AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01: Bu çalışma SMM hibe tarafından finanse edildi. Ek destek: DW: NIH RO1DK075013, DDK ve Kléberg Vakfı; UCCC Flow Sitometri Çekirdek (NIH 5 P30 CA 46.934-15), UCCC Mikroarray çekirdekli (NCI P30 CA 46.934-14) tarafından sağlanan.

1. Akciğer İzolasyon <ol><li> Kurban steril tekniği kullanarak exsanguination tarafından takip izofluran aşırı dozda farelerin yetişkin farelerde (C57Bl6J; 18-20 g yaş 8-10 hafta). Profilleri suşları arasında biraz farklılık gösterecektir. </li><li> Cerrahi, diyafram kaldırmak, farenin her iki tarafında yanal göğüs kafesi kesim tarafından göğüs boşluğuna açılır. 3-fosfat 5mls kullanarak, hafifçe sağ kalp ventrikül perfüze akciğerlerden kan yıkayın tamponlu salin (PBS). </li><li> Tamponlu tuz (HBSS) Hanks ile dolu bir petri trakea ve büyük bronşların ve yer kaldırarak akciğer lobları parçalara ayır. Tüm akciğer lobları forseps aşağıdaki toplama çanağı kapağı üzerine doku yerleştirmek için kullanılır. Doku daha sonra float ve taşımak o kadar nemli değil tutmak için yeterli sıvı ile tek neşter kullanılarak küçük parçalar halinde doğranmış. </li><li> Farelerin biri bir hindlimb inceleyin ve flo ayarlamak için bir boyama kontrolü olarak kullanmak üzere kemik iliğinden izolew sitometri kapıları. Kemik iliği (BM) daha önce 1 açıklanan Leke. </li></ol> 2. Akciğer Doku bir Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> 5mls steril HBSS çözünmüş önceden ısıtılmış% 0.2 Worthington tip 2 kollajenaz (kedi # LS004202 Biyokimyasallar Worthington, Lakewood, NJ): Her akciğer 0.2g hacmi oranı optimize edilmiş bir doku ağırlığı kullanılarak sindirilir. Karışım 30 dakika 2,3 37 ° C su banyosuna batırılır. </li><li> Akciğer dokusunda sindirimi 10ml pipet (yaklaşık 10 tekrarlar) aracılığıyla kolayca akar kadar iyi örnek Karışım. 37 ek 15 dakika boyunca inkübe ° C daha düzgün bir tek hücre süspansiyonu doku sindirir ve sağlar tamamlamak için. </li><li> HBSS ile akciğer hücre süspansiyonu seyreltilir ve kalıntı doku parçaları dağıtmak için 5ml pipet ile çiğnemek. </li><li> Filtre sindirilememiş doku parçaları kaldırmak için 70μM bir hücre süzgeç kullanarak süspansiyonu. Örnek multipl ayrılabilirBu noktada e konik tüpler tek bir hücre süzgecinden aşırı yüklenmesini önlemek ve süresini azaltmak için. </li><li> Pelet, 1500 rpm ve süzün süpernatantı 10 dakika için hücre süspansiyonu. </li><li> 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin; yeniden süspanse hücre pelletini yavaşça oda sıcaklığına eritrosit lizis tamponu (kedi # 00-4333-57 eBiosciences, San Diego, CA) kullanılarak. Lizis tamponu inaktive ve enkaz ve hücre agrega kaldırmak için 40μM bir hücre süzgeç kullanarak hücre süspansiyonu filtre HBSS bir eşit miktarda ekleyin. </li><li> Her numunenin Pipet 10μl lekeli ve hem de akciğer ve hemasitometre kullanarak BM numuneleri hücre sayıları saymak. Not: hücrelerinin toplam hacmi kaydedin. </li><li> Pelet için 1500 rpm&#39;de 10 dakika santrifüj akciğer hücreleri tek hücre süspansiyonu. </li><li> Içeren kedi # 11.965-092)% 2 fetal bovi; prewarmed 1x10 6 hücre / ml (37 ° C) DMEM + (Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta, yüksek glukoz (Gibco, Carlsbad, CA, hem akciğer ve hem de BM hücrelerinin yeniden süspansene serum (FBS) ve 10mM Hepes. </li><li> Hoechst 33.342 boya (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO; kedi # B2261) bir 1mg/ml stok solüsyonu hazırlayın, su ve 1,4 sterilize filtre . Hoechst boyası, -80 ° C alikotları olarak saklanabilir </li><li> Tek hücre süspansiyonu 5μg/ml nihai konsantrasyonu (1mg/ml stokunun 200x seyreltme) Hoescht 33.342 boya ekleyin. </li><li> 37 ° C su banyosunda tam 90 dakika boyunca hafifçe inversiyon ve inkübe hücreleri tarafından karıştırın. </li></ol> 3. Boyama ve Sitometrisi Analizi Akciğer Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> 90 dakika sonra Hoechst lekeli akciğer hücreleri ile tüm adımları, 4 ° C veya boya efflux önlemek için buz üzerinde yürütülmelidir. 4 az 10 dakika süreyle 1500 rpm&#39;de santrifüj yoluyla Pelet hücreleri ° C ve buz boyama tamponu (PBS +% 2 FBS) hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Içeren PBS 2% 300 600μl kullanarak artık daha 1x10 7 hücre / tüp bir konsantrasyon yeniden süspanse hücrelerFBS ve 10mM Hepes. </li><li> Akciğer ve BM örnekleri kedi # 559.864) 10-15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe sırasında bir lekesiz kontrolü dahil olmak üzere;. Yeterli CD45 antikoru (genellikle 1:200 seyreltme CD45 APC (BD Pharmingen, San Diego, CA tittered ekle deneysel işlemin analiz kapılarını ayarlamak için yararlıdır. </li><li> 4 Pelet hücreleri ° C 1500 rpm&#39;de 5 dakika. Soğutulmuş boyama tamponu (PBS +% 2 FBS) 500 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri Durusu. (; Kedinin # 14-956-1D Fisherbrand, Schaumburg, IL) prechilled ek bileşenini kap polipropilen tüplere aktarın. </li><li> 2μg/ml ölü hücreleri hariç son bir konsantrasyon için örnekler (PI, PBS içinde 200μg/ml stok) propidium iyodür ekleyin. PI, akım sitometri analizi üzerine doğru floresan bilgilerini elde etmek için Hoechst 33.342 boya ile birlikte kullanılması gerekir. </li><li> Mağaza tüpleri, buz üzerinde flow sitometri analizi kadar ışık korunmaktadır. </li></ol> 4. Sitometrisi Analizi tanımlayın ve yalıtınYan Nüfus (SP) Algılama Hoechst boyası efflux kullanarak Akciğer Mezenkimal Kök Hücre (akciğer MSC) Nüfus <ol><li> Bu testte aşağıdaki araç gereksinimleri vardır: </li><ul><li> 488 nm ve UV (350-355 nm) lazerler </li><li> UV lazer yolu üzerinde mavi (450/65) ve kırmızı (675/50) filtreleri ile 2 dedektörleri. </li><li> UV kırmızı dedektörü kırmızı sinyal için yüksek hassasiyete sahip olmalıdır. Bu, eski hücre sorters ile ilgili bir sorun olabilir. </li><li> 5-10 örnek korumak için Chiller birimi ° C </li></ul><li> Lazerler hizalayın ve hücre sıralama aşağıdaki üretici protokolü için ayarlanmış. </li><li> Kırmızı (x-ekseni) ve mavi (y-ekseni) doğrusal bir ölçek kullanılarak Hoechst sinyalleri toplayın. </li><li> Sondaki yan nüfusun yeterli görüntü için izin merkezinde arsa üzerinde sağ üst G0/G1 tepe photomultiplier tüp gerilimler ayarlayın. , Hücre döngüsü, S-faz ve tüm G2 bir kısmı arsa sağ üst ölçekli olabilir. Mavi signal kırmızı sinyal zayıfsa, nispeten parlak. Tipik MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) gerilimler için 425 mavi ve kırmızı için 650. </li><li> PI kullanılarak ölü hücreleri kapılı. Standart PI yolu (uyarma 488nm, emisyon 630nm) kullanılabilir. Alternatif olarak, PI de UV lazer tarafından heyecan ve ölü hücre popülasyonu, sağ tarafında yan nüfusun (SP) arsa üzerinde ölçekli yatıyor. Bu gibi FITC ve PE gibi diğer fluorochromes PI sinyal telafi etmek için ihtiyaç hafifletir. Orijinal Goodell yöntemi 5-7 ikinci prosedürleri takip etti. </li><li> Analizi sırasında nispeten düşük bir basınç farkı korumak ve yan nüfusun sıkı bir çözünürlük sağlamak için sıralama. </li><li> SP akciğer hücrelerinin ana nüfusu dışında bir yan kolu olarak görünür. Bu nüfus Hoechst düşük denir. </li><li> Hoechst düşük / SP histogram 2,3 (F kullanarak CD45 pozitif ve negatif popülasyonları ayırmak için analizigure 1). </li><li> Hoechst düşük CD45 negatif akciğer MSC nüfus seçimi ve yolluk ardından hücrelerin içine klonlar 96 plaka 3 izole etmek için, bir tüp ya da tek hücre içine da karışık bir nüfus olarak sıralayarak toplanmış olabilir . </li><li> Sıralama akışı saptırma sıralama plaka genellikle tüp sıralama için kullanılan daha fazla dikey bir sıralama akışı oluşturmak için% 25 ayarlanır için. </li><li> Sol üst üzerine bir test akışı darbe gönderip, daha sonra 96-iyi plaka iyi sağ alt sıralama akışı hedefliyoruz. </li><li> Sıralayıcı yazılım plaka harita, her bir kuyunun içine istenilen sayıda hücre yatırmak için ayarlayın. </li><li> Tek hücre klonları izole için tek bir akciğer MSC 96-iyi bir kültür ortamı 150μl (α-MEM% 20 FBS ile takviye) içine plaka kuyunun içine sıralanır. Sıralama ardından orta bir ek 100μl eklenir. </li></ol> 5. Akciğer MSC ve Klonlar izolasyonu, Kültür ve Karakterizasyonu <ol><li> Kültürsıralama aşağıdaki e karışık akciğer MSC nüfus ve tek bir hücre klonlar genişletilmesi ve standart kültür koşulları ile aynıdır (37 ° C,% 5 CO 2 ve% 95 nem). Hücreler 16 saat boyunca aşağıdaki izolasyon uymak için izin verilir. Medya (α-MEM% 20 FBS ile takviye) her 48 saatte bir değiştirilmelidir. Hücreler daha hızlı bir şekilde hızla artmaya başlar ve% 75-80 onlar geçişli kavşak (Şekil 2) arasında ulaşmak. </li><li> Hücreler prewarmed HBSS ile durulanır ve% 0,5 tripsin / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, kedi # 25-053-Cl) ile inkübe 37 ° C 2 dakika daha az. Hücreler hücre süspansiyonu görünümünü teyit eden bir ters kapsamı kullanarak izlenir. </li><li> Akciğer MSC kültürünün mevcut proliferasyon hızı bağlı olarak 1:2 veya 1:3 oranlarında ayrılır. </li><li> Geleneksel mezenkimal adiposit ve kondrosit osteoblast soy ve kabul edilen mezenkimal belirteçlerin hücre yüzeyinde ifade ayırt etmek için akciğer MSC yeteneği iHer bir hücre hazırlama açısından değerlendirilmelidir. Sitogenetik bantlama analiz brüt kromozomal anormallikler 2,3,8-11 yokluğunda onaylamak için de yapılır . </li></ol> 6. Koloni Oluşturan Testi kullanılarak akciğer MSC sayımı (CFU-F) <ol><li> Komple MesenCult orta hücreler (Kök Hücre Teknolojileri, Vancouver, BC) 1x10 6 hücre / ml final konsantrasyonda seyreltilir. </li><li> 6x10 4 hücreler, 3x10 4 hücreler, medya 10ml 1,5 x10, 4 hücreli ve 0,75 x10 4 hücreli bir 100mm çanak final konsantrasyonları elde etmek için seri dilüsyonları gerçekleştirin . Analizler her hücre konsantrasyonu için yinelenen ya da üç nüsha halinde yapılır ve daha küçük yüzey alanları için ölçekli olabilir. </li><li> Standart şartlar altında 10 gün boyunca kültür hücreleri. Gününde 10 hücreler PBS ile yıkanır ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 100 metanol ile sabitlenir. </li><li> % 0.4 w / v Giemsa boyama çözümü ile boyanarak CFU-F koloniler Algılama(Sigma Chemical Co, St Louis, MO), deiyonize su ile 1:20 seyreltilir. Kurumaya örnekleri İzin ve koloni başına 25 veya daha fazla hücre (Şekil 3) içeren kolonilerin sayısını ölçmek. </li></ol> 7. T-hücre Silahların Yayılmasının Önlenmesi ve Apoptoz akciğer MSC Bağışıklık Özellikleri Analizi <ol><li> 6.25x10 4 akciğer MSC hücreleri de ortalama 96-kuyucuğu kaplama ve bir gecede 2 durmak için izin verilir. </li><li> CD4 + CD8 +, CD19 +, MHC-II + ve CD25 + hücreler ile tüketen ovalbumin 323-339 peptid tanıyan T hücreleri ile T-hücre reseptör (TCR) transgenik farelerin, OT-II, dalak hücreleri ile saflaştırılır Miltenyi AutoMACS hücre sıralayıcı (Miltenyi, Auburn, CA). Antijen sunan hücreler (APC), olumlu MHC-II + hücreler 12 sıralama izole edilmiştir. </li><li> APC, 4% paraformaldehid sabit PBS /% 5 BSA/2mM EDTA 3 kez yıkanmış ve 0.5μg/ml veya 5μg / m yüklül OVA323 peptid. </li><li> APC tutuklandı Simüle, büyüme, 96-kuyucuğu akciğer MSC eklenir. </li><li> Büyüktür% 95 saf CD4 + 1x10 5 hücre 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE Sigma, St.Louis MO) ile etiketli PBS içinde ve 5 dakika süreyle karanlıkta inkübe, PBS-5% BSA ile yıkanır ve sonra da eklendi DMEM% 5 FBS medya APC ve akciğer MSC hücreleri. Hücreler daha sonra 96 ​​saat inkübe edilir. </li><li> CD4 (APC Cy7), CD8 (ViolBlue); T-hücrelerinin sonra anti anti-CD40 (Cy5) ile boyanarak Vbeta 5 (PE) ve Miltenyi MacsQuant 7 kanal akış sitometresi (Miltenyi, Aurburn, CA) kullanılarak test FloJo analiz yazılımı (Treestar, Ashland, OR). Silahların Yayılmasını Önleme KAKE ortalama floresan yoğunluğunda azalma gibi arka plana göre ölçülür, T hücreleri KAKE ile etiketli ve (Şekil 4), APC için maruz kalmaz. T-hücreleri trypan mavisiyle boyama ile değerlendirildi ve canlılık bu sefer sayılır. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1: Akış sitometrik analizi ve Akciğer MSC tanımı. Akciğer dokusunda sindirmek Tek hücre süspansiyonları Hoechst 33.342 ile boyanmış ve A farklılıkları saptayabilmek için flow sitometri ile analiz edilir. forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ve B. Hoechst mavi ve kırmızı floresan. (SP) bir yan nüfusun varlığı kapı görünür. Hoechst düşük SP sonra C ayırmak için analiz edilir. CD45 negatif nüfus akciğer MSC. Akciğer SP negatif oranları CD45 pozitif tipik 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Akciğer MSC İzolasyon ve Kültür. Hücre sıralayarak akciğer MSC toplanması ardından, hücreleri α-MEM supplem kullanarak 30mm yemekler kaplama% 20 FBS ented. Taze sıralanmış hücreleri, küçük, yuvarlak ve parlak görünüyor. B . Mezenkimal fenotip ile yaklaşık 2-3 hafta koloniler belirginleştiği ve çoğalması daha açıktır. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3: Koloni Oluşturan Fibroblast Testi MSC sayımı Genişletilmiş akciğer MSC A., 10 gün sonra. CFU-F testi için açıklanan protokol başına kaplama ve Giemsa leke koloniler açıktır. B. Kolonileri büyük ve oluşan birkaç yüz hücrenin C. hücreler, mezenkimal fenotip gösterir . A &amp; B, Ölçek bar = 0,5 cm, C Ölçek çubuğu = 0.14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 KAKE Tabanlı T hücre Silahların Yayılmasının Önlenmesi Testi. Akciğer MSC antige varlığı ve yokluğun sunan hücreler (APC), + / - ovalbumin (OVA) CD40 pozitif efektör T hücre çoğalması (kırmızı daire) gösterir KAKE yoğunluğu azalma göstermektedir. T-hücre zarının KAKE floresan, her hücre bölünmesi yani ile stoichiometrically azalır. Her bölünme, ayrılma. + / - OVA akciğer MSC, APC, varlığı, CD40 pozitif efektör T hücre çoğalmasının (kırmızı daire) eksikliği gösterir KAKE yoğunluğu önemli bir değişiklik göstermektedir.

<ol>
	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Jun, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathology+of+Bleomycin+Induced+Fibrosis+is+Associated+with+Loss+of+Resident+Lung+Mesenchymal+Stem+Cells+Which+Regulate+Effector+T-Cell+Proliferation.">The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation.</a> STEM CELLS. , (2011).</li><li>Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential.">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).</li><li>Majka, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+progenitor+populations+in+skeletal+muscle+are+bone+marrow+derived+and+exhibit+different+cell+fates+during+vascular+regeneration.">Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).</li><li>Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D., Helgason, D. C., Miller, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 343-352 (2005).</li><li>Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Isolation+of+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Expression+of+an.">Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an.</a> Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).</li><li>Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -. M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).</li><li>Chateauvieux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profile+of+mouse+stromal+mesenchymal+stem+cells.">Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells.</a> Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).</li><li>Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-hematopoietic+bone+marrow+stem+cells:+Molecular+control+of+expansion+and+differentiation.">Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation.</a> Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).</li><li>Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Profiling+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).</li><li>Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Adult+Mouse+Lung+Mesenchymal+Progenitor+Cell+Population.">Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).</li><li>Waid, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+T+cell+subset+described+as+CD4loCD40++T+cells+(TCD40)+in+human+type+1+diabetes.">A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes.</a> Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz başlangıçta belirli bir nüfusun ikamet akciğer MSC izole etmek için BM hematopoetik hücreleri tanımlamak için kullanılan bir yöntemdir adapte var. Izolasyon tekrarlanması nedeniyle bu hücreler daha sonra MSC olarak karakterize edilmiştir. Kökenlerine, yetişkin fare akciğer ikamet (elde edilen BM karşı) ve 2 belgelenmiş bir fenotipik ve moleküler profil olarak tanımlanmıştır . Bu karakterize nüfusun sürekli olarak izole etmek için doku homeostazı ve hastalık sırasında biyolojik önemi ve akciğer MSC rolü daha fazla çalışma yeteneği sağlar. In vivo fare ve insan akciğer dokusunda bu nüfus son tanımı, yaralanma ve hastalık sırasında akciğer onarım kolaylaştırmak için endojen hücreleri kurtarma yönelik bir tedavi stratejisi gelişimini kolaylaştırır .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks tamponlu tuz çözüm (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> % 0.2 Worthington tip 2 kollajenaz </td><td> Worthington Biyokimyasallar </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Kırmızı kan hücre lizis tamponu </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33.342 boya </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidium iyodür </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> % 0.5 &#39;lik tripsin / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Komple MesenCult Orta </td><td> Stem Cell Teknolojileri </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> % 0.4 w / v Giemsa boyama çözümü </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4% paraformaldehid </td><td> Elektron Mikroskopi Hizmetleri </td><td> 15710 </td><td> % 16 paraformeldehyde PBS kullanılarak% 4 oranında sulandırılmış </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation &#38; characterization of hoechstlow cd45negative mouse lung mesenchymal stem cells

Doku ikamet mezenkimal kök hücreler (MSC), doku tamiri veya rejenerasyonu, fibrozis, inflamasyon, anjiyogenez ve tümör oluşumuna önemli düzenleyiciler. Bu çalışmaların yerleşik akciğer MSC, pulmoner fibrozis (PF) ve arteryel hipertansiyon (PAH) gibi hastalıklar sırasında akciğer doku homeostazı, yaralanma ve onarım sırasında bir rol oynadığını düşündürmektedir birlikte ele alındığında. Burada yerleşik akciğer MSC bir nüfus tanımlamak için bir teknoloji. Bir belirteç tanımlamanız kullanarak in vivo akciğer dokusunda bu nüfus tanımı, akım sitometri ve belirli bir hücre tipi ve fonksiyon çalışma iyi karakterize bir kök hücre popülasyonunun tekrarlanan izolasyon kolaylaştırır .

Watch this Scientific Journal Video about Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Bu yazıda, fare ikamet akciğer mezenkimal kök hücreler (akciğer MSC), genişleme, karakterizasyonu ve immünomodülatör özellikleri analiz izolasyonu göstermektedir.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

20.3K Görüntüleme.  University of Colorado Denver. Bu yazıda, fare ikamet akciğer mezenkimal kök hücreler (akciğer MSC), genişleme, karakterizasyonu ve immünomodülatör özellikleri analiz izolasyonu göstermektedir.

Video: Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Biyoloji

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...