Biyomoleküller, genellikle kuvvete yanıt olarak küçük ve hızlı yapısal değişikliklere uğrarlar. Yüksek çözünürlüklü manyetik cımbız, fizyolojik olarak ilgili kuvvetler altında bu dinamikleri keşfedebilir. Yöntem, nano ölçekli ölçümleri milisaniye hassasiyetiyle yaptığından, nükleik asitlerdeki ve proteinlerdeki ince değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek mümkündür.
İlk yatak ve mekanosensitif proteinlerdeki arızalar potansiyel olarak kardiyovasküler ve kas-iskelet sistemi bozukluklarına yol açabilir. Manyetik cımbız, bu proteinlerin çalışma mekanizmaları hakkında fikir verebilir. İyi çözünürlükler elde etmek için set düzgün bir şekilde hizalanmalı ve kalibre edilmelidir.
Ayrıca, ölçümler için moleküler yapıların hazırlanması ve tanımlanması sırasında dikkatli olunmalıdır. Titreşim önleyici optik masaya ters çevrilmiş bir mikroskop kurarak başlayın. Ardından, yüksek hızlı bir CMOS kamera ve bir çerçeve tutucu takın.
3D'de mıknatıs manipülasyonu için bir çeviri aşaması oluşturmak üzere manuel bir XY aşamasına 20 milimetreden fazla hareket uzunluğuna sahip motorlu bir doğrusal sahneyi dikey olarak monte edin. Ardından, mıknatıs dönüşü için bir döner step motor ve bir kayış ve kasnak sistemi takın. Mıknatısları, aynı paralel mıknatısların bir milimetre arayla yerleştirildiği akrilik bir tutucuya monte edin.
Çeviri aşamasının dikey konumunu, mıknatısın alt yüzeyi en düşük aşama konumundaki numune düzlemiyle hizalanacak şekilde ayarlayın. Düşük büyütmeli objektif lens kullanarak, mıknatısları görüş alanının merkezine hizalayın. Mıknatıs çiftinin merkezinin yer değiştirmesinin sınırlı olduğundan emin olmak için mıknatıs dönüşünü kontrol edin.
Boncuk aydınlatması için süper ışıldayan bir diyot takın. Kirişin mıknatıs boşluğundan geçirerek, ışının boşluğa sığacak şekilde düzgün bir şekilde harmanlandığından ve aydınlatmanın mıknatıslar tarafından gölgelenmediğinden emin olun. Şimdi burun parçasına bir Piezo lens tarayıcı takın ve boncuk izleme için 100X yağ daldırma objektif lensini 1.5 sayısal açıklığa sahip monte edin.
Boncuk izlemede potansiyel artefaktları önlemek için aydınlatmanın mıknatıs hareketi ile eşit olduğundan emin olun. Son olarak, ışığı piksel doygunluğu olmadan maksimum parlaklığa ayarlayın. Hücrenin üst ve alt kısmı için iki cam kapak parçası alarak başlayın.
Kapak fişlerini 30 dakika boyunca bir molar potasyum hidroksit içinde sonikleştirerek temizleyin. Daha sonra, kapakları damıtılmış suda durulayın ve suya batırılmış halde tutun. Alt kapak kapağını pegylate edin ve daha sonra kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Deney gününde, pegile edilmiş kapakları bir azot tabancasıyla kurutun. Basit kanalları yapmak için, yaklaşık iki milimetre genişliğinde çift taraflı bant şeritleri hazırlayın ve alt kapak kayması üzerinde birbirine beş milimetre aralıklarla paralel dört şerit yerleştirin. Şimdi, kanal giriş ve çıkışları için kısa kenarlarda yaklaşık beş milimetre boşluk bırakarak alt kapak kaymasının ortasına bir üst kapak kayması yerleştirin.
Cımbız kullanarak, kanalları sıkıca kapatmak için üst kapak kapağının arkasına hafifçe bastırın. 200 mikrolitrelik pipet ucunun kenarını kesin ve 200 mikrolitreden fazla çözelti tutmasını sağlamak için daha geniş açıklıktan yaklaşık 10 milimetre kesin. Şırınga pompası için boruya uyan üç şırınga iğnesi hazırlayın.
Akış hücresi kanal çıkışındaki iğneyi polietilen boru ile şırınga pompasına bağlayın. PBS ile kanalları dengeleyin. Boncuk çözeltilerini vorteksleyerek boncuk agregalarını yeniden askıya alın.
Daha sonra pompa ile emerek gerekli çözeltileri sırayla kanala sokun. 0.1 pikonewton kuvvet uygularken bağlanmamış boncukları yıkayın. Akış hücresi kanal yüzeyinde, DNA yapısının tek moleküllerine bağlı manyetik boncukları tanımlayın.
Yakınlarda bir referans boncuk bulun. Serbestçe dönüp dönmediğini kontrol etmek için aday boncuğu döndürün. Boncukları birkaç tur daha döndürün ve daha küçük bir dönme yarıçapına sahip bir boncuk seçerek dönme yarıçapını tahmin edin.
Beş kilobaz çift bağlama gerilmesinden kaynaklanan boncuk kırınım düzeninde büyük bir değişiklik arayarak iyi tek bağlı boncukları tanımlamak için kuvveti sıfırdan beş piconewton'a yükseltin. PCR'yi kullanarak, bir ucunda biyotin ve diğer ucunda azid ile etiketlenmiş beş kilobaz çift çift sarmallı DNA fragmanı hazırlayın. PCR ürünü ile bir akış hücresi hazırladıktan sonra, bağlı boncuğun X ve Y koordinatlarını 1.2 kilohertz'de ve mıknatısları dinlenme konumunda kaydedin.
Mıknatısları akış hücresine yaklaştırın ve mıknatıslar akış hücresinin tepesine zar zor dokunana kadar boncuk pozisyonu ölçümlerini tekrarlayın. Alternatif yöntemlerden birini kullanarak her bir mıknatıs konumu D'deki kuvveti hesaplayın. Manyetik boncuklar arasındaki kuvvet değişkenliğinin ortalamasını almak için üç ila beş boncuğu araştıran birkaç DNA yapısı için kuvvet ölçümlerini tekrarlayın.
Uygun bir manyetik boncuk bir referans boncuk ile birlikte yerleştirildikten sonra, boncuk izlemeye hazırlanmaya başlamak için kalibre et düğmesine tıklayın. Boncukların yerlerini tanımlamak için resimdeki boncuklara tıklayın. Z yönünde izleme için, yazılım objektif lensi eşit mesafeli adımlarla bir Piezo tarayıcı ile adımlayacak ve bir arama tablosu oluşturmak için her konumda dalgalanma ortalama boncuk görüntülerini kaydedecektir.
İzleme ve otomatik odaklamayı etkinleştirin ve boncuk konumlarını kaydetmek için edin, düğmesine tıklayın. Bir DNA saç tokası yapısına kuvvet uygulaması, kuvvet kaynaklı uzantının solucan benzeri zincir modeli ile sonuçlandı. Altı pikonewtonda, yapı, sekiz pikonewtonda kaybolan ve yeni bir model eğrisine yapışan geri dönüşümlü fermuarın açılmasıyla ilişkili uzantıda dalgalanmalar gösterdi.
100 hertz'deki saç tokası izleme deneyleri, uzantıda bir artış gösterdi, ancak histogramlar farklı popülasyonları çözmedi. 1.2 kilohertz'de, medyan filtrelenmiş yörüngeler iki farklı popülasyon ortaya çıkardı. İki halk arasındaki ayrılık, sıkıştırmasız kuvvet rejiminde aynı kaldı.
Üst açık devlet, artan güçle yavaş yavaş baskın hale geldi. Geçiş oranları, sıkıştırmanın açılmasını destekleyen ve fermuarlamayı engelleyen uygulanan kuvvetle katlanarak değişti. Ara kuvvet rejiminde, maksimum hızda iki ila üç nanometrelik bir Allan sapması elde edildi.
Bir SNARE kompleks yapısının DNA tutamaçları, solucan benzeri zincir polimerleri gibi davrandı. Kuvvet daha yüksek bir rejimden gevşetildiğinde, uzantı orijinal eğriye geri döndü veya yeni bir model izledi. 14 pikonewtonda, SNARE kompleksi sıkıştırılmamış duruma geçemedi, oysa artan bir kuvvet geçişe izin verdi.
Kompleksin daha yüksek kuvvetlerde tam olarak ortaya çıkması, iki pikonewtonda gözlenen yeniden katlanma ile doğrulandı. Düzgün biçimlendirilmiş örnek boncuk bağlarının tanımlanması, prosedürümüzü denerken hatırlanması gereken en önemli şeydir. Bu adım, doğru seçimi ve dolayısıyla hedef yapının analizini sağlar.
Manyetik cımbız, tork uygulayarak DNA süper sarmalını incelemek için daha da kullanılabilir. Ayrıca, son derece karmaşık protein etkileşimlerini veya ortaya çıkışını gözlemlemek için floresan görüntüleme ile birleştirilebilir.
