava kabarcığı üfleyin. </li><li> 110 konveksiyon fırın Yeri tekne ° C 15 dakika boyunca PDMS firmadır kadar. </li><li> Alüminyum tekne kesip. </li><li> Jilet, silikon ana altında PDMS uzak trim. </li><li> Peel PDMS silikon ana uzak ana yavaş ve sabit bir yönde hareketi ile yok önlemek için. </li><li> Silikon ana hasar olmadığını kontrol edin. </li><li> 4 adet negatif kalıp kesin. </li><li> 1-10 negatif kalıp büyük bir parti için adımları tekrarlayın. </li><li> Oksijen plazma yüzey aktif hale getirmek için 1,5 dakika boyunca negatif kalıp tedavi ya da </li><li> Ozon yüzey aktif hale getirmek için 10 dakika boyunca negatif kalıp tedavi. </li><li> Maruz mPAD özellikleri ile Desikatörde negatif kalıplara yerleştirin. </li><li> Desikatöre merkezi cam slayt silan 250-500 mcL yayıldı </li><li> Desikatöre içindeki ucu silan 150-200 mcL Yeri cam mera pipet. </li><li> &gt; 14 saat süreyle vakum odasına silan ve kat olumsuz kalıp buharlaşması için. </li></ol> mPADS Malzemeler: <ul><li> Polidimetilsiloksan (PDMS) kaide ve sertleştirici (Dow, Midland, MI) </li><li> Geniş ağız tek transfer pipetler </li><li> 2 &quot;x 3&quot; Cam slaytlar </li><li> Cam Scribe </li><li> N2 </li></ul> Yöntem: <ol><li> Kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat süreyle vakum altında ağırlık ve gazını PDMS 10:01 karıştırın. </li><li> &#39;çapraz&#39; Silanlanmış negatif kalıpları dantel </li><li> Pipet PDMS özellikleri negatif kalıplar içine 1mm kalınlık için tam bir kaplıdır böylece. </li><li> Yüzeye yükselmeye PDMS herhangi bir hava kabarcığı için 30 dakika bekleyin. &lt;/ P&gt; <li> 30 &#39;kesinti N2 akışı, toz 22x22mm (2) sayılı cam lamelleri. </li><li> Oksijen plazma tedavi cam slaytlar camını temizlemek ve etkinleştirmek için 1,5 dakika boyunca yarı yarıya </li><li> N2 hızlı patlama ile PDMS yüzey hava kabarcığı üfleyin. </li><li> Ile PDMS PDMS bakan plazma temizlenir yan cam lamel kenarına hafifçe yatıyordu. Yavaşça cam slayt düşük PDMS tamamen rehber tüm cam yüzey ve cam slayt altında hapsolmuş hava kabarcıklarını önlemek. </li><li> Yeri 110 ° C 20 saat boyunca tam olarak tedavi etmek konveksiyon fırın kalıpları toplandı. </li><li> Kalıpları fırından çıkarın ve RT soğumasını bekleyin. </li><li> Bir üst el ve yavaş yavaş olumsuz kabuğu mPAD serbest bırakmak için alttan olumsuz kalıp ile cam slayt tutun. </li><li> MPAD çökmüş mesajları için bir mikroskop altında inceleyin. </li><li> Plazma ve silan her dört döküm ile yeniden silanize kalıp. Iyi çoğaltma için negatif kalıp ömrü yaklaşık 6-20 atmalarını. </li></ol> MPADS üzerine Seeding Hücreler Presleme Malzemeler: <ul><li> UCP PDMS pulları (Doku Mühendisliği Yöntemleri Tien, J &amp; Chen, CS, 2001, s. 113-120.) </li><li> Etanol (% 100 ve% 70) </li><li> Steril Deiyonize su </li><li> Steril deiyonize su 50 ug / ml İnsan Fibronektin (BD Biosciences) </li><li> 5 ug / ml DII Çözüm 0.2 mikron membran (D-3886, Moleküler Probları, OO) ile filtre </li><li> % 2 Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, NJ) </li><li> 1X Fosfat Tampon Çözüm. </li><li> 100 mm x 25 mm petri (4) </li><li> 150 mm x 25 mm petri (2) </li><li> Alüminyum folyo </li><li> N2 </li><li> Cımbız </li><li> Steril Hood </li></ul> Yöntem: <ol><li> MPADs gelen Trim aşırı PDMS </li><li> PDMS damgası daha önce kullanılmış ise% 100 etanol içinde 5 dakika boyunca kontaminasyona yol açan protein uzak fırçalayın pulları sonikasyon. </li><li> Taze% 100 etanol ve steril su pul daldırma sonra cımbız ve N2 kuru steril kaput, onların yüzüne pulları tutun </li><li> Yüzü yukarı 150 mm petri yerleştirin. </li><li> Kısım, her damga fibronektin çözüm düşer. Sonra her pullarının köşeler, kenarlar ve son olarak da iç bölgeler ile başlayın. Başlangıçta damga PDMS yüzeyi hidrofobik, fakat protein adsorbe olarak hidrofilik olur. Çalışma, &quot;içinde&quot; değişiklik dışında damga tam kat daha düşük bir hacim fibronektin çözüm için gereklidir, böylece PDMS temas açısı. </li><li> Protein adsorpsiyonu için başlığa 1 saat bekletin. </li><li> Çanak dökme ve pulları üzerinde su seviyesi yükselmeye izin pulları DI suyla yıkayın. </li><li> DI su ile dolu 100 mm petri pulları yıkayın. </li><li> Çıkarın ve N2 ile kurulayın. </li><li> Ozon tedavisi mPADS 7 dakika damgalama için yüzey aktif hale getirmek için. </li><li> Kaputun altında, mPAD damga kenarına yerleştirerek ve yavaşça tam temas kurmaya düşürücü mPADS damgası. Tüm alanlarda iyi bir temas sağlamak için cımbız ile pulu üst hafifçe dokunun ama Mesajları çöküşü değil dikkatli olun. </li><li> Cımbız ile dikkatlice pulları çıkarın. </li><li> Batmak mPADS ~ 15 saniye için% 100 Etanol ile 100 mm petri. Yemekler arasında hızla transfer ederek, transferi sırasında dewetting gelen microneedles tutun. </li><li> Batmak mPADS ~ 15 saniye için% 70 Etanol ile 100 mm petri. </li><li> Batmak mPADS ~ 15 saniye DI su ile 100 mm petri. </li><li> DI su ~ 15 saniye ile ikinci, 100 mm petri Batmak mPADS. </li><li> DI su ile 150 mm petri Batmak mPADS. </li><li> DII çözüm 100 ml ile 150 mm petri Batmak mPADS. </li><li> Alüminyum folyo ile örtün ve 1 saat bekletin. </li><li> Batmak mPADS ~ 15 saniye DI su ile 100 mm petri. </li><li> Batmak mPADS, 10 ml ve 90 ml% 0.2 Pluronics toplam konsantrasyonu PBS ile 2% Pluronics 150 mm petri. </li><li> Kapak ve 1 saat bekletin. </li><li> Batmak mPADS ~ 15 saniye DI su ile 100 mm petri. </li><li> DI su ~ 15 saniye ile ikinci, 100 mm petri Batmak mPADS. </li><li> Batmak mPADS ~ 15 saniye ile üçüncü PBS 100 mm petri. </li></ol> Yayımlamak Malzemeler: <ul><li> Seçilen hücre hattı </li><li> Tripsin-EDTA (EDTA • 4NA, Gibco Kedi ile% 0.25 &#39;lik tripsin No 25.200-056.) </li><li> Büyüme Orta </li><li> 1X Fosfat Tampon Çözüm. </li></ul> Yöntem: <ol><li> Steril kaput, 100 mm petri mPADS ve 17 ml medium ile doldurun. </li><li> Inkübatör yerleştirin petri 37 sıcak ° C </li><li> Tripsin yoluyla hücreler Askıya Alma </li><li> Hücre kümeleri kırmak için art arda aspire edin. </li><li> MPADS petri içine pipetleyin hücre süspansiyonu. Analiz anda tek hücre (hücre-hücre temas olmadan) kalacak gibi hücreleri ekleyin. Eklemek için hücre tam miktarı hücre türüne özgü vehücre yayılmasını alan ve büyüme hızı bağlıdır. </li><li> Yavaş pippetting petri hücreler yavaşça dağılırlar. </li><li> Inkübatör yerleştirin 2 saat hücreleri microneedles üzerine yerleşmek ve bağlı izin vermek. </li><li> MPADS hücrelerinin yayılmasını olup olmadığını görmek için inceleyin. Hücrelerin basık bakmak ve altı veya daha fazla mesaj yayılan. </li><li> Hücrelerinin yayılmasını ise, 21 ml taze orta yeni 100 mm petri mPADS aktarmak. </li><li> MPADS denemeniz için hazır. </li></ol> MPADS Boyama ve Montaj Sabitleme Malzemeler: <ul><li> Deiyonize su </li><li> Paraformeldahyde (% 16) flakon </li><li> 10X Fosfat Tampon Çözüm. </li><li> 1X Fosfat Tampon Çözüm. </li></ul> Yöntem: <ol><li> 50ml santrifüj tüpüne, DI 30 ml, 10 ml paraformeldahyde (tüm flakon), 4.5 ml ve sabitleme çözümü için 10X PBS ekleyin. </li><li> 100 mm petri çözüm sabitleme ~ 25 ml ekleyin. </li><li> Yavaşça batığın sabitleme çanak içine hücreleri ile mPAD ve 20 dakika boyunca inkübe sağlar. </li><li> 1X PBS ile 100 mm çanak üç kez Submerge mPADS. </li><li> Immün ve montaj için hazır. </li></ol> MPADS üzerinde Hücresel Kuvvetleri Analizi Konfokal Görüntüleme Malzemeler: <ul><li> Konfokal Mikroskop </li><li> 63X Amaç </li><li> Filtre küpler sekonder antikorlar </li><li> Microneedles, DII görüntüleme için yeşil ışık filtresi küp (rodamin). </li></ul> Yöntem: <ol><li> Place sahnede mPADs ve 300 ms maruz kalma, hiçbir binning tek hücreleri bulmak. </li><li> TOP IMAGE için microneedles Image başında yer alıyor. </li><li> Z-kontrol grubu kullanarak, ALT GÖRÜNTÜ için microneedles görüntü yakalamak. </li><li> Image leke (Hoechst, Phalloidin vb.) Herhangi bir diğer kanallar </li></ol> Görüntü Analizi Malzemeler: <ul><li> MATLAB ile Görüntü İşleme Toolbox </li></ul> Yöntem: <ol><li> Üst ve alt görüntüleri çevirin ve kayıt </li><li> Ölçü alt sentroidler (undeflected) ve üst (bükülmesi) konumlarına </li><li> Deplasman hesaplayın </li><li> Bahar ileti (bilinen, yazılan geometri bağlıdır) için sürekli kullanarak, her yazılan kuvvet vektörü hesaplamak </li><li> Hata analizi güçleri çözme yeteneği üzerine kuruludur ve görüntü çözünürlüğü ve ağırlık algılama çözünürlüğü bağlıdır. </li><li> Farklı koşullar vb genelinde örneğin, kuvvet büyüklükleri ve / veya yön, bir süre ders olarak, birçok ölçümler özelleştirilmiş ihtiyaçlarına göre verileri düzenleyin </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

Bu video, mesaj microfabricated bir dizi kullanarak hücresel çekiş kuvvetleri ölçmek için bir yaklaşım sunacak. Çekiş güçleri miyozin aktin etkileşimleri ile üretilen ve bizim fizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Gelişimi sırasında, hücrelerin doku erken yapıları oluşturmak için bir yerden amacıyla önümüzdeki geçmek için olanak sağlar. Çekiş güçleri iyileşme süreçlerine yardımcı olur. Bunlar doğru yaraların kapatılması ya da vücuda göç ve lökositlerin sürünerek için gerekli. Bu aynı güçler kanser metastazı ya da vasküler bir tümör doğru büyüme durumda sağlığımız için zararlı olabilir. Hücreleri in vitro olarak incelemek için en yaygın yöntem, bir cam veya polistiren çanak kullanmak olmuştur. Ancak, yüzeylerde katılık imkansız fiziksel hücre çekiş kuvvetleri ölçmek için yapar, ve çekiş güçleri çalışma nispeten birkaç yöntem vardır. Bizim laboratuvar, bu sınırlamaları aşmak için bir teknik geliştirdi. Bu yöntem, tek tek hücrelerin birçok konsol yayılmış ve bu süreç içinde onları saptırmak gibi esnek olan konsol, sertlik ve büyüklük ölçeği dikey bir dizi dayanmaktadır. Biz kullanmak sütunlar, çapı 3 mm, 10 mm boyunda, ve 9 mm merkez-merkez aralığı ile düzenli bir dizi yapılandırılır. Ama bu fiziksel boyutları çeşitli çalışmalarda kolayca uyum sağlamak için çeşitli olabilir. Biz bir silikon ana ile başlar, ancak son mesaj silikon kauçuk poli (dimetil siloksan) veya PDMS adlı yapılmış. Biz mikroskop altında deplasmanlar ölçmek ve gözlemlenen deplasmanlar üretmek için gerekli çekiş güçleri büyüklüğünü ve yönünü hesaplayabilirsiniz. Biz bu yüzeylerin post-dizi-dedektörleri, ya da mPADs microfabricated diyoruz. Burada, biz mPADs imal ve hücresel kontraktilite modülasyon değerlendirmek için nasıl kullandıklarını size gösterecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces at JoVE.com

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Bu video, hücresel kontraktilite modülasyon değerlendirmek için microfabricated sonrası dizi dedektörleri (mPADs) imal ve nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Microfabricated Post-Dizi-Dedektörleri (mPADs): Mekanik Kuvvetleri yalıtın bir Yaklaşım

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Bu video, hücresel kontraktilite modülasyon değerlendirmek için microfabricated sonrası dizi dedektörleri (mPADs) imal ve nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Video: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Teşhis Araçları Geliştirmek İçin Mikro-Elektro-Mekanik Sistemler (MEMS)

Biyoloji

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...