Kısmi fon USDA çok devlet araştırma projesi W-2171 &quot;Hayvancılık İyileştirme Germ Hücre ve Embriyo Gelişim ve Manipülasyon&quot; minnetle kabul edilmektedir. Bu makalenin video bölümü için teknik çizimler hazırlanan Ryan Callahan, sanatsal yeteneklerini de minnetle kabul edilmektedir.

1. Kriyoprezervasyon 1 Embriyolar uygunluğu Değerlendirilmesi <ol><li> Bireysel donör kadın üreme yolları hasat Örnekler stereomikroskopta kullanarak değerlendirme öncesinde 10 dakika boyunca bir izotonik embriyo holding ortama yerleştirilmelidir. Embriyolar embriyo transferi döl Ebeveyni belirlenmesini sağlamak için birbirinden ayrı her donör kadın tutmak için bazı olun. </li><li> Düşük büyütme (≤ 10X) kullanarak, bireysel bir donör kadın örnekleri döllenmemiş yumurtaları oluşan ayrı gruba ayrılmalıdır, embriyolar ya da devredilemez kaliteli embriyolar dejenere. Sadece kalite geliştirme genişletilmiş blastosist aşamalardan kompakt morula grade 1 veya 2 embriyoların dondurulması için uygundur ve senkron alıcı kadın kalite notu 3 embriyo ve yaklaşık 25-devret sonrası gebelik oranı vardır sürece tüm diğerleri (atılmalıdır -30%) kabul edilir. </li><li> ≥ 50X Embriyonun zona pellusida sağlam olduğunu ve zona pellusida kalarak hiçbir malzeme (örneğin, hücreler, mukus) olduğuna emin olmak için bir büyütme kaliteli grade 1 ve 2 ile genişletilmiş blastosist aşamasına embriyoları kompakt morula inceleyin. Bir çatlak ya da eksik zona pellusida veya zona pellusida sahip bir yapışkan malzeme ile herhangi bir embriyo diğer embriyolar ayrı olmalı ve atılacak ya da ayrı ayrı işlenir. </li></ol> 2. Yıkama Embriyolar Bulaşı 2 olasılığını azaltmak için <ol><li> Zona pellusida sağlam embriyolar embriyo yıkama orta ilk izotonik embriyo tutarak orta bir minimal volüm Taşı (örneğin, fosfat, antibiyotik ve sığır serum albumin, yeni doğan buzağı serumu veya polivinil alkol ile serum fizyolojik artar tamponlu). Embriyoların her donör kadın ayrı tutun ve bir kerede 10&#39;dan fazla embriyoların yıkamak için teşebbüs etmeyin. Bir seri seyreltme ≥ 1:100 ulaşmak ve birbirini izleyen her yıkama arasında değişmektedir steril embriyo taşıma ipuçları kullandığınızdan emin olmak için, birbirini izleyen her yıkama içine orta bir minimal volüm embriyolar taşıyın. </li><li> 2.1 &#39;de açıklandığı gibi 4 daha yıkar ile embriyolar taşıyın. </li><li> Viral hastalıkların bulaşmasını endişe ise, toplam maruz kalma süresi en fazla 90 saniye tripsin,% 0.25 tripsin çözüm embriyolar iki kez yıkayın. </li><li> Iki tripsin yıkar, sonra 2.1 &#39;de açıklandığı gibi 5 kat daha fazla embriyo yıkama orta embriyolar yıkayın. </li><li> Izotonik embriyo haline son embriyo yıkama, yer embriyolar orta tuttuktan sonra. </li></ol> 3. Kriyoprezervasyon 3 öncesinde Embriyolar Dehydrating <ol><li> Embriyolar hipertonik bir çözüm gibi etilen glikol veya gliserol gibi dondurucu bir ajan (CPA) (1,4-1,5 Molar konsantrasyon) izotonik embriyonun tutma orta minimal volüm transfer edilmelidir. </li><li> Ozmotik dengeye ulaşana kadar embriyolar dondurma orta (hipertonik EBM çözüm) oturmak için izin verin. Etilen glikol, gliserol, dengeleme kez etilen glikol (5 dakika) embriyolar genellikle gliserol (10 dk) daha azdır daha embriyonik hücreler daha hızlı nüfuz Çünkü. Sonra embriyolar payet (sonraki adımda açıklandığı gibi) yüklenen bu dengeleme zaman kısmı sırasında ve elde edilebilir. </li></ol> 4. Kriyoprezervasyon 0.25 ml Plastik Straw Embriyolar Yükleniyor <ol><li> Bir embriyo yükleme cihazı için 0.25 ml&#39;lik plastik saman (11,5 cm çalışma uzunluğu) pamuk fiş ucunu ve düzgün etiketli saman içine hipertonik EBM çözüm yaklaşık 1,3 cm aspiratının. Saman tapa ya ya da bir saman adaptör ile bağlı başka bir saman bağlı baskılı etiketler kullanımı da dahil olmak üzere, çeşitli etiketleme prosedürleri vardır. </li><li> EBM çözüm saman çıkarın ve saman içinde küçük bir hava kabarcığı oluşturmak için yaklaşık 0,15 cm hava aspire. </li><li> Hipertonik EBM çözüm yaklaşık 0.8 cm saman içine tek bir embriyo aspire edin. </li><li> EBM çözüm çıkarın ve saman saman içinde ikinci bir küçük hava kabarcığı (hava kabarcıkları fiziksel saman içinde embriyo izole hizmet) oluşturmak için yaklaşık 0,15 cm hava aspire. </li><li> Pamuk fiş sonuna saman içinde var toz polivinilklorür (PVC) nemlendirmek için yeterli bir hacim EBM çözüm çekmek için, belirli, tamamen saman doldurmak için yaklaşık 9,1 cm EBM çözüm aspire edin. EBM çözüm jel PVC tozu nedenleri ve saman bu sonlandırma. </li><li> PVC tozu, plastik hasır tapalar, ya da bir ısı macunu ile saman diğer ucunu Seal. </li></ol> 5. Embriyolar Kontrollü Oranı Embriyo Dondurma Makinesi içine yerleştirilmesi <ol><li> Metanol banyo veya sıvı azot buharı dondurma makineleri Ya preimplantasyon embriyoların dondurulması için programlanmış olabilir. </li><li> Yük Embry içeren payet<html> sıcaklığı, ortam sıcaklığı -6 soğutmalı olan bir dondurma makinesi içine os ° C Yük payet pamuk fiş sonuna kadar (plastik saman tapalar veya saman adaptörleri kullanılır durumda pamuk fiş sonuna konduğu ediliyor sürece). </li><li> Embriyolar devam etmeden önce en az 2 dakika süreyle bu sıcaklıkta oturmak için izin verin. </li></ol> 6. Yayımlamak <ol><li> Bir kez embriyolar -6 soğuyana ° C, bir çift maşa (veya pamuk dokunarak saman içinde EBM çözüm buz kristali oluşumunu uyarmak için sıvı azot (ya da sıvı nitrojen içinde batırılmış pamuk uçlu çubuk) süpersoğutmalı maşa kullanın embriyo üstünde veya altında ya çözüm sütun uçlu çubuğu). </li><li> EBM çözüm su, sıvı azot maruz kalan bölgede kristalize ve buz kristalleri hemen embriyo çevreleyen EBM çözüm sütun yayılacak. </li><li> 10 dakika önce daha fazla soğutma sıcaklığı ekim embriyolar tutun. </li></ol> 7. Embriyoların Sürekli Dehidrasyon <ol><li> 0.5 ° C lik bir sıcaklık -34 / dak ° C hızında Soğuk embriyolar Bu soğutma hızı embriyo devam dehidratasyon sağlamak için önemlidir. </li><li> -34 Embriyolar tutun ° C 10 dakika boyunca embriyolar sıvı azot (-196 ° C) içine dalan önce. </li><li> Uygun bir şekilde etiketlenmiş kamışı bağlı bir şekilde etiketlenmiş kadeh (sıvı azot dolu) içine yerleştirin embriyolar Kriyoprezerve ve kısa veya uzun süreli depolama için bir teneke kutu içine bir sıvı nitrojen Dewar kamışı. </li></ol> 8. Kriyoprezervasyon Embriyolar Çözülme <ol><li> Spreyi aşağıda Dewar don çizgi kalmasını sağlayarak spreyi, sıvı azot Dewar boyun çekin. </li><li> Çözülmüş olması embriyo içeren kamışı bulun, hızlı ve dikkatli bir kadeh diğer çörek ısıtmak için değil, belirli, saman kadeh kaldırmak. </li><li> 3-5 saniye (bir kırık zona pellusida 4 insidansını azaltmak için) için ek bir 25-30 saniye süreyle 37 ° C su banyosu içine saman havada tutun ve sonra daldırın. </li><li> Su banyosu, saman çıkarın, saman (saman embriyo kimliği bulaşmaya dikkat edin) silin, (saman-pamuk olmayan fiş sonuna snip bir saman kesme cihazı kullanmak mühürlü kullanarak ısı veya PVC tozu ), ya da dikkatli bir şekilde ya da plastik tapa kaldırmak ve: <ol type="a"><li> ancak senkron bir embriyo alıcıya mümkün olduğunca çabuk bir embriyo transferi cihazı ve transfer içine saman yükü (CPA olarak etilen glikol kullanılarak embriyo Kriyoprezerve SADECE), veya </li><li> sakaroz 1.0 Molar konsantrasyonu (olmayan bir nüfuz bileşik) içeren bir çanak üzerinden saman açık ucunu tutun ve saman pamuk fiş sonuna kesmek için bir makas kullanın. Sakaroz çözeltisini içine saman İçeriği serbestçe akmalıdır, ancak herhangi bir kalıntı orta saman içinde varsa kamışla hava küçük bir sütun iterek gerekli olabilir. Embriyolar 10 dakika sakaroz çözeltisini kalmaya izin ver ve sonra 10 dakika boyunca orta tutarak izotonik embriyo embriyo transferine. Yeni bir saman yüklemek ve uygun alıcı kadın transfer, embriyoların-çözülme sonrası değerlendirin. </li></ol></li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar: Çeşitli faktörlerin etkisi ve gebelik senkron alıcı kadın 5 dondurulmuş çözülmüş preimplantasyon embriyo transferi kaynaklanan canlı doğum oranları olabilir. Genişletilmiş blastosist daha kompakt morula daha az gelişmiş ya da daha ileri gelişim aşamalarında Embriyolar genellikle yanı sıra embriyoların dondurulması işlemi kompakt morula, erken blastosist, blastosist ve genişletilmiş blastosist embriyonik gelişim aşamalarında hayatta yoktur. Embriyolar kaliteli grade 1 ve kalite notu 3 embriyolar (bu genellikle düşük-çözülme sonrası gebelik oranları nedeniyle Kriyoprezerve değil) daha 2 verimi daha yüksek-çözülme sonrası gebelik oranları. Embriyo dondurma veya çözdürme embriyo prosedürler sırasında yanlış Embriyolar azaltılmış gebelik oranları sergilemek muhtemeldir. Östrus döngüleri donör kadın ile senkronize değildir alıcı kadın için transfer Embriyolar genellikle düşük gebelik oranları üretirler. (Örneğin, biyopsi veya örtülmüş), in vitro olarak üretilen ya da bir şekilde manipüle Embriyolar genellikle düşük gebelik oranları verim . Optimal koşullar altında, dondurulmuş-çözülmüş, sığır 6,7% 60-70, koyun 8,9,10,11% 65-75 ve% 60-70 tipik in vivo elde edilen embriyoların keçi transferinden sonra elde edilen gebelik oranları 12,13,14,15. Benzer şekilde, transferi sonrası elde edilen gebelik oranları, in vitro üretilen embriyolar dondurulmuş-çözülmüş, genellikle% 40-50, sığır 6,16, koyun 17% 25-35 ve% 30-40 keçi 18. ble 1 &quot;/&gt; Tablo 1 senkron alıcı kadın iç ruminant hayvancılık türleri dondurulmuş çözülmüş embriyo transferi sonrası beklenen gebelik oranları.

<ol>
	<li>Lindner, G. M., Wright, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+embryo+morphology+and+evaluation.">Bovine embryo morphology and evaluation.</a> Theriogenology. 20, 407-416 (1983).</li><li>Stringfellow, D. A., Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+sanitary+handling+of+in+vivo+derived+embryos.">Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos.</a> Manual of the International Embryo Transfer Society. , 65-68 (2010).</li><li>Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+cryopreservation+in+domestic+mammalian+livestock+species.">Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species.</a> CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).</li><li>Rall, W. F., Meyer, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+fracture+damage+and+its+avoidance+during+the+cryopreservation+of+mammalian+embryos.">Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos.</a> Theriogenology. 31, 683-692 (1989).</li><li>Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+recipient+and+embryo+factors+that+affect+pregnancy+rates+of+embryo+transfer+in+beef+cattle.">Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle.</a> Theriogenology. 56, 287-297 (2001).</li><li>Hasler, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+oocyte+recovery,+in+vitro+embryo+production,+and+embryo+transfer+in+domestic+animals,+with+an+emphasis+on+the+bovine.">The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine.</a> J. Anim. Sci. 76, 52-74 (1998).</li><li>Hasler, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+frozen+and+fresh+embryo+transfer+pregnancy+rates+in+cattle.">Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle.</a> Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).</li><li>Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+frozen-thawed+embryos+in+sheep.">Transfer of frozen-thawed embryos in sheep.</a> Veterinary Record. 120, 83-85 (1987).</li><li>McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sheep+embryos+using+ethylene+glycol.">Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol.</a> Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).</li><li>Shelton, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+viability+of+fresh+and+frozen-thawed+sheep+demi-embryos.">Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos.</a> Theriogenology. 37, 713-721 (1992).</li><li>Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ram&#227;o, R. J., Rocha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+rates+following+the+transfer+of+ovine+embryos+cryopreserved+using+three+protocols.">Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols.</a> Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).</li><li>Chemineau, P., Procureur, R., Cogni&#233;, Y., Lef&#232;vre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+freezing+and+transfer+of+embryos+from+a+bluetongue-infected+goat+herd+without+bluetongue+transmission.+Theriogenology.">Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology.</a> 26, 279-290 (1986).</li><li>Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+production+freezing+and+transfer+in+Angora,+Alpine+and+Saanen+goats.">Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats.</a> Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).</li><li>Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touz&#233;, J. L., Cogni&#233;, J., Traldi, A. S., Cogni&#233;, Y., Mermillod, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vitrification+method+allowing+direct+transfer+of+goat+embryos.">Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos.</a> Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).</li><li>Nowshari, M. A., Holtz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+goat+morulae+to+blastocysts+before+freezing.">In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing.</a> Theriogenology. 44, 983-988 (1995).</li><li>Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+embryos+from+high+performance+cows+and+the+development+of+frozen-thawed+embryos+after+transfer:+a+field+study.">In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study.</a> Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).</li><li>Mart&#237;nez, A. G., Valc&#225;rcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+in+vitro-produced+ovine+embryos.">Cryopreservation of in vitro-produced ovine embryos.</a> Small Ruminant Research. 63, 288-296 (2006).</li><li>Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caprine+offspring+born+from+fresh+and+frozen-thawed+in+vitro-produced+embryos.">Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos.</a> Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).</li><li>Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+method+for+direct+nonsurgical+transfer+of+frozen-thawed+bovine+embryos.">A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos.</a> Theriogenology. 21, 767-790 (1984).</li><li>Voelkel, S. A., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ethylene+glycol+as+a+cryoprotectant+for+bovine+embryos+allowing+direct+transfer+of+frozen-thawed+embryos+to+recipient+females.">Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females.</a> Theriogenology. 37, 687-697 (1992).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Notter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+genetic+diversity+in+livestock+populations+of+the+future.">The importance of genetic diversity in livestock populations of the future.</a> J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).</li><li>Thibier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+retrieval+committee+statistics+of+embryo+transfer-+year+2008.+The+worldwide+statistics+of+embryo+transfers+in+farm+animals.">Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals.</a> Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Embriyolar ağırlıklı olarak su oluşur Çünkü, preimplantasyon embriyolar hücre içi buz kristali oluşumunu önlemek için burada anlatılan yeterince kurutulmuş ve yavaş yavaş protokol uyarınca soğutmalı olması çok önemlidir. Soğutma işlemi başladıktan sonra, tek yönlü sıcaklık değişimi korumak ve sıcaklık dalgalanmaları önlemek için önemlidir. Belirli bir EBM çözümü için uygun bir sıcaklıkta buz kristal oluşumu (&quot;tohumlama&quot;) başlatılması kritik öneme sahiptir. Bu yavaş soğutma / preimplantasyon embriyo dondurulması için hızlı çözülme yöntemi Değişiklikler tek adımlı bir yöntem (saman yüklenen orta son sütunda sakaroz yerine EBM çözüm olduğu) 19 ve dondurulmuş embriyolar etilen glikol doğrudan aktarma yöntemi ( İlk embriyo) 20 etilen glikol çıkarmadan çözülmüş ve bir alıcı kadın rahim direkt olarak aktarılabiliyor. Etilen glikol miktarını azaltmak için doğrudan transfer (DT) alıcı kadın rahim içine yatırılır, daha önce açıklandığı gibi devam etmeden önce orta tutarak 6 cm ile 0.25 ml saman doldurmak için tavsiye edilir. Bu gönüllü bir standart sarı renkli payet DT Kriyoprezerve preimplantasyon embriyolar dondurulmuş ve sıvı azot Dewar sarı renkli kadehler saklanan gerektiğini ticari embriyo transferi sanayi içinde mevcut olduğuna dikkat edilmelidir. Ticari sektörü de takip edilmesi gereken tüm Kriyoprezerve embriyolar için özel etiketleme gereksinimleri vardır. Bu yöntemin bir alternatif vitrifikasyon 21, daha yüksek konsantrasyonlu (6-8 M) EBM çözüm, ultra hızla EBM çözüm buz olmadan bir sıvı &quot;camsı&quot; devlet değiştirmek için neden soğutulur kriyoprezervasyon olmayan bir denge yöntemi kristal oluşumu. Vitrifikasyon kompakt morula artan sıcaklık hassasiyeti nedeniyle daha az gelişimsel gelişmiş embriyoların dondurulması için muhtemelen daha uygun. Bu teknik, 2008 takvim yılı içinde aktarılan yaklaşık 500.000 büyükbaş preimplantasyon embriyolar% 55 daha fazla olduğu Kriyoprezerve 22 benzersiz germplazma kaynakların korunması için uluslararası ticari embriyo transferi sanayi uygulamanın yanı sıra 23

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> BioLife dondurma orta </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C18, C18A </td><td> 1.5 M etilen glikol </td></tr><tr><td> Emcare etilen glikol donma çözüm </td><td> ICPBio Üreme </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1.5 M etilen glikol </td></tr><tr><td> ViGro etilen glikol dondurma artı </td><td> Bioniche Hayvan Sağlık </td><td> EVM835 </td><td> 1.5 M etilen glikol </td></tr><tr><td> Emcare% 10 gliserol donma çözümü </td><td> ICPBio Üreme </td><td> IC12 </td><td> 1.34 M gliserol </td></tr><tr><td> Emcare 1 M sakkaroz çözülme </td><td> ICPBio Üreme </td><td> IC16 </td><td> 1.0 M sakkaroz </td></tr><tr><td> ViGro tek adım çözülme </td><td> Bioniche Hayvan Sağlık </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1.0 M sakkaroz </td></tr><tr><td> ViGro çözülme 1-2-3 artı </td><td> Bioniche Hayvan Sağlık </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> % 5,% 2.5, 0.5 ile% 0 gliserol, 0.5,% 0.6 sakkaroz </td></tr><tr><td> Emcare CSU kiti çözülme </td><td> ICPBio Üreme </td><td> IC20 </td><td> % 6,% 3,% 0 ile% 10.3 sakkaroz gliserol </td></tr><tr><td> BioLife holding ve transfer aracı </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C15, C15A </td><td> % 0.4 BSA (sığır serum albumin) ile modifiye PBS </td></tr><tr><td> Emcare tutarak çözümü </td><td> ICPBio Üreme </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> % 0.4 BSA (sığır serum albumin), MOPS tamponu (asal zwitterions) </td></tr><tr><td> ViGro tutarak plus </td><td> Bioniche Hayvan Sağlık </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> SYNGRO Holding orta </td><td> Bioniche Hayvan Sağlık </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> hyaluronan içerir; hayvansal kökenli herhangi bir ürün </td></tr><tr><td> BioLife modifiye D-PBS </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C06 </td><td> modifiye Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu salin </td></tr><tr><td> BioLife BSA Kesir V </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B09 </td><td> liyofilize sığır serum albumin, fraksiyon V </td></tr><tr><td> BioLife antibiyotik-antimikotik </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B01 </td><td> amfoterisin-B, penisilin G, streptomisin sülfat </td></tr><tr><td> BioLife tripsin kiti </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C22A </td><td> 25 g liyofilize tripsin, steril su, steril D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Biol-Cool kontrollü oranı dondurucu </td><td> FTS Sistemleri </td><td> BC-IV -40 </td><td> Metanol banyo dondurucu </td></tr><tr><td> Kontrol kontrollü oranı dondurucu dondurun </td><td> Cryologic </td><td> CL2200 </td><td> Sıvı azot dondurucu </td></tr></tbody></table>

cryopreservation of preimplantation embryos of cattle, sheep, and goats

Preimplantasyon embriyolar, sığır, koyun, ve keçi, kısa veya uzun süreli depolama için Kriyoprezerve olabilir. Preimplantasyon embriyolarının ağırlıklı olarak su oluşur ve hücre içi buz kristali oluşumunu dondurulması işlemi sırasında kaçınma embriyo canlılığını korumak için büyük önem taşımaktadır. Etilen glikol (EG) veya hücresel dehidratasyon kolaylaştıran bir osmotik degrade oluşturmak için gliserol (GLYC) gibi dondurucu bir ajan (CPA) - Embriyolar hipertonik bir çözüm (1.5 M 1.4) yerleştirilir. Embriyolar EBM çözüm osmotik denge ulaştıktan sonra, ayrı ayrı, dondurma için 0.25 ml&#39;lik plastik payet içine hipertonik EBM çözüm yüklenir. Embriyolar -6 ° C lik bir sıcaklık kontrollü bir oranda dondurucu yerleştirilir Buz kristal oluşumu, embriyonun çevresindeki EBM çözüm indüklenen ve kristalleşme daha hücresel dehidratasyon neden EBM konsantrasyonu embriyo dışında bir artışa neden olmaktadır. Embriyolar, sıvı azot (-196 ° C) daldı önce bir sıcaklık -34 ° C daha fazla dehidrasyon sağlayan 0.5 ° C / dak hızında soğutulur. Kriyoprezervasyon embriyolar bir alıcı (vekil) kadın aktarmak için önce çözülmüş olmalıdır. Embriyoları içeren Pipetler çıkarılır ve oda sıcaklığında 3 ila 5 saniye süreyle havada düzenlenen sıvı azot Dewar, 25 ila 30 saniye süreyle 37 ° C&#39;lik su banyosuna yerleştirilir. Embriyolar bir alıcı (vekil) kadın aktarılmadan önce çıkarılması EBM için 10 dakika süreyle sükroz 1 M çözelti içine yerleştirilir. GLYC dondurularak saklanabilir. Embriyolar EG Kriyoprezerve Ancak, doğrudan bir alıcının rahim transfer olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats at JoVE.com

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantasyon embriyolar hücresel dehidratasyon neden hipertonik dondurucu bir çözüm içine yerleştirildikten sonra Kriyoprezerve olabilir. Dengeleme sonra embriyonun çevresindeki çözüm, buz kristal oluşumu meydana gelir. Embriyo yavaş depolama için sıvı azot içine dalan önce sıfırın altındaki sıcaklıklara soğutulduğunda daha fazla dehidrasyon oluşur.

Preimplantasyon Sığır Embriyolar, Koyun ve Keçi, Kriyoprezervasyon

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

cryopreservation-of-preimplantation-embryos-of-cattle-sheep-and-goats

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K Görüntüleme.  Iowa State University. Preimplantasyon embriyolar hücresel dehidratasyon neden hipertonik dondurucu bir çözüm içine yerleştirildikten sonra Kriyoprezerve olabilir. Dengeleme sonra embriyonun çevresindeki çözüm, buz kristal oluşumu meydana gelir. Embriyo yavaş depolama için sıvı azot içine dalan önce sıfırın altındaki sıcaklıklara soğutulduğunda daha fazla dehidrasyon oluşur.

Video: Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biyoloji

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Hamster Oosit ve Fare Embriyolar Toplama ve Kriyoprezervasyon

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...