Bu çalışmada Milli BioResource Projesi ile işbirliği içinde yürütülen Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji, Japonya.

Deney genel şeması Şekil. 1. 1. Reaktif Hazırlama <ol><li> Lütfen aşağıdaki grafiğe göre, 100 ml cam şişe taban orta (burada PB1 olarak bilinen) olun: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 .12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td&gt; Glikoz </td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvat </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penisilin G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (yaklaşık) </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll-sakkaroz (FS) çözümü: <ol><li> 14 ml, 50 ml tüp PB1 çözüm için aşağıdaki kimyasallar ekleyin. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6.0 g </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 3.424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll 70 PB1 çözüm sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın ve iyice çalkalayınız. </li><li> BSA, üzerinde tam bir çözülme kontrol ettikten sonra, çözüm yüzey eklemek ve bunu tutmakBSA kadar 4oC tamamen çözülmüş (&gt; 4 saat veya gece boyunca). </li></ol></li><li> 50 ml tüp dengeleme çözümü (EFS20) ve vitrifikasyon solüsyonu (EFS40): <ul><li> EFS20:% 20 (v / v) etilen glikol,% 24 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.4 mol / L sakkaroz </li><li> EFS40:% 40 (v / v) etilen glikol,% 18 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.3 mol / L * sakaroz * BALB / c veya ICR gerginlik embriyolarında 6 cryodamage daha duyarlıdır, çünkü, 0.9 mol / L sakkaroz sakaroz konsantrasyonu artırır. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 çözüm </td><td> EFS40 çözüm </td></tr><tr><td> Etilen glikol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS çözüm </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Filtrasyon ile 0.45 mikron filte kullanarak çözüm sterilizer. 4, 5 ml polistiren tüpleri ve mağaza alikotları olun ° C Bunlar yaklaşık 6 ay için kullanılabilir. </li><li> 0.75 M sakkaroz (TS1) içeren embriyo çözülme çözüm hazırlanması <ol><li> PB1 7.7 g sakaroz (adım 1.1 hazırlanan) çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın. </li><li> 90 mg BSA çözüm yüzey üzerine ekleyin ve tamamen eriyene kadar stand it bırakın. </li><li> Çözüm filtrasyon ile sterilize edin. </li><li> 4 ° C&#39;de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. </li></ol> Not: TS1, aynı zamanda piyasada bulunan M2 hazırlanmış olabilir. <ol start="6"><li> 7.7 g sakaroz M2 çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. </li><li> Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın. </li><li> Çözüm filtrasyon ile sterilize edin. </li><li> 4oC kısım ve saklayın. Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. </li></ol></li><li> TS2 (çözülme çözüm: 0.25 M sukroz) içeren <ol><li> Uygun olarak, PB1 veya M2 20 ml hacmi 10 ml TS1 seyreltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2. 2-hücre Mouse Embriyolar, Vitrifikasyon <ol><li> Doğal çiftleşme ya da in vitro fertilizasyon teknikleri geleneksel 2-hücreli fare embriyoları hazırlayın. </li><li> Kısım cryotube içine 50 ul EFS40. Bundan sonra, oda sıcaklığında vitrifikasyon prosedürünün geri kalanını gerçekleştirmek. </li><li> EFS20 35 mm veya 60 mm plastik Petri kabı alt kısım 50 ul. </li><li> Kültür ortamı sadece minimum miktarda kılcal bir bardak kullanarak EFS20 30 embriyolar aktarın. 2 dakika için bir zamanlayıcı başlayın. Not: embriyolar açılan alt yerleştirin. Bu embriyoların verimli dehidratasyon yapar. Stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin. Şekil olarak Susuz embriyolar çekmiş, bir morfoloji göstermektedir. 2A.Onlar yeterince kurutulmuş değilseniz, 1 veya 2 dakika bekleyin. </li><li> Yaklaşık 1,5 dakika, çözümün sadece asgari miktarı ile EFS20 damla embriyolar pick up. Adım 2.1 &#39;de hazırlanan cryotube EFS40 aktarabilirsiniz. Not: En iyi sonuç için, tüm embriyolar yaklaşık 2 dakika EFS40 aktarılır, böylece embriyolar toplayıp zamanlamasını ayarlayın. </li><li> 1 dakika bekleyin. </li><li> Cryotube doğrudan sıvı azot (LN 2) içine koyun. </li></ol> 3. Vitrifiye 2-hücreli Fare Embriyolar Çözülme <ol><li> Çözülme önce, kurtarılan embriyolar embriyo kültür ortamı 10 ul damla (3.13 adım) bir yemek hazırlayın. CO 2 inkübatör petrol ve yer ile çanak kullanana kadar örtün. Not: Bu deneyde kullanılan rutin embriyo kültürü için herhangi bir ortam olsa da, M16 orta gibi yüksek ozmolarite medya önermektedir. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar TS1 Sıcak </li><li> Bir yüz maskesi ve cryogloves koyun. LN 2 t açınank ve embriyoları içeren bir cryotube almak. </li><li> Tüpün üst hızla açmak ve LN 2 atın. Sonraki aşamada dondurma TS1 önlemek için 30 saniye bekleyin. </li><li> Tüpe TS1 850 ul (37 ° C) ekleyin ve çözüm eşit eriyene kadar nazik pipettings (25 saniye içinde on kat) tarafından çözüm karıştırmak için bir 1000ul pipet kullanın. </li><li> , Plastik bir 60 mm Petri kabında (ya da bir saat camı) (Şekil 3A) tüp tüm hacim aktarın . Not: Adım 3.14 CO 2 inkübatör yerleşene kadar Embriyolar oda sıcaklığında (22-25 ° C) ele alınmalıdır. </li><li> 3 dakika süreyle bir zamanlayıcı başlayın. </li><li> Embriyoları içeren orta çanak (Şekil 3B) yüzeyine yayılmış kadar çanak TS1 yaklaşık 2 dakika, hafifçe sallayın. Not: Bu TS1 için transfer yüzeyine yakın yüzen embriyolar nedeniyle dibe yardımcı olacaktır. </li><li> Th üzerine üç 50 ul TS2 damla koyune kap (Şekil 3C). </li><li> TS1 3 dakika sonra, bir stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin, onlar biraz çekmiş olmalı. TS1 önceki embriyo morfolojisi (Şekil 2B) ve daha sonra (Şekil 2C). Not: embriyoların hala şiş, 3 dk ile 1 TS1 içinde saklayın. </li><li> Embriyoların Pick up ve TS2 ilk damla (Şekil 3D) aktarabilirsiniz. 3 dk için Sayacı başlat </li><li> 3 dakika sonra, üçüncü bir damla (Şekil 3E) sonra ikinci damlasına kadar embriyo transferine ve . </li><li> Adım 3.1 hazırlanan kültür ortamı embriyoların transferi. Embriyolar Şekil şeklinde. 2D. </li><li> CO 2 inkübatör yerleştirin çanak. Yaklaşık 10 dakika sonra, TS2 yapılmıştır sakaroz yıkamak için kültür ortamı sonraki düşüş embriyo transferi. </li><li> Embriyo transferi kadar CO2 inkübatör kültür devam edin. Not: Transferi Embryçözülme, gün alıcı kadın siyon hatası os. , In vitro Uzun kültür farelerin bazı suşları embriyo canlılığı azalabilir . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Çözülme Tablo 1 ve 2&#39;de sunulmuştur ve in vivo embriyo geliştirme sonra In vitro. Bu protokolün avantajları, farelerde farklı suşları çözülme ve geniş uygulanabilirliği sonra embriyoların yüksek beka. <table border="1"><tbody><tr><td> Gerginlik </td><td> Toplam tüpler Sayısı </td><td> Vitrifiye embriyoların sayısı </td><td> Kurtarılan (No (%)) </td><td> Morfolojik olarak normal (No (%)) </td><td> Blastosist geliştirme (No (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / CA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tablo 1, ortak fare suşlarının vitrifiye çözülmüş embriyoların in vitro- geliştirme <table border="1"><tbody><tr><td> Embriyoların Durumu </td><td> Alıcı kadın sayısı </td><td> Embriyoların No transfer </td><td> İmplantasyonu siteleri (No (%)) </td><td> Canlı yavrular (No (%)) </td></tr><tr><td> Taze </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrifiye </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). C57BL/6J farelerde vitrifiye çözülmüş embriyoların in vivo- geliştirme. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Şekil 1Deney dengeleme, vitrifikasyon ve embriyo çözülme de dahil olmak üzere genel şeması. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Şekil 2 çözülme her aşamada embriyo morfolojisi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Şekil 3 embriyo prosedür Eritme. Tüm işlemler, oda sıcaklığında yapılır. (A) cryotube TS1 (37 ° C) 850 ul ekleyin ve bir plastik tabak üzerine cryotube çözümün tüm hacim transferi. Şu anda, embriyoların Şekil gösterildiği gibi şişmiş bekliyoruz. 2B. (B), çanak yüzey üzerinde yavaşça sallayarak Spread çözüm. (C) üç 50 ul damla TS2, plastik tabak yerleştirin. (D), TS2 ilk damlasına kadar embriyolar transfer. Şekil olarak 3 dakika sonra, embriyolar shurunken bekliyoruz. 2C. (E), onları seri transferKalan TS2 içine ly sonra kültür ortamına düşer ve.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

1985 2 Rall ve Fahy fare embriyo vitrifikasyon ilk rapordan bu yana, çözdürme sonrası embriyo beka artırmak için bazı teknik iyileştirmeler yapılmıştır. En başarılı değişiklikler düşük toksisite ve membran geçirgenliği yüksek, çünkü bir dölveriminin olarak etilen glikol kullanımı sağlandı. Gibi avantajlar sağlar; bize 4 oda sıcaklığı donma embriyolar ele diğer vitrifikasyon yöntemleri soğuk ısılarda teslim embriyo gerektirir ve her zaman BALB / c 6 farelerin bazı suşları için geçerli değildir. Ilk etilen glikol bazlı vitrifikasyon Kasai ve ark tarafından geliştirilmiştir. 1990 5,7. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Bu nedenle, burada açıklanan Vitrifikasyon yöntemi uygulaması olması olabiliraraştırma modelleri gibi bir çok laboratuar fareleri kullanarak licable. Aynı yöntem morula ve blastosist aşamalarında 8 ve sıçan embriyolar 9, fare embriyoları için de kullanılabilir . Ancak, son zamanlarda cryotubes kalitesi, donma-çözülme sonrası embriyoların sağkalım oranları etkileyebileceğini bulduk. Bu nedenle, iç yüzey sırlama embriyolar (bkz. Tablo özel reaktifler ve ekipman gibi) önce düzgünlük için cryotubes incelemek için esastır. Vitrifikasyon yöntemleri geleneksel yavaş dondurma yöntemlerine göre birçok avantajı var, ancak doğal olarak ulaştırma amacı açısından bir dezavantaj var. Vitrifiye embriyolar aşağıda -120 tutulmalıdır ° C canlılığını korumak amacıyla, kuru nakliyatçılar genellikle güvenli taşınması için kullanılır. Kuru nakliyatçılar ağır ve hantal, ve bunların gidiş-dönüş, özellikle uluslararası taşımacılık, pahalı. Biz şimdi yeni bir vitrifikasyon yöntemi henüz gelişmekte olanvitrifiye embriyolar en az 7 gün 10 için (-80 ° C ile ilgili) kuru buz sıcaklığında saklanan olabilir. Bu yöntem, yeni nesil vitrifikasyon olmalıdır.

<table border="1"><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Sığır serum albümin </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Etilen glikol </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 orta </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 orta </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo Bakalit </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Kriyojenik Flakon&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Fare embriyo Kriyoprezervasyon birçok suşu farelerin genetik modifikasyon tarafından üretilen ve sayısı sürekli geçen yıl artmaktadır çünkü, biyomedikal bilimler destekleyen bir teknolojik temelini oluşturmaktadır. Onun teknik gelişme, daha sonra, 1980&#39;lerin sonlarında 2 geliştirilen vitrifikasyon yöntemleri takip 1970&#39;lerde 1 yavaş dondurma yöntemleri ile başladı. Genellikle, ikinci teknik çabukluk, basitlik, ve kurtarılan embriyoların yüksek beka avantajlıdır. Ancak, içerdiği cryoprotectants son derece toksik ve sonraki embriyo gelişimi etkileyebilir. Bu nedenle, teknik çözümleri 4 soğutulur bile, farelerde belirli suşları için geçerli değildi ° C embriyo işleme sırasında toksik etkisini azaltmak için. RIKEN BioResource Merkezi, 5000&#39;den fazla farklı genetik geçmişleri ve fenotipleri ile fare suşlarının 3 korunur ve bu nedenle bir vitrifikasyon te optimizechnique ile ortam sıcaklığı 4 sırlama ve çözülme (veya daha doğrusu, sıvılaştırılarak) sonra yüksek embriyo hayatta kalma faydaları, farelerin birçok farklı suşları embriyolar cryopreserve yapabilirsiniz. Burada, merkezimizde başarıyla kullanılmakta olan fare embriyoları için bir vitrifikasyon yöntemi sunuyoruz. Kriyoprezervasyon çözüm yerine DMSO embriyolar 5 toksisite en aza indirmek için etilen glikol içerir. Aynı zamanda, sırasıyla Devitrifikasyon önlenmesi ve osmotik ayarlama için Ficoll ve sakaroz içerir. Embriyolar, oda sıcaklığında ele ve 5 dakika içinde sıvı azot transfer edilebilir. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Biz de kritik bir ste çünkü ayrıntılı olarak vitrifiye embriyolar çözülme sürecinin nasıl geliştiğini anlatabilircanlı farelerin etkin kurtarma için p. Bu metodolojileri, güvenli ve maliyet-etkin bir şekilde daha sonra kullanmak için fare suşlarının korunması gereken araştırmacı ve teknisyenler için yararlı olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification at JoVE.com

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

30.8K Görüntüleme.  RIKEN BioResource Center. Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Video: Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biyoloji

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Hamster Oosit ve Fare Embriyolar Toplama ve Kriyoprezervasyon

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Preimplantasyon Sığır Embriyolar, Koyun ve Keçi, Kriyoprezervasyon

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...