This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

Micropost Dizileri 1. Kültürleme Hücreler Not: Tüm adımlar sterilite sağlamak için bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Burada verilen miktarlar T25 hücre kültürü şişeleri içindir. Hücre kültürü ortamı tarifi ve hücre tohum yoğunluğu, kemik kanseri hücre çizgileri HuO9 ve M132 için optimize edilmiştir. <ol><li> Bir micropost dizisi üzerine tohumlama için hücre kültürü hazırlayın. <ol><li> Standart ışık mikroskobu kültür şişesi koyarak hücre kültürü kalitesini kontrol edin. Hücreler kaplıdır ne kadar kültür şişesi alt tahminine göre tipik bir büyüme ve morfoloji göstermektedir emin olun. % 70 -80% A kapsama sağlıklı bir büyüme oranını yansıtır. Onlar ölü hücreleri ve / veya büyümüş kültürünü temsil olarak hücrelerin yüzen miktarına dikkat edin. </li><li> 4 mi 1x Fosfat ile orta ve yıkama kaldırarak Hücreleri tripsinize edin salin (PBS) tampon tamponlu. Hücre kadar oda sıcaklığında 0,8 ml 1 x tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin ve inkübeyaklaşık 2-4 dakika sürer s sökülmüş. Mikroskop ile süreci kontrol ve bazen yerinden oynatmamaya desteklemek için hafifçe şişeyi hafifçe vurun. </li><li> 5 ml hücre kültür ortamı (Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 cenin sığır serumu (FBS ile / F12),% 1 penisilin / streptavidin (Pen / Strep)), reaksiyonu durdurmak için hala oturup bakiye hücrelerini yıkamak için ekleme balona en altta. Daha sonra homojen bir karışım elde etmek için yukarı ve aşağı birkaç kez bu süspansiyonu pipetle. Etkili bir yerinden oynatmamaya kazanmak için balonun orijinal büyüme alanı boyunca tüm çözümler pipetle emin olun. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe, hücre süspansiyonu aktarın ve 3 dakika boyunca 0,5 x g&#39;de bir masa üstü santrifüj kullanılarak da santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve yukarı pipetleme ve 5 kat aşağı 5 ml ortamda hücre pelet yeniden askıya. Bunu yaparken kabarcıklarının oluşumunu önlemek için emin olun. </li><li> Bir hücre sayımı odacığı ve bir ışık mikroskobik kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemekpe. Hücre agrega için hücre sayım odasında hücre süspansiyonu kontrol ve sonraki deney için tek tek hücrelere sahip sağlamak. Pipet hücreleri onları ayırmak için agrega oluşturmak üzere tekrar ve birkaç kez aşağı eğilimi varsa. </li><li> 25.000 hücre / ml hücre solüsyonu elde etmek için yeterli bir ortam maddesi ile bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Kapalı tüpü birkaç kez ters yüz edilerek iyice karıştırın. </li></ol></li><li> Hücre tohumlama için micropost dizisi hazırlayın. Kritik Not: Bu potansiyel microposts zarar verebilecek doğrudan gibi istenmeyen kabarcıklar tanıtıldı, özellikle micropost dizisi üzerine pipetle etmeyin. Ayrıca, micropost dizisi asla kılcal kuvvetler microposts çöken yol olarak oluşan kurur emin olun. <ol><li> Bir çift cımbız kullanarak bir 12 oyuklu plaka iyi yüzü yukarı bakacak şekilde ve 1 ml etanol (% 99) eklenmesi ile ıslatın micropost dizisi ile cam substratın yerleştirin. 20-30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Etanol seyreltinde tarafında yaklaşık 1 ml steril deiyonize su (DI su) ilave edilmesi ve bir transfer pipeti veya aspirasyon cihazı kullanılarak yaklaşık olarak 1 ml aspire aşamalı olarak gerçekleştirilebilir. Bu adımı en az 3 kez tekrarlayın. </li><li> Ekleme ve yaklaşık olarak 1 ml aspire aynı şekilde PBS-tamponu ile DI-su değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li><li> Ekleme ve yaklaşık ortam 1 ml aspire ortam ile PBS-tampon değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Hazırlanan her micropost dizinin üstünde pipetle 1 ml hücre solüsyonu (25.000 hücre). Çok-yuvalı plaka yakın ve bir kuluçka transfer (CO 2 5%, 37 ° C). Hücreler yapışır ve 6 -7 saat microposts üstünde büyümek edelim. </li><li> Bir ışık, bir mikroskop kullanarak bazen yapışma sürecini inceleyin. Hücrelerin en Birden microposts yayılmış görünür olduğunu kontrol edin. </li></ol> 2. Tespit ve Boyama Hücreleri Not: Tüm adımları veBurada verilen miktarlar 12-çukurlu bir plaka tek bir oyuk içindir. Bu microposts çökmesi ile sonuçlanır herhangi bir sıvı, bir aspirasyon sonra kuyuların Bir kurumasını önlemek için bir seferde on iki kuyu dörtten fazla işleme sokulması tavsiye edilmektedir. <ol><li> Kuyudan aspire orta ve yıkama hücreler 1 ml PBS tamponu ile 2x. Inkübasyon sırasında micropost dizisi üzerinde biriken hücre debrisini uzaklaştırmak için ve ölü hücreleri ayırmak için PBS ile yıkama sırasında hafif bir kuvvet uygulamak için emin olun. </li><li> 5 dakika boyunca 0.5 ml% 3.7 tamponlu formaldehit solüsyonu ile hücrelerin sabitleyin. </li><li> 1 ml steril DI su ile micropost dizi 2x yıkayarak formaldehit çözüm değiştirin. </li><li> Yaklaşık 90 sn için (% 50 su,% 40 etanol ve% 10 asetik asit içinde% 0.05 Coomassie Brilliant Blue) boya ile hücrelerin Leke. 1 ml steril DI su ile 2x kapalı aşırı boyama çözüm yıkayın. Dizi micropost 1 ml distile su ekleyin. </li><li> Bir ışık mikroskobu kullanılarak boyama sonucu kontrol edin. Tekrarlama tHücre gövdesi görüntülenmiştir çok sönük ise o adımı boyanarak. </li><li> 4 ° C &#39;de bir buzdolabında üzerine boyanan hücreler ile mağazası micropost dizileri. Her zaman su altında tutmak için emin olun. </li></ol> 3. Hücre Görüntüleme Not: Adım 4 sadece sonsuzluk düzeltilmiş optik olmadan mikroskoplar için de geçerlidir. <ol><li> Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ince bir cam alt kısma sahip bir Petri kabı, 2 ml DI-su ilave edilir. </li><li> Microposts yukarı bakacak şekilde görüntüleme çanak içine bir cımbız kullanarak micropost dizi aktarın. </li><li> Işık mikroskobu bir hareketli sahnede görüntüleme Petri kabı yerleştirin. </li><li> Ölçekte sayı cam alt tabaka, silikon elastomer ve üstünde sıvı kırılma indeksleri uyumsuzluğu telafi etmek için optik yol boyunca tüm malzemelerin toplam kalınlığı temsil dek görüntüleme için kullanılan lensin tazminat halkasını çevirin. Bu microposts parlak bir görünüm gitmelidirçekirdekler. </li><li> Aşağı% 50 aydınlatma tarafında iris kapatın ve sıradan bir parlak alan modu sağlayan optik yol herhangi bir faz kontrast halkaları çıkartın. </li><li> Microposts gözlem tarlada yatay bir çizgi oluşturacak micropost dizi aynı hizaya getirin. Bir başlangıç ​​noktası (örneğin, sol üst) tanımlar ve sayısız görüntüleri çekerken micropost dizisi tarayarak sahne üzerinde Petri kabı adım adım hareket ettirin. </li><li> 20X veya 40X objektif kullanarak kamera için en yüksek çözünürlük ayarı ile tüm görüntüleri çekin. Görüntünün merkezinde tek bir hücreyi hedefliyoruz. </li><li> Micropost ipuçları odak kadar madde boyunca z ekseni boyunca hareket ettirin. Mikroskop ince ayar odak tekerleğini kullanın ve yaklaşık 2-3 um için micropost alt odaklanarak doğru çevirin. </li><li> (Bir seferde görüntüleme parametreleri tek doğru süpürme tek dizi bölümünün test görüntülerinin serisini alarak standart bir görüntüleme prosedürü oluşturulması, örneğin, maruz kalma süresi,iris ayarı, lamba ayarları vb.) MechProfiler görüntüleri analiz ve hızlı ve güvenilir bir analiz için uygun bir parametre setini belirler. </li></ol> Açık Kaynak Yazılım &quot;MechProfiler&quot; 4. Görüntü Analizi Not: Tüm yazılım fonksiyonları sol fare düğmesini kullanarak bir işaretleme cihazı ile aktif hale getirilebilir. Ancak, eğitimli operatör verimli iki elle görüntü işleme etkinleştirmek için klavyenin sol yarısında olacak şekilde tasarlanmıştır belgelenmiş kısayol tuşlarını kullanabilirsiniz olacaktır. <ol><li> Görüntü analiz yazılımı MechProfiler başlatın ve &quot;Aç&quot; tıklayarak analiz edilmesi gerekir görüntülerin bir dizi açın. </li><li> Yazılım geliştiricisi tarafından verilen &quot;Ayarlar&quot; bölümüne tüm parametreleri yerleştirin. Özel yazılım el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilen prosedürlere göre (örneğin, kontur eşiği ve minimal mesafe) yapılandırılmalıdır parametreleri belirleyin. </li><li> Görüntüyü analizs birer-one &quot;Kırp&quot; seçeneğini kullanarak, ilgi alanına bunları kırparak (tıklayın ve fare düğmesi ile sürükleyin basılı). Çizilmiş dikdörtgenin içine çift tıklayınız Bu eylemi tamamlamak için. </li><li> &quot;Hücre hatlarını çizin&quot; ve hücre bağlı olduğu tüm microposts dahil çizim için çapraz saç imleci kullanın tıklayarak her görünür hücre anahat tek-tek işaretleniyor. </li><li> &quot;Sil Mesajlar&quot; linkine tıklayarak istenmeyen microposts atın ve çizim çapraz saç imleci kullanın. Görüntü bölümü dışında bir hücreye ait veya başka herhangi bir nedenle değil, ilgi hücre tarafından deflected tüm microposts sarmalar. </li><li> Yazılım alt yordamı fare tıklaması ile &quot;Sentroidler Find&quot; başlayın. Hemen yanında kendi merkezinde kırmızı bir çarpı görünür tüm microposts kayıtlı kadar &quot;Sentroidler Bul&quot; düğmesi, ayarı filtreyi ayarlayın. Filtre ayarı çok ise çok yüksek mu eğer düşük microposts, göz ardı edilecektirltiple pozisyonları tek bir micropost için işaretlenir. Bir analiz oturumu sırasında sürekli ayar filtreyi tutun. </li><li> Birden veya cevapsız micropost pozisyonları ile centroids manuel düzenleme fonksiyonu &quot;Manuel Düzenle&quot; kullanın. Tıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek söz konusu micropost seçmek için fare çapraz saç kullanın. Dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik kırmızı işaret yerleştirmek. Çizilmiş hücre anahat dışında ise böyle bir micropost atın devam etmeden önce (adım 4.5). </li><li> Bir fare tıklaması ile &quot;Izgara üret&quot; fonksiyonunu aktive ederek ideal bir micropost ızgara bulun. Pozisyon çizilmiş hücre anahat içinde mavi bir halka ile gösterilen gerçek micropost kafası, tekabül emin olun. </li><li> Bir fare tıklaması ile gelen &quot;Manuel Edit&quot; fonksiyonunu kullanarak gerekli hücre alanı içinde herhangi bir yanlış ızgara makinesi düzeltin. Qu micropost seçmek için çapraz saç kullanıntıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek Sorusuna. Görünen dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik mavi işaret yerleştirmek. </li><li> Bir micropost görüntü bölümü içindeki pozisyon ve oluşturulan ideal bir ızgara arasındaki fark esas alınarak hesaplanan sapma değerleri bir histogram almak için fare tıklaması ile renkli &quot;Hesapla sehim&quot; kullanın. </li><li> &quot;Kaydet&quot; konulu bir fare tıklaması ile değerlerin tablolar dahil olmak üzere komple bir analiz kaydedin. </li><li> &quot;Görünüm Reset&quot; ve uygun doğru klavye curser tuşu kullanılarak yapılabilir &quot;Next Image&quot;, başka bir görüntü bölümü veya klik analiz tıklayarak ya görüntü analizi devam edin. </li></ol> 5. Veri Analizi - Mechanoprofiling <ol><li> Analiz görüntüleri ile klasörden bir ofis elektronik tablo programı ile dosya &quot;results.xls&quot; açın. Bu al veri içeriyoranaliz hücrenin bütün micropost sapması ve bu tür çalışmaların (yani, alt tabaka deformasyon enerjisi) gibi standart önlemler dahil olmak üzere türev l hesaplanan değerler. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, R. I., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+biomechanical+gradients+for+directed+bone+marrow+stromal+cell+differentiation+toward+tendon+and+bone.">Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone.</a> Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).</li><li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells.">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).</li><li>Bartalena, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+adherent+single-cell+stiffness+in+tension:+design+and+testing+of+a+substrate-based+live+cell+functional+imaging+device.">A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device.</a> Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+Temperature+Operable+Autonomously+Moving+Bio-Microrobot+Powered+by+Insect+Dorsal+Vessel+Tissue.">Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue.</a> PloS ONE. 7 (7), (2012).</li><li>Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+retraction+of+bundled+type+IV+pili+enables+nanonewton+force+generation.">Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation.</a> Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).</li><li>Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Chemo-Mechanical+Effects+of+an+Anti-Cancer+Drug+Emodin+on+Breast+Cancer+Cells.">Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Cellular+Traction+Forces+by+Micropillar+Arrays:+Contribution+of+Substrate+Warping+to+Pillar+Deflection.">Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection.</a> Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Lemmon, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+for+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).</li><li>Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+subcellular+measurement+of+cell+stiffness+using+a+microengineered+stretchable+micropost+array+membrane.">Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane.</a> Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).</li><li>Roure, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+mapping+in+epithelial+cell+migration.">Force mapping in epithelial cell migration.</a> PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).</li><li>Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+of+material+surface+topography+and+wettability+on+cell-material+interactions.">Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions.</a> Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).</li><li>Badique, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+nuclear+deformation+on+micropillared+surfaces+by+substrate+geometry+and+cytoskeleton+organization.">Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization.</a> Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).</li><li>Sniadecki, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+microposts+as+an+approach+to+apply+forces+to+living+cells.">Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells.</a> PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).</li><li>Weng, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone-based+stretchable+micropost+array+membrane+for+monitoring+live-cell+subcellular+cytoskeletal+response.">A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response.</a> Lab Chip. 12, 731-740 (2012).</li><li>Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> J Vis Exp. (8), e311 (2007).</li><li>Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+stem+cell+mechanobiology+on+microfabricated+elastomeric+substrates+with+geometrically+modulated+rigidity.">Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity.</a> Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).</li><li>Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+in+Cell+Biology.">Micropatterning in Cell Biology.</a> Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).</li></ol>

The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Bu çalışma esas olarak giriş teknik ve pratik engellerin düşürerek çekiş kuvvet mikroskobu alanını ilerletmek istiyor. Bu engeller iki taraftan geliyor. Öncelikle çoğaltılabilir imalatları ve deneysel bir micropost dizisi komisyon için aşılması gereken çok sayıda önemsiz olmayan teknik zorluklar bulunmaktadır. Tipik bir deney yüzlerce veya hücrelerin hatta binlerce analizini gerektirebilir akılda tutarak - İkincisi, benzer olmayan önemsiz tek hücre güçlerinin güvenilir bir yarı otomatik...

Mekanik-duyarlı hücre bazlı deneyler mekaniği hücre biyolojisi oynayabileceği role yansıtan geniş bir uygulama yelpazesi ile, yapışık hücrelerin araştırmak için izin verir. Bu uygulamalar genellikle hücre içi süreçleri ya da tam hücreli davranışını sürücü altında yatan mekanizmalar odaklanın. Bir yandan, bu tür ekstra hücresel matris bileşiminin ya da matris sertlik gibi dış çevre faktörleri önemli ölçüde bir hücrenin mekanik ve biyolojik tepkiyi etkiler. 1, aynı farmasötik olarak aktif bileşiklerin çoğu sınıflarının kullanımından sonra gözlenebilir, etkileri olan vardır genellikle hücre kültür modelleri kullanılarak karakterize edilmiştir. 2 tür iskeleti yapısı ve fonksiyonu değişiklikler ile ilişkili hücre fenotipi işaretli değişiklikleri uyarabilir spontan veya deneysel genetik mutasyonların neden olduğu gibi diğer taraftan genotipik özellikleri üzerinde. 3 Bu örnekler vardır Birçok olası birkaçkonular hangi hücrelerin mekanik fenotiplendirilmesi ilgili olduğunu ve tüm bu yararlı micropost dizileri ile incelenmiştir. Bu yazının yazıldığı, yaklaşık 200 makaleler hücre micropost etkileşimini anlatan yayınlanmıştır. Bu eserler micropost saptırma ilkeleri teorik yönlerini yanı sıra kendi imalatı pratik talimatlar tartışmak. Hücreler ve esnek micropost dizilerin etkileşimini anlatan ilk makale, sürekli yumuşak yüzeylerde Tan ve ark nanonewton ölçekli hücre kasılma, tahmin etmek için kullanılır, klasik çekme kuvvet mikroskobu (TFM) aksine 2003. 4&#39;te Tan ve arkadaşları tarafından yayımlandı. silikon elastomerden yapılmış çok yakın aralıklı dikey kirişler kullanılarak bir yöntem açıklamıştır. Bu tekniğin başlıca avantajları, iki ana özelliklerinden ortaya çıkmaktadır. Tutarken İlk hücre görünür substrat sertliği değiştirmek için yalnızca tek bir micropost boyutlarını değiştirmek gerekiyorAksi takdirde sürekli ve böylece yüzey topoloji ve kimya farklılıkları kaçınarak substrat bileşimi. İkinci microposts discretely bireysel odak yapışıklıklar sırasına kuvvet ve mekansal kararları ile analiz edilebilir ve standart TFM tarafından benzer analizler doğasında olan analitik zorlukları azaltabilir bireysel yaylar gibi hareket ederler. Bugün micropost dizileri için uygulama aralığı büyük ölçüde birkaç tek hücreler için kuvvetlerin sadece haritalama aşıyor. Örneğin, Akiyama bir böcek kas gücünü bağımsız mikro robot geliştirmek amacıyla, bir micropost dizisi için bir harekete geçirici olarak güve tırtıl bir izole dorsal damar dokusu kullanımını bildirir. 5 Bununla birlikte, microposts en yayınlanmış başvurular enfeksiyon ya da kanser gibi tıbbi durumların çalışmalara yoğunlaşmıştır. Örneğin, micropost diziler Neisseria gonorrh ve paketlenmiş tip IV pili kuvvet nesil incelemek için kullanılmıştır. Sinyal kaskadları enfeksiyon artırılması ile ilişkili 6 Diğerleri hücre iskeleti hedefleyen ilaç bileşikleri ile tedavi meme kanseri hücrelerini incelemek için microposts kullandık OEA kolonileri. 7 Bir micropost sapması genellikle hücrenin varsayarak bir uç yük ile bir konsol için klasik ışın teorisi kullanılarak tarif edilir ancak micropost çok uç takılır. Bir saptırma ö neden İşte uygulanan kuvvet F micropost yönettiği &quot;bükülme sertliği&quot; k bağlıdır ve hesaplanır: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) E, I, L ve varlık Young modülü, sırasıyla atalet ve kiriş uzunluğunun alan anı ile. Alt tabaka eğilmesi ac alınmadığı Ancak, bu denklemden sonuçlar sadece ışın kesme beri iş ve hem de eğilme kuvvetlerin genel yaklaşım vermeksaymak. Microposts tipik polidimetilsiloksan (PDMS) gibi yumuşak malzemelerden yapılmış olması dikkate alındığında bu faktörlerin dahil edilmesi gereken silikon kauçuk tabanlı. . Schoen ve arkadaşları micropost (L / D) ve karşılık gelen polimerin Poisson Oranı v oranına göre bir düzeltme faktörü olduğunu göstermiştir 8 O ile verilir.: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) T eğim (v) aynı maddede bulunabilir gibi uydurma parametre a = 1.3 içeren bir devirme katsayısı olma ile: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Bu bir micropost en düzeltilmiş sertlik k corr saf eğilme sertliği k = k viraj ürün ve düzeltme faktörü corr demektirtarafından verilen: <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Bu nedenle, hücre kuvvet hesaplamaları şimdi okuma denklem (1) daha rafine varyasyon kullanılarak yapılmalıdır: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) Düzeltme etkisi kısa sürede micropost boyutları için tipik değerler kullanılır gibi daha belirgin hale gelir. Örneğin, dairesel bir kesite ve PDMS bazlı silikon lastikten yapılmış 5 um&#39;lik bir çapa sahip bir 15-mikronluk bir uzun micropost 0.77 bir düzeltme faktörü yol açar ve bu nedenle, düzeltilmemiş hesaplama% 23 tarafından uygulanan kuvvetleri hücre olduğundan fazla olacaktır. Bu daha şiddetli küçük boy oranları ile microposts için olur. Geleneksel olarak, micropost görüntü analizi de idealize kiriş eğilme kuramına dayalı olmuştur. 2005 yılında MICR kullanımına öncülük grupOPOST diziler micropost analizi için uygun bir görüntü analiz yazılımı yayınlanan 9 yazılımı yazılım lisans gerektirir ve kullanıcı her pozisyon için üç görüntüleri almak zorundadır.; iletim modu ve lekeli hücre floresan modunda başka biri micropost üst ve alt uçakları birer. Her biri için üst ve alt pozisyonları karşılaştırarak sonra yazılım bir kuvvet vektör alanı belirler ve yazı başına kuvvet gibi ilgili parametreleri hesaplar micropost. Diğer yazılım paketleri var ve bunların analizleri prensipleri kısaca bunları açıklamak gelen maddelerde belirtilen, ancak bu analitik yazılım paketleri genellikle kamuya açık değildir. 10,11 Eşleme hücre kuvvetleri için tasarlanmış micropost dizileri tüm komşu microposts arasında eşit mesafeli boşlukların avantajına sahip olan ikinci bir ortogonal micropost düzeni veya altıgen biri olmak ya da sınıflandırılabilir. Tipik microposts habir dairesel geçiş kısmına ziyaretinde ve boyutları oval ya da kare kesitli microposts de rapor edilmiştir, ancak uzunluğu 50 um ila 1,0 um çapında 10 um ve 2. 4 arasında değişir. 12,13 Micropost malzemesi olarak PDMS bazlı silikon karışımlarının kullanılması karışımı içine nano-tanecikleri ilave sağlar. Kobalt nano çubuklar ekleyerek Örneğin micropost bir manyetik aktivasyon sağlayan ve böylece potansiyel deneysel tasarımlar özgürlük başka derecesini verir. 14 Çoğu grup kapak cam gibi veya Petri kabı içinde düz sert yüzeylerde kendi micropost dizileri üretmek. Bununla birlikte, Mann ve arkadaşları son bir gerilebilir zar üzerinde oluşturulmuş bir dizi micropost bildirmiştir. 15, hücre kontraktilite açısından canlı hücre sub-hücresel dinamik yanıtları okurken bu yapışık hücreler hücre germe güçlerine uygulanmasını da mümkün kılar. Yaygın olarak kullanılan ve çoğu estabSU8 fotorezist ile bir silikon gofret üstüne mikro üretmek için kullanılan temiz oda, kısa, standart işlemlerde SNIADECKI ve ark. 16-18 arasında derinlemesine protokoller de tarif edildiği gibi micropost dizileri yapmak için yayımlanır işlemi, yumuşak litografi dayanmaktadır. Bu silikon kauçuk kalıplara aktarılması yapılar üzerinde döküm edildiği bir kopyalama işlemi ile takip edilir. İkinci bir aşamada, bu kalıplar, seçilen bir alt-tabaka üzerine bir silikon kauçuğun kullanımım başlangıç ​​mikro çoğaltmak için kullanılır. Ancak microposts için bir üretim sürecini kuran kendi uygulamasıyla ilgili yayınlar, büyük ve artan sayıda rağmen mikro mühendislik uzmanları için bile zaman önemli miktarda alır; kabul edilebilir bir kalite düzeyini elde etmek için belirli laboratuar ortamında ve micropost düzeni optimizasyon ve adaptasyon gerektiren birçok işlem basamakları vardır. Ticari micropost dizileri hazır t artık mevcutsürekli yüksek kalite ile o-kullanım (&quot;off-the-raf&quot;) biçimi. Bu nedenle onlar bünyesinde üretimi için gerekli olan karmaşık ve uzun üretim sürecinin bir alternatiftir. Bu yazıda, bir ticari olarak temin edilebilir micropost dizisi, tek bir aydınlık alan mikroskopi görüntü kullanılarak selüler kuvvetleri haritasını hazırlamak için kullanıldı. Daha da önemlisi, bu makalede açıklanan ve bu yazının tamamlayıcı malzeme olarak yüklenebilir MechProfiler adında bir tam fonksiyonlu açık kaynak yazılımlar, belgelemektedir. Yazılımın bir aktif tutulan versiyonu da http://www.orthobiomech.ethz.ch adresinde bulunabilir. Bir &quot;off-the-raf&quot; tahlil ve uyumlu bir açık kaynak analiz yazılımı kombinasyonu belirgin doğru TFM deneyler gerçekleştirmek için giriş engel düşürür. Temiz oda tesisleri veya yazılım geliştirme uzmanlığı ya erişimi olmayan araştırmacılar başarıyla hücresel güçleri analiz edebilirsiniz. Bu mechanos odaklanmak için bir kullanıcı sağlayanensitivity tahlil çıktı ziyade teknoloji kendisi ve daha geniş bir topluluk için kullanılabilir çekiş gücü ölçümleri yapar. Ayrıca, bu micropost diziler tam otomatik tarama doğru yolunu açmak için önemli bir adımdır. MechProfiler analiz yazılımı dosya biçimi tiff, png, bmp ve jpg görüntüleri işler. Görüntüler floresan, faz kontrast ya da parlak alan ışık mikroskobu kullanılarak alınabilir. Başına bir program (mevcut: Şekil 12) ücretsiz Matlab Derleyici Runtime ile birlikte çalışır ve temel algoritmaları yaklaşık 1 dakika içinde tek veya birden fazla hücreleri ile görüntüleri işlemek için kullanıcı sağlayan aerodinamik görüntü işleme, izin verir. Ayrıca, bu hücreler ya yaşayan olabilir ya da &quot;sabit&quot;. MechProfiler yazılım ölçüde kaliteli ticari micropost diziler tekrarlanabilirlik dayanarak veri analizi verimini artırmak mümkün, daha spesifik olarak, varsayılan &amp; #8220 non-deflected &quot;dizisindeki her yazının konumunu ideal ızgara karşı kabul edilebilir (bu çalışmada kullanılan dizilerde ızgara imalat sapmalar az 100 nm idi). Kısacası birinde, ilgilenilen bölgeye onları ekinler, analiz için görüntü dosyaları bir seçim açar hücreler tarafından kapsanan mesajları tanımlar veya atılması gereken sonrası pozisyonları belirler deplasmanlar / İdeal ızgara karşı güçlerini hesaplar ve nihayet Standart ofis-tabloya dahil, ihracat için bir olasılık tüm hücre özel verileri kaydeder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS-buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropost array&#160;</td>
			<td rowspan="2">MicroDuits</td>
			<td rowspan="2">MPA-col1/FN</td>
			<td>Micropost dimensions:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td>
			<td>&#216;= 6.4 &#181;m, l=18.2 &#181;m; grid=&#160;13 &#181;m, kcorr= 2.87 nN/&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100.983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td>Coomassie blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol ACS p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>WillCo Wells BV</td>
			<td>GWSb-3522</td>
			<td>35 mm diameter, aperture 22&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-100 Eclipse</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3-L3</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Camera controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS Fi2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Açıklanan tekniğin ana avantajı rutin laboratuvar çalışmaları içine hızlı ve etkin entegrasyonu için sadeliği ve potansiyeli yatıyor. Açık kaynak yazılım ile eşleştirilmiş yüksek kalitede ticari sensör dizileri kombinasyonu olur, aksi takdirde görüntü analizi ve yazılım geliştirme bilgisine temiz oda tesislerine ve derinlemesine erişimi gerektirir mekano-hassasiyeti hakkında bilgi vermektedir. 1 sunulan yöntemin iş akışını gösterir Şekil. Bu microp...

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays at JoVE.com

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Görüntüleme.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

Video: Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Biyomühendislik

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Mikroelektrod Diziler Kullanarak siRNA Bağlanan Hücre Yüksek verim, Siteye özgü Transfeksiyon (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., global gene expression, cell division) encountered within living cells. However, such systems, used in conventional macro-scale bulk reactors, often fail to exhibit the dynamic behaviors and efficiencies characteristic of their living micro-scale counterparts. Understanding the impact of internal cell structure and scale on reaction dynamics is crucial to understanding complex gene networks. Here we report a microfabricated device that confines cell-free reactions in cellular scale volumes while allowing flexible characterization of the enclosed molecular system. This multilayered poly(dimethylsiloxane) (PDMS) device contains femtoliter-scale reaction chambers on an elastomeric membrane which can be actuated (open and closed). When actuated, the chambers confine Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reactions expressing a fluorescent protein, allowing for the visualization of the reaction kinetics over time using time-lapse fluorescent microscopy. Here we demonstrate how this device may be used to measure the noise structure of CFPS reactions in a manner that is directly analogous to those used to characterize cellular systems, thereby enabling the use of noise biology techniques used in cellular systems to characterize CFPS gene circuits and their interactions with the cell-free environment.

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Hücre-serbest Biyoloji yapışmalı femtoliter Odası Diziler

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

In Vivo Nöral Kayıt için Ti3C2 MXen Mikroelektrot Dizilerinin İmalatı

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...