This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

Micropost Dizileri 1. Kültürleme Hücreler Not: Tüm adımlar sterilite sağlamak için bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Burada verilen miktarlar T25 hücre kültürü şişeleri içindir. Hücre kültürü ortamı tarifi ve hücre tohum yoğunluğu, kemik kanseri hücre çizgileri HuO9 ve M132 için optimize edilmiştir. <ol><li> Bir micropost dizisi üzerine tohumlama için hücre kültürü hazırlayın. <ol><li> Standart ışık mikroskobu kültür şişesi koyarak hücre kültürü kalitesini kontrol edin. Hücreler kaplıdır ne kadar kültür şişesi alt tahminine göre tipik bir büyüme ve morfoloji göstermektedir emin olun. % 70 -80% A kapsama sağlıklı bir büyüme oranını yansıtır. Onlar ölü hücreleri ve / veya büyümüş kültürünü temsil olarak hücrelerin yüzen miktarına dikkat edin. </li><li> 4 mi 1x Fosfat ile orta ve yıkama kaldırarak Hücreleri tripsinize edin salin (PBS) tampon tamponlu. Hücre kadar oda sıcaklığında 0,8 ml 1 x tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin ve inkübeyaklaşık 2-4 dakika sürer s sökülmüş. Mikroskop ile süreci kontrol ve bazen yerinden oynatmamaya desteklemek için hafifçe şişeyi hafifçe vurun. </li><li> 5 ml hücre kültür ortamı (Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 cenin sığır serumu (FBS ile / F12),% 1 penisilin / streptavidin (Pen / Strep)), reaksiyonu durdurmak için hala oturup bakiye hücrelerini yıkamak için ekleme balona en altta. Daha sonra homojen bir karışım elde etmek için yukarı ve aşağı birkaç kez bu süspansiyonu pipetle. Etkili bir yerinden oynatmamaya kazanmak için balonun orijinal büyüme alanı boyunca tüm çözümler pipetle emin olun. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe, hücre süspansiyonu aktarın ve 3 dakika boyunca 0,5 x g&#39;de bir masa üstü santrifüj kullanılarak da santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve yukarı pipetleme ve 5 kat aşağı 5 ml ortamda hücre pelet yeniden askıya. Bunu yaparken kabarcıklarının oluşumunu önlemek için emin olun. </li><li> Bir hücre sayımı odacığı ve bir ışık mikroskobik kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemekpe. Hücre agrega için hücre sayım odasında hücre süspansiyonu kontrol ve sonraki deney için tek tek hücrelere sahip sağlamak. Pipet hücreleri onları ayırmak için agrega oluşturmak üzere tekrar ve birkaç kez aşağı eğilimi varsa. </li><li> 25.000 hücre / ml hücre solüsyonu elde etmek için yeterli bir ortam maddesi ile bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Kapalı tüpü birkaç kez ters yüz edilerek iyice karıştırın. </li></ol></li><li> Hücre tohumlama için micropost dizisi hazırlayın. Kritik Not: Bu potansiyel microposts zarar verebilecek doğrudan gibi istenmeyen kabarcıklar tanıtıldı, özellikle micropost dizisi üzerine pipetle etmeyin. Ayrıca, micropost dizisi asla kılcal kuvvetler microposts çöken yol olarak oluşan kurur emin olun. <ol><li> Bir çift cımbız kullanarak bir 12 oyuklu plaka iyi yüzü yukarı bakacak şekilde ve 1 ml etanol (% 99) eklenmesi ile ıslatın micropost dizisi ile cam substratın yerleştirin. 20-30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Etanol seyreltinde tarafında yaklaşık 1 ml steril deiyonize su (DI su) ilave edilmesi ve bir transfer pipeti veya aspirasyon cihazı kullanılarak yaklaşık olarak 1 ml aspire aşamalı olarak gerçekleştirilebilir. Bu adımı en az 3 kez tekrarlayın. </li><li> Ekleme ve yaklaşık olarak 1 ml aspire aynı şekilde PBS-tamponu ile DI-su değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li><li> Ekleme ve yaklaşık ortam 1 ml aspire ortam ile PBS-tampon değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Hazırlanan her micropost dizinin üstünde pipetle 1 ml hücre solüsyonu (25.000 hücre). Çok-yuvalı plaka yakın ve bir kuluçka transfer (CO 2 5%, 37 ° C). Hücreler yapışır ve 6 -7 saat microposts üstünde büyümek edelim. </li><li> Bir ışık, bir mikroskop kullanarak bazen yapışma sürecini inceleyin. Hücrelerin en Birden microposts yayılmış görünür olduğunu kontrol edin. </li></ol> 2. Tespit ve Boyama Hücreleri Not: Tüm adımları veBurada verilen miktarlar 12-çukurlu bir plaka tek bir oyuk içindir. Bu microposts çökmesi ile sonuçlanır herhangi bir sıvı, bir aspirasyon sonra kuyuların Bir kurumasını önlemek için bir seferde on iki kuyu dörtten fazla işleme sokulması tavsiye edilmektedir. <ol><li> Kuyudan aspire orta ve yıkama hücreler 1 ml PBS tamponu ile 2x. Inkübasyon sırasında micropost dizisi üzerinde biriken hücre debrisini uzaklaştırmak için ve ölü hücreleri ayırmak için PBS ile yıkama sırasında hafif bir kuvvet uygulamak için emin olun. </li><li> 5 dakika boyunca 0.5 ml% 3.7 tamponlu formaldehit solüsyonu ile hücrelerin sabitleyin. </li><li> 1 ml steril DI su ile micropost dizi 2x yıkayarak formaldehit çözüm değiştirin. </li><li> Yaklaşık 90 sn için (% 50 su,% 40 etanol ve% 10 asetik asit içinde% 0.05 Coomassie Brilliant Blue) boya ile hücrelerin Leke. 1 ml steril DI su ile 2x kapalı aşırı boyama çözüm yıkayın. Dizi micropost 1 ml distile su ekleyin. </li><li> Bir ışık mikroskobu kullanılarak boyama sonucu kontrol edin. Tekrarlama tHücre gövdesi görüntülenmiştir çok sönük ise o adımı boyanarak. </li><li> 4 ° C &#39;de bir buzdolabında üzerine boyanan hücreler ile mağazası micropost dizileri. Her zaman su altında tutmak için emin olun. </li></ol> 3. Hücre Görüntüleme Not: Adım 4 sadece sonsuzluk düzeltilmiş optik olmadan mikroskoplar için de geçerlidir. <ol><li> Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ince bir cam alt kısma sahip bir Petri kabı, 2 ml DI-su ilave edilir. </li><li> Microposts yukarı bakacak şekilde görüntüleme çanak içine bir cımbız kullanarak micropost dizi aktarın. </li><li> Işık mikroskobu bir hareketli sahnede görüntüleme Petri kabı yerleştirin. </li><li> Ölçekte sayı cam alt tabaka, silikon elastomer ve üstünde sıvı kırılma indeksleri uyumsuzluğu telafi etmek için optik yol boyunca tüm malzemelerin toplam kalınlığı temsil dek görüntüleme için kullanılan lensin tazminat halkasını çevirin. Bu microposts parlak bir görünüm gitmelidirçekirdekler. </li><li> Aşağı% 50 aydınlatma tarafında iris kapatın ve sıradan bir parlak alan modu sağlayan optik yol herhangi bir faz kontrast halkaları çıkartın. </li><li> Microposts gözlem tarlada yatay bir çizgi oluşturacak micropost dizi aynı hizaya getirin. Bir başlangıç ​​noktası (örneğin, sol üst) tanımlar ve sayısız görüntüleri çekerken micropost dizisi tarayarak sahne üzerinde Petri kabı adım adım hareket ettirin. </li><li> 20X veya 40X objektif kullanarak kamera için en yüksek çözünürlük ayarı ile tüm görüntüleri çekin. Görüntünün merkezinde tek bir hücreyi hedefliyoruz. </li><li> Micropost ipuçları odak kadar madde boyunca z ekseni boyunca hareket ettirin. Mikroskop ince ayar odak tekerleğini kullanın ve yaklaşık 2-3 um için micropost alt odaklanarak doğru çevirin. </li><li> (Bir seferde görüntüleme parametreleri tek doğru süpürme tek dizi bölümünün test görüntülerinin serisini alarak standart bir görüntüleme prosedürü oluşturulması, örneğin, maruz kalma süresi,iris ayarı, lamba ayarları vb.) MechProfiler görüntüleri analiz ve hızlı ve güvenilir bir analiz için uygun bir parametre setini belirler. </li></ol> Açık Kaynak Yazılım &quot;MechProfiler&quot; 4. Görüntü Analizi Not: Tüm yazılım fonksiyonları sol fare düğmesini kullanarak bir işaretleme cihazı ile aktif hale getirilebilir. Ancak, eğitimli operatör verimli iki elle görüntü işleme etkinleştirmek için klavyenin sol yarısında olacak şekilde tasarlanmıştır belgelenmiş kısayol tuşlarını kullanabilirsiniz olacaktır. <ol><li> Görüntü analiz yazılımı MechProfiler başlatın ve &quot;Aç&quot; tıklayarak analiz edilmesi gerekir görüntülerin bir dizi açın. </li><li> Yazılım geliştiricisi tarafından verilen &quot;Ayarlar&quot; bölümüne tüm parametreleri yerleştirin. Özel yazılım el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilen prosedürlere göre (örneğin, kontur eşiği ve minimal mesafe) yapılandırılmalıdır parametreleri belirleyin. </li><li> Görüntüyü analizs birer-one &quot;Kırp&quot; seçeneğini kullanarak, ilgi alanına bunları kırparak (tıklayın ve fare düğmesi ile sürükleyin basılı). Çizilmiş dikdörtgenin içine çift tıklayınız Bu eylemi tamamlamak için. </li><li> &quot;Hücre hatlarını çizin&quot; ve hücre bağlı olduğu tüm microposts dahil çizim için çapraz saç imleci kullanın tıklayarak her görünür hücre anahat tek-tek işaretleniyor. </li><li> &quot;Sil Mesajlar&quot; linkine tıklayarak istenmeyen microposts atın ve çizim çapraz saç imleci kullanın. Görüntü bölümü dışında bir hücreye ait veya başka herhangi bir nedenle değil, ilgi hücre tarafından deflected tüm microposts sarmalar. </li><li> Yazılım alt yordamı fare tıklaması ile &quot;Sentroidler Find&quot; başlayın. Hemen yanında kendi merkezinde kırmızı bir çarpı görünür tüm microposts kayıtlı kadar &quot;Sentroidler Bul&quot; düğmesi, ayarı filtreyi ayarlayın. Filtre ayarı çok ise çok yüksek mu eğer düşük microposts, göz ardı edilecektirltiple pozisyonları tek bir micropost için işaretlenir. Bir analiz oturumu sırasında sürekli ayar filtreyi tutun. </li><li> Birden veya cevapsız micropost pozisyonları ile centroids manuel düzenleme fonksiyonu &quot;Manuel Düzenle&quot; kullanın. Tıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek söz konusu micropost seçmek için fare çapraz saç kullanın. Dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik kırmızı işaret yerleştirmek. Çizilmiş hücre anahat dışında ise böyle bir micropost atın devam etmeden önce (adım 4.5). </li><li> Bir fare tıklaması ile &quot;Izgara üret&quot; fonksiyonunu aktive ederek ideal bir micropost ızgara bulun. Pozisyon çizilmiş hücre anahat içinde mavi bir halka ile gösterilen gerçek micropost kafası, tekabül emin olun. </li><li> Bir fare tıklaması ile gelen &quot;Manuel Edit&quot; fonksiyonunu kullanarak gerekli hücre alanı içinde herhangi bir yanlış ızgara makinesi düzeltin. Qu micropost seçmek için çapraz saç kullanıntıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek Sorusuna. Görünen dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik mavi işaret yerleştirmek. </li><li> Bir micropost görüntü bölümü içindeki pozisyon ve oluşturulan ideal bir ızgara arasındaki fark esas alınarak hesaplanan sapma değerleri bir histogram almak için fare tıklaması ile renkli &quot;Hesapla sehim&quot; kullanın. </li><li> &quot;Kaydet&quot; konulu bir fare tıklaması ile değerlerin tablolar dahil olmak üzere komple bir analiz kaydedin. </li><li> &quot;Görünüm Reset&quot; ve uygun doğru klavye curser tuşu kullanılarak yapılabilir &quot;Next Image&quot;, başka bir görüntü bölümü veya klik analiz tıklayarak ya görüntü analizi devam edin. </li></ol> 5. Veri Analizi - Mechanoprofiling <ol><li> Analiz görüntüleri ile klasörden bir ofis elektronik tablo programı ile dosya &quot;results.xls&quot; açın. Bu al veri içeriyoranaliz hücrenin bütün micropost sapması ve bu tür çalışmaların (yani, alt tabaka deformasyon enerjisi) gibi standart önlemler dahil olmak üzere türev l hesaplanan değerler. </li></ol>

<ol><li>Sharma, R. I., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biomechanical+gradients+for+directed+bone+marrow+stromal+cell+differentiation+toward+tendon+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone.</a> Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).</li>
<li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).</li>
<li>Bartalena, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+assessing+adherent+single-cell+stiffness+in+tension%3A+design+and+testing+of+a+substrate-based+live+cell+functional+imaging+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device.</a> Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).</li>
<li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+Temperature+Operable+Autonomously+Moving+Bio-Microrobot+Powered+by+Insect+Dorsal+Vessel+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue.</a> PloS ONE. 7 (7), (2012).</li>
<li>Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+retraction+of+bundled+type+IV+pili+enables+nanonewton+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biology%22%5BJournal%5D)">Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation.</a> Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).</li>
<li>Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Chemo-Mechanical+Effects+of+an+Anti-Cancer+Drug+Emodin+on+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).</li>
<li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Cellular+Traction+Forces+by+Micropillar+Arrays%3A+Contribution+of+Substrate+Warping+to+Pillar+Deflection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection.</a> Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li>
<li>Lemmon, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface%3A+Enhanced+Analysis+for+Microfabricated+Post+Array+Detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Chem+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+subcellular+measurement+of+cell+stiffness+using+a+microengineered+stretchable+micropost+array+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-UK%22%5BJournal%5D)">Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane.</a> Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).</li>
<li>Roure, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+mapping+in+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Force mapping in epithelial cell migration.</a> PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).</li>
<li>Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+role+of+material+surface+topography+and+wettability+on+cell-material+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions.</a> Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).</li>
<li>Badique, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+nuclear+deformation+on+micropillared+surfaces+by+substrate+geometry+and+cytoskeleton+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization.</a> Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).</li>
<li>Sniadecki, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+microposts+as+an+approach+to+apply+forces+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells.</a> PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).</li>
<li>Weng, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicone-based+stretchable+micropost+array+membrane+for+monitoring+live-cell+subcellular+cytoskeletal+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response.</a> Lab Chip. 12, 731-740 (2012).</li>
<li>Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Post-Array-Detectors+%28mPADs%29%3A+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> J Vis Exp. (8), e311(2007).</li>
<li>Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+stem+cell+mechanobiology+on+microfabricated+elastomeric+substrates+with+geometrically+modulated+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity.</a> Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).</li>
<li>Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Micropatterning in Cell Biology.</a> Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).</li>
</ol>

The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Bu çalışma esas olarak giriş teknik ve pratik engellerin düşürerek çekiş kuvvet mikroskobu alanını ilerletmek istiyor. Bu engeller iki taraftan geliyor. Öncelikle çoğaltılabilir imalatları ve deneysel bir micropost dizisi komisyon için aşılması gereken çok sayıda önemsiz olmayan teknik zorluklar bulunmaktadır. Tipik bir deney yüzlerce veya hücrelerin hatta binlerce analizini gerektirebilir akılda tutarak - İkincisi, benzer olmayan önemsiz tek hücre güçlerinin güvenilir bir yarı otomatik analizi için ihtiyaçtır. Yukarıda açıklanan teknikler yerleşik mühendislik uzmanlığı yok hücre biyolojisi laboratuvarlarında içinde micropost tabanlı çekiş kuvvet mikroskopisi erişilebilir hale getirmek için geliştirildi. Bu makalede sunulan sensörler ve analiz teknikleri olmayan uzmanlar kolayca ve doğru bir tek hücre tarafından uygulanan kuvvetleri analiz için izin vermelidir. Apart hücre biyolojisi l erişimdenen az orta dereceli parlak alan mikroskobu ile ab, anlatılan yöntemler birkaç ek teknik elemanlar gerektirir. İşte çoğu kullanıcı tekniğin güç ve çok yönlülük rağmen, hatta sınırlı tecrübesi ile geçerli çekiş kuvvet mikroskopisi deneyler gerçekleştirebilirsiniz. Yine de dikkate alınmalıdır sunulan protokolünde üç kritik yönleri vardır. İlk olarak, micropost dizileri her zaman çöküşü bu kılcal kuvvetlerden ötürü olduğuna önlemek için sıvı ile örtülü olduğundan emin olmak için gereklidir. İkincisi iyi pozlama süresi, iris diyafram ve tazminat halka pozisyonunu değiştirerek Aynı dizi pozisyonunun görüntülerin dizi alınarak yapılır edinilen micropost görüntüler için görüntüleme parametrelerini optimize etmek gerekiyor. Bu micropost ucu için doğru odak düzlemi bulmak önemlidir ve bu yönü sensörü dizilerin küçük boyutlu derinliği verilen biraz tecrübe sürer. Açıkça erişilebilir görüntü analiz yazılımı MechProfiler Tartışılan indirmeniz gerekir üçüncüsüBurada d olan ayrıntılı kullanım kılavuzu ve eğitim örnekleri indirme sitesi mevcuttur. Uygun mikroskop ayarlarını yapılandırmak üzere kılavuzda sağlanan örnekleri analiz yazılımı kullanarak bazı deneyimden sonra, kullanıcı görüntüleme kurulumu test görüntüleri kullanılacak almalıdır. Elde edilen görüntüler göre, kontur eşik değeri Benzer optimize edilmelidir. Tek bir micropost görüntü birkaç saat içinde (hücre yüzlerce analizi) istatistiksel olarak ilgili sonuçlar üretilmesini sağlayan, bağımsız olarak, bir ya da daha fazla hücre ihtiva olmadığı açık kaynak MechProfiler yazılımı kullanılarak bir dakika içinde eğitimli bir kullanıcı tarafından analiz edilebilir . Bazı ayar gerektiren başka bir yönü herhangi uygulamalı hücre boyama işleminin optimizasyonu olduğunu. Hücreler aşırı lekeli zaman yazılım doğru micropost pozisyonları kayıt başarısız olabilir. Boyama çok silik ise Öte yandan bir tespit kullanıcı tarafından daha fazla çaba gerektirirİnce hücre çıkıntıları olarak &quot;gerçek&quot; hücre anahat atlanabilir. Ancak, hücre boyama ve dizi görüntüleme işleminin sabit protokol uygulayarak bu hata için aralık kabul edilebilir ölçüde düşük olur. Bu çalışma sırasında, farklı hücre boyama işlemleri kristal mor, Tween 20 veya Triton-X ya da, Eozin ekleyerek bir boya birleşimi gibi surfaktanların varlığında çeşitli konsantrasyonlarda göre test edilmiştir. Bununla birlikte, deney önemli ölçüde değişmiştir boyamanın yoğunluğu yanı sıra istikrar deneme. Yukarıda açıklandığı gibi Brillant Blue G Sadece kullanımı hala ince hücre anahat görmek için yeterli şiddette ancak gelişmiş kontur yaklaşımı ile müdahale etmeden kombine kabul edilebilir bir hücre boyama sağlamlığını gösterdi. Genel olarak, sunulan teknik değiştirmek seçenekler vardır. Floresan mikroskopi boyama organellerin ile burada sunulan parlak alan tekniklerini birleştirerek ÖrneğinHücre mekaniği bağlamında yatan hücre süreçleri hakkında ek bilgi sağlayabilir nükleus veya aktin filament ağı gibi. Bundan başka, kullanarak uzun zincirli dialkil carboxycyanines (DII veya DIO) microposts flüoresan hale gelir. 14 Bununla birlikte, sunulan tekniği ile, her bir sapmanın kontrol etmek önemlidir. Ek Şekil 10 ve Şekil 11 potansiyel tuzaklar göstermektedir. Ters bir mikroskop kullanılarak yeşil floresan kanal (Şekil 10B ve 10C) ve Coomassie Blue G lekeli NIH 3T3 fibroblast hücre çekilen görüntüleri hatalı pozisyon analizi (Şekil 10E) giden ana micropost organları değil, onların ipuçlarını sunmak. Hücre leke ile floresan sinyalinin emilimi nedeniyle olabilir aydınlık alan modu micropost ipuçları görüntülü edilemez (Şekil 10A), geçtikten sonra yeniden odaklanabilmek için en iyi çaba rağmen. Bu ima tersidirdik bir mikroskop (Şekil 11 B-11F) sarı floresan kanal ile çekilen ges olup, burada birden fazla net görüntüler z ekseni boyunca elde olabilir. İşte kullanıcı görüntü hatalı sapma değerlerini çağıran önlemek için micropost altına yere daha yakın çok uç (Şekil 11C) de odak düzlemi ile çekilen ve emin olmak gerekir. Bu micropost deneyleri için teknik sınırlamalar olduğu not edilmelidir. Örneğin, bir tespit sapma doğruluğu optik kurulum kalitesine bağlıdır. Mikroskoplar genellikle bağlı kameranın ışık hassasiyeti piksel sayıda daha yüksek bir önceliğe sahip olduğu floresan görüntüleme için optimize edilmiştir. Doğal olarak, bu daha büyük bir piksel boyutuna sahip görüntülere yol açar. Ayrıca, hücre çıkıntılar alt tabaka dibe ulaşması halinde parlak alan görüntüleri tespit edemez unutulmamalıdır. Bununla birlikte, ticari micropost dizileri konfokal kullanılarak test edilmiştirmikroskopi. Bu hücreler, micropost dizinin geri kalanı için micropost uçları sadece yapışma teşvik eder ve bu ikili kaplama kabul gibi olduğu tespit edilmiştir. Bir diğer faktör, 0.2 um olduğu gösterilmiştir micropost tadını konumsal hatanın ortaya çıkmıştır. Birlikte 2.8 nN / um verilen yay sabiti ile bu 0.6 nN kuvvet okuma-out bir hata yol açar. Micropost deneyleri için başka bir sıkıntı çok hücre tarafından paylaşılan microposts uygulanan kuvvetler tespit edilemez olduğu gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, sadece izole edilmiş tek hücreleri analiz edilebilir. Sunulan protokol için özel bir sınırlama güvenilir sonuçlar elde etmek için kullanıcıya eğitim belirli bir miktar gerektirir hassas kontur yaklaşımının doğru uygulama, türemiştir. Micropost Dizi, bir yatay ya da gözlem alanında kenarı boyunca dikey bir çizgi oluşturacak şekilde hizalanmış bir vaziyette bulunur Ayrıca, daha hızlı bir analiz için kullanıcının görüntü almalıdır. Despite altıgen bir ızgara geometri içindeki microposts bulmak için bir yazılım algoritması fazla 5 ° eksen dışı bir dönme açısı ile microposts görüntülenmesine sınırlı olmadığı tam olmayan microposts, daha sonra yol içeren olmadan zor bir görüntü bölümü kırpmak hale aslında &quot;Izgara Oluştur&quot; fonksiyonu bir başarısız için. Böyle bir durumda kullanıcı micropost pozisyonları analiz başlamadan önce entegre döndürme işlevini kullanabilirsiniz. Tarif edilen yöntem esas olarak iki kemik kanseri hücre çizgileri, HuO9 adlı bir parental hücre çizgisi ve M132 cinsinden türetilmiş yüksek düzeyde metastatik hattı karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu kapsamda yüz altı üstü tek hücreli görüntüleri parlak bir alan modunda çekilen ve MechProfiler yazılımı kullanılarak analiz edildi. Sonraki veri madenciliği ebeveyn hücre hattı HuO9 biraz daha kuvvet uygular ve tipik metastatik hücre hattının M132 hücrelerin daha fazla hücre başına microposts kapsadığını ortaya koymuştur. Ancak hücrelermuhtemel sonuçların geniş katkıda tespitin anında, hücre döngüsünün farklı aşamalarında bu nedenle senkronize ve değil. 24 saat varan süreler boyunca canlı hücre görüntüleri alarak, başkalarının, formayı kesmek göç ve farklı hızlarda (ek videoları görmek) ile tekrar göç oysa yayıldıktan sonra birçok hücre onların ilk pozisyonda kalmasını bulunmuştur. Bu hücrenin mekanik profil genellikle sabit değildir ve bir hücre nüfusu üzerinde, hatta mevcut aktivitesine bağlı olarak tek bir hücre içinde büyük ölçüde değişebilir gösterir. Başka bir faktör hücre hücreleri düz yüzeylere yapışır ve dakika adımlarla geçirebilirsiniz klasik TFM, aksine başka micropost ulaşmak için ayrık göç adımları gerçekleştirmek için zorlanan bir micropost dizisinde bu olabilir. Ancak, bu küçük adımlar analiz etmek için çok ileri m erişimi gerektirir, fokal adezyon noktalarının floresan görüntüleri çekmek için gerekliicroscopes ve son derece ayrıntılı görüntü analiz yazılımı. Bununla birlikte, daha büyük nüfus içindeki mekanik profillerin dağılımı çoğu hala bir hücre hattının bir belirleyici özelliğidir. Bu nedenle hücrelerin geniş bir sayısı karakterize etmekte, yüksek verimli bir metot gereklidir. Burada sunulan manuel görüntüleme işlemi ve açık erişim yazılımı tam otomatik mikroskop sistemleri için ölçekleme için büyük bir potansiyel barındırır. Özetle sağlam çekiş kuvvet mikroskopisi yaklaşımı standart bir cep biyoloji laboratuarında kolayca adoptable olduğu sunulmuştur. Görüntü analizi, hücre tohumlama işleminden itibaren tüm iş akışı, basit ve etkilidir. Burada anlatılan protokoller tamamen işlevsel olsa da, gelişmeler de canlı hücre görüntüleme görüntü dizilerinin analizi basitleştirmek dik düzenleri ve gelişmekte olan prosedürleri ile micropost dizileri idare edebilmek için analiz algoritmaları adapte devam etmektedir. Kemik kanseri hücre li sonuçları bağlamındanes, burada tarif edilmiş olan yaklaşımlar bu tür tahliller, kemik kanseri hastalarından biyopsi hücrelerin metastaz potansiyeli tahmin klinisyenlerin sağlayarak, prognostik değer tutabilir olup olmadığını tespit etmek için klinik biyopsilerinden ekran hücreleri kullanılabilir. Böyle bir deney tedavi stratejileri etkileyecektir. Diğer potansiyel uygulamalar, potansiyel olarak, ilacın etkinliğinin veya toksisitesinin tesis edilmesine yardımcı olarak, düz kas hücreleri ya da kardiyomiyositlerde gibi mekanik olarak aktif hücreler üzerinde test farmasötik olarak aktif bileşiklerle ilgilidir.

Mekanik-duyarlı hücre bazlı deneyler mekaniği hücre biyolojisi oynayabileceği role yansıtan geniş bir uygulama yelpazesi ile, yapışık hücrelerin araştırmak için izin verir. Bu uygulamalar genellikle hücre içi süreçleri ya da tam hücreli davranışını sürücü altında yatan mekanizmalar odaklanın. Bir yandan, bu tür ekstra hücresel matris bileşiminin ya da matris sertlik gibi dış çevre faktörleri önemli ölçüde bir hücrenin mekanik ve biyolojik tepkiyi etkiler. 1, aynı farmasötik olarak aktif bileşiklerin çoğu sınıflarının kullanımından sonra gözlenebilir, etkileri olan vardır genellikle hücre kültür modelleri kullanılarak karakterize edilmiştir. 2 tür iskeleti yapısı ve fonksiyonu değişiklikler ile ilişkili hücre fenotipi işaretli değişiklikleri uyarabilir spontan veya deneysel genetik mutasyonların neden olduğu gibi diğer taraftan genotipik özellikleri üzerinde. 3 Bu örnekler vardır Birçok olası birkaçkonular hangi hücrelerin mekanik fenotiplendirilmesi ilgili olduğunu ve tüm bu yararlı micropost dizileri ile incelenmiştir. Bu yazının yazıldığı, yaklaşık 200 makaleler hücre micropost etkileşimini anlatan yayınlanmıştır. Bu eserler micropost saptırma ilkeleri teorik yönlerini yanı sıra kendi imalatı pratik talimatlar tartışmak. Hücreler ve esnek micropost dizilerin etkileşimini anlatan ilk makale, sürekli yumuşak yüzeylerde Tan ve ark nanonewton ölçekli hücre kasılma, tahmin etmek için kullanılır, klasik çekme kuvvet mikroskobu (TFM) aksine 2003. 4&#39;te Tan ve arkadaşları tarafından yayımlandı. silikon elastomerden yapılmış çok yakın aralıklı dikey kirişler kullanılarak bir yöntem açıklamıştır. Bu tekniğin başlıca avantajları, iki ana özelliklerinden ortaya çıkmaktadır. Tutarken İlk hücre görünür substrat sertliği değiştirmek için yalnızca tek bir micropost boyutlarını değiştirmek gerekiyorAksi takdirde sürekli ve böylece yüzey topoloji ve kimya farklılıkları kaçınarak substrat bileşimi. İkinci microposts discretely bireysel odak yapışıklıklar sırasına kuvvet ve mekansal kararları ile analiz edilebilir ve standart TFM tarafından benzer analizler doğasında olan analitik zorlukları azaltabilir bireysel yaylar gibi hareket ederler. Bugün micropost dizileri için uygulama aralığı büyük ölçüde birkaç tek hücreler için kuvvetlerin sadece haritalama aşıyor. Örneğin, Akiyama bir böcek kas gücünü bağımsız mikro robot geliştirmek amacıyla, bir micropost dizisi için bir harekete geçirici olarak güve tırtıl bir izole dorsal damar dokusu kullanımını bildirir. 5 Bununla birlikte, microposts en yayınlanmış başvurular enfeksiyon ya da kanser gibi tıbbi durumların çalışmalara yoğunlaşmıştır. Örneğin, micropost diziler Neisseria gonorrh ve paketlenmiş tip IV pili kuvvet nesil incelemek için kullanılmıştır. Sinyal kaskadları enfeksiyon artırılması ile ilişkili 6 Diğerleri hücre iskeleti hedefleyen ilaç bileşikleri ile tedavi meme kanseri hücrelerini incelemek için microposts kullandık OEA kolonileri. 7 Bir micropost sapması genellikle hücrenin varsayarak bir uç yük ile bir konsol için klasik ışın teorisi kullanılarak tarif edilir ancak micropost çok uç takılır. Bir saptırma ö neden İşte uygulanan kuvvet F micropost yönettiği &quot;bükülme sertliği&quot; k bağlıdır ve hesaplanır: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) E, I, L ve varlık Young modülü, sırasıyla atalet ve kiriş uzunluğunun alan anı ile. Alt tabaka eğilmesi ac alınmadığı Ancak, bu denklemden sonuçlar sadece ışın kesme beri iş ve hem de eğilme kuvvetlerin genel yaklaşım vermeksaymak. Microposts tipik polidimetilsiloksan (PDMS) gibi yumuşak malzemelerden yapılmış olması dikkate alındığında bu faktörlerin dahil edilmesi gereken silikon kauçuk tabanlı. . Schoen ve arkadaşları micropost (L / D) ve karşılık gelen polimerin Poisson Oranı v oranına göre bir düzeltme faktörü olduğunu göstermiştir 8 O ile verilir.: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) T eğim (v) aynı maddede bulunabilir gibi uydurma parametre a = 1.3 içeren bir devirme katsayısı olma ile: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Bu bir micropost en düzeltilmiş sertlik k corr saf eğilme sertliği k = k viraj ürün ve düzeltme faktörü corr demektirtarafından verilen: <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Bu nedenle, hücre kuvvet hesaplamaları şimdi okuma denklem (1) daha rafine varyasyon kullanılarak yapılmalıdır: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) Düzeltme etkisi kısa sürede micropost boyutları için tipik değerler kullanılır gibi daha belirgin hale gelir. Örneğin, dairesel bir kesite ve PDMS bazlı silikon lastikten yapılmış 5 um&#39;lik bir çapa sahip bir 15-mikronluk bir uzun micropost 0.77 bir düzeltme faktörü yol açar ve bu nedenle, düzeltilmemiş hesaplama% 23 tarafından uygulanan kuvvetleri hücre olduğundan fazla olacaktır. Bu daha şiddetli küçük boy oranları ile microposts için olur. Geleneksel olarak, micropost görüntü analizi de idealize kiriş eğilme kuramına dayalı olmuştur. 2005 yılında MICR kullanımına öncülük grupOPOST diziler micropost analizi için uygun bir görüntü analiz yazılımı yayınlanan 9 yazılımı yazılım lisans gerektirir ve kullanıcı her pozisyon için üç görüntüleri almak zorundadır.; iletim modu ve lekeli hücre floresan modunda başka biri micropost üst ve alt uçakları birer. Her biri için üst ve alt pozisyonları karşılaştırarak sonra yazılım bir kuvvet vektör alanı belirler ve yazı başına kuvvet gibi ilgili parametreleri hesaplar micropost. Diğer yazılım paketleri var ve bunların analizleri prensipleri kısaca bunları açıklamak gelen maddelerde belirtilen, ancak bu analitik yazılım paketleri genellikle kamuya açık değildir. 10,11 Eşleme hücre kuvvetleri için tasarlanmış micropost dizileri tüm komşu microposts arasında eşit mesafeli boşlukların avantajına sahip olan ikinci bir ortogonal micropost düzeni veya altıgen biri olmak ya da sınıflandırılabilir. Tipik microposts habir dairesel geçiş kısmına ziyaretinde ve boyutları oval ya da kare kesitli microposts de rapor edilmiştir, ancak uzunluğu 50 um ila 1,0 um çapında 10 um ve 2. 4 arasında değişir. 12,13 Micropost malzemesi olarak PDMS bazlı silikon karışımlarının kullanılması karışımı içine nano-tanecikleri ilave sağlar. Kobalt nano çubuklar ekleyerek Örneğin micropost bir manyetik aktivasyon sağlayan ve böylece potansiyel deneysel tasarımlar özgürlük başka derecesini verir. 14 Çoğu grup kapak cam gibi veya Petri kabı içinde düz sert yüzeylerde kendi micropost dizileri üretmek. Bununla birlikte, Mann ve arkadaşları son bir gerilebilir zar üzerinde oluşturulmuş bir dizi micropost bildirmiştir. 15, hücre kontraktilite açısından canlı hücre sub-hücresel dinamik yanıtları okurken bu yapışık hücreler hücre germe güçlerine uygulanmasını da mümkün kılar. Yaygın olarak kullanılan ve çoğu estabSU8 fotorezist ile bir silikon gofret üstüne mikro üretmek için kullanılan temiz oda, kısa, standart işlemlerde SNIADECKI ve ark. 16-18 arasında derinlemesine protokoller de tarif edildiği gibi micropost dizileri yapmak için yayımlanır işlemi, yumuşak litografi dayanmaktadır. Bu silikon kauçuk kalıplara aktarılması yapılar üzerinde döküm edildiği bir kopyalama işlemi ile takip edilir. İkinci bir aşamada, bu kalıplar, seçilen bir alt-tabaka üzerine bir silikon kauçuğun kullanımım başlangıç ​​mikro çoğaltmak için kullanılır. Ancak microposts için bir üretim sürecini kuran kendi uygulamasıyla ilgili yayınlar, büyük ve artan sayıda rağmen mikro mühendislik uzmanları için bile zaman önemli miktarda alır; kabul edilebilir bir kalite düzeyini elde etmek için belirli laboratuar ortamında ve micropost düzeni optimizasyon ve adaptasyon gerektiren birçok işlem basamakları vardır. Ticari micropost dizileri hazır t artık mevcutsürekli yüksek kalite ile o-kullanım (&quot;off-the-raf&quot;) biçimi. Bu nedenle onlar bünyesinde üretimi için gerekli olan karmaşık ve uzun üretim sürecinin bir alternatiftir. Bu yazıda, bir ticari olarak temin edilebilir micropost dizisi, tek bir aydınlık alan mikroskopi görüntü kullanılarak selüler kuvvetleri haritasını hazırlamak için kullanıldı. Daha da önemlisi, bu makalede açıklanan ve bu yazının tamamlayıcı malzeme olarak yüklenebilir MechProfiler adında bir tam fonksiyonlu açık kaynak yazılımlar, belgelemektedir. Yazılımın bir aktif tutulan versiyonu da http://www.orthobiomech.ethz.ch adresinde bulunabilir. Bir &quot;off-the-raf&quot; tahlil ve uyumlu bir açık kaynak analiz yazılımı kombinasyonu belirgin doğru TFM deneyler gerçekleştirmek için giriş engel düşürür. Temiz oda tesisleri veya yazılım geliştirme uzmanlığı ya erişimi olmayan araştırmacılar başarıyla hücresel güçleri analiz edebilirsiniz. Bu mechanos odaklanmak için bir kullanıcı sağlayanensitivity tahlil çıktı ziyade teknoloji kendisi ve daha geniş bir topluluk için kullanılabilir çekiş gücü ölçümleri yapar. Ayrıca, bu micropost diziler tam otomatik tarama doğru yolunu açmak için önemli bir adımdır. MechProfiler analiz yazılımı dosya biçimi tiff, png, bmp ve jpg görüntüleri işler. Görüntüler floresan, faz kontrast ya da parlak alan ışık mikroskobu kullanılarak alınabilir. Başına bir program (mevcut: Şekil 12) ücretsiz Matlab Derleyici Runtime ile birlikte çalışır ve temel algoritmaları yaklaşık 1 dakika içinde tek veya birden fazla hücreleri ile görüntüleri işlemek için kullanıcı sağlayan aerodinamik görüntü işleme, izin verir. Ayrıca, bu hücreler ya yaşayan olabilir ya da &quot;sabit&quot;. MechProfiler yazılım ölçüde kaliteli ticari micropost diziler tekrarlanabilirlik dayanarak veri analizi verimini artırmak mümkün, daha spesifik olarak, varsayılan &amp; #8220 non-deflected &quot;dizisindeki her yazının konumunu ideal ızgara karşı kabul edilebilir (bu çalışmada kullanılan dizilerde ızgara imalat sapmalar az 100 nm idi). Kısacası birinde, ilgilenilen bölgeye onları ekinler, analiz için görüntü dosyaları bir seçim açar hücreler tarafından kapsanan mesajları tanımlar veya atılması gereken sonrası pozisyonları belirler deplasmanlar / İdeal ızgara karşı güçlerini hesaplar ve nihayet Standart ofis-tabloya dahil, ihracat için bir olasılık tüm hücre özel verileri kaydeder.

<table><tbody><tr><td>T25 cell culture flasks</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-buffer</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Medium DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South America</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge vials</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Micropost dimensions: &amp;Oslash;=6.4&amp;#160;&amp;micro;m, l=18.2 &amp;micro;m; grid=13 &amp;micro;m, k&lt;sub&gt;corr&lt;/sub&gt;=2.87&amp;#160;nN/&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Ethanol abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td><td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Coomassie blue</td></tr><tr><td>Methanol ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm diameter, aperture 22&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Inverted microscope</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Camera controler</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Camera</td></tr></tbody></table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays at JoVE.com

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Görüntüleme.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

Video: Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Dizi-Dedektörleri (mPADs): Mekanik Kuvvetleri yalıtın bir Yaklaşım

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Biyoloji

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Multiplexed Transdermal Elektrokimyasal Algılama Hollow microneedle tabanlı Sensör

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single nanometer-scale pore. The signal is characteristic of the molecule&#39;s physicochemical properties and its interactions with the pore. We demonstrate that the nanopore formed by the bacterial protein exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (&#945;HL) can detect polyoxometalates (POMs, anionic metal oxygen clusters), at the single molecule limit. Moreover, multiple degradation products of 12-phosphotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in solution are simultaneously measured. The single molecule sensitivity of the nanopore method allows for POMs to be characterized at significantly lower concentrations than required for nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This technique could serve as a new tool for chemists to study the molecular properties of polyoxometalates or other metallic clusters, to better understand POM synthetic processes, and possibly improve their yield. Hypothetically, the location of a given atom, or the rotation of a fragment in the molecule, and the metal oxidation state could be investigated with this method. In addition, this new technique has the advantage of allowing the real-time monitoring of molecules in solution.&#160;

Here, we present a protocol to detect discrete metal oxygen clusters, polyoxometalates (POMs), at the single molecule limit using a biological nanopore-based electronic platform. The method provides a complementary approach to traditional analytical chemistry tools used in the study of these molecules.

Tek metalik nanopartiküller yüksek çözünürlüklü fiziksel karakterizasyonu

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Kimya

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

Eşleştirilmiş boncuk ve mıknatıs dizi Microwells değişken içbükey geometrileri ile kalıplama için

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Yüksek verimli denetimleri mümkün kılmak için AFMS'de paralel aktif konsol dizileri

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Yazar Spotlight: Quattro-Paralel Konsol Dizileri ile Aktif Prob Atomik Kuvvet Mikroskobuna Giriş

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Yüksek Verimli Büyük Ölçekli Numune Denetimi için Quattro-Paralel Konsol Dizileri ile Aktif Prob Atomik Kuvvet Mikroskobu

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray'ler

Microfabricated Post-Dizi-Dedektörleri (mPADs): Mekanik Kuvvetleri yalıtın bir Yaklaşım

Multiplexed Transdermal Elektrokimyasal Algılama Hollow microneedle tabanlı Sensör

Tek metalik nanopartiküller yüksek çözünürlüklü fiziksel karakterizasyonu

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

Eşleştirilmiş boncuk ve mıknatıs dizi Microwells değişken içbükey geometrileri ile kalıplama için

Yüksek Verimli Büyük Ölçekli Numune Denetimi için Quattro-Paralel Konsol Dizileri ile Aktif Prob Atomik Kuvvet Mikroskobu

Yüksek Verimli Büyük Ölçekli Numune Denetimi için Quattro-Paralel Konsol Dizileri ile Aktif Prob Atomik Kuvvet Mikroskobu

Yüksek Verimli Büyük Ölçekli Numune Denetimi için Quattro-Paralel Konsol Dizileri ile Aktif Prob Atomik Kuvvet Mikroskobu