Protokol, birden fazla uygulamaya sahip olabilecek farelerden yüksek saflıkta endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermektedir. Bu teknik, endotel hücrelerinin verimini ve saflığını koruyan daha basit bir yöntemdir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir personel araştırma görevlisi olan Nina Nguyen olacak.
Başlamak için, manyetik boncukları birkaç saniye vorteks edin. Boncukların 50 mikrolitresini CD31 ve CD102 için iki adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Bir mililitre boncuk yıkama tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
Tüpleri manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve süpernatantı bir cam Pasteur pipet ile çıkarın. Boncukları 50 mikrolitre boncuk yıkama tamponunda tekrar askıya alın. Daha sonra her 50 mikrolitre boncuğa beş mikrolitre veya 2.5 mikrogram CD31 veya CD102 antikoru ekleyin.
Boncuk süspansiyonunu, dört santigrat derecede gece boyunca veya oda sıcaklığında üç saat boyunca uç rotatör üzerinde bir uçta hafifçe dönerek inkübe edin. İmmünoboncukları dört kez yıkayın ve ardından immünoboncukları 50 mikrolitre boncuk yıkama tamponunda tekrar askıya alın. İzolasyon gününde, 25 miligram tip bir kollajenaza 25 mililitre HBSS ekleyin ve yumuşak rotasyonla inkübe edin.
Daha sonra 22 mikrometrelik bir filtre kullanarak filtreleyin. Beş ila yedi günlük bir fare yavrusunu ötenazi yaptıktan sonra, karkasa% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için diyaframı göğsün tüm lateral duvarları boyunca yukarı doğru üstün bir şekilde kesin.
Akciğerler beyaza dönene kadar kalbin sağ ventrikülüne beş mililitre soğuk DMEM enjekte edin. Daha sonra akciğerleri çıkarmak için lobları ilgili bronşlara distal olarak birer birer kesin. Akciğer loblarını, 20 mililitre buz gibi soğuk bazal ortam ile önceden doldurulmuş 50 mililitrelik bir konik tüp içine çekin.
Fazla kırmızı kan hücrelerini yıkamak için tüpü 10 ila 15 saniye boyunca elle hafifçe çalkalayın. Akciğerleri bir hücre süzgeci ile ortamdan çıkarın ve sterilize edilmiş makasla kıyın. Kıyılmış dokuyu, 25 mililitre önceden ısıtılmış kollajenaz çözeltisi ile 50 mililitre konik tüpe aktarın.
Dönen bir karıştırıcı üzerinde yavaşça çalkalayın. 20 mililitrelik bir şırıngayı 15 gauge künt bir kanüle takın ve süspansiyonu hücresel bir süspansiyona 10 ila 15 kez köpürtmeden kuvvetlice tritüre edin. Süspansiyonu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin.
Daha sonra sindirim için kullanılan konik tüpü ve hücre süzgecini 15 mililitre bazal ortam ile durulayın. Hücresel süspansiyonu dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Peletleri iki mililitre tam ortamda tekrar askıya alın.
Sekiz mililitre tam ortam ekleyin ve inkübe edin. Ertesi gün, şişeleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 mililitre HBSS ile iki kez yıkayın ve 10 mililitre tam ortam ekleyin. Hücreler% 90 ila% 95 oranında birleştikten sonra, birincil immünoboncuk izolasyonu için hazırdırlar.
Yapışkan endotel hücrelerini kalsiyum ve magnezyum olmadan 10 mililitre HBSS ile iki kez yıkayın. İki mililitre tripsin içermeyen hücre ayrılma çözeltisi ekleyin ve tüm hücrelerin şişeden kaldırılmasını sağlamak için inkübe edin. Sekiz mililitre bazal ortam ekleyin.
Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında dört dakika boyunca 400 kez G'de döndürün ve bazal ortamın iki mililitresinde tekrar askıya alın. Boncukları yeniden askıya almak için birkaç saniye boyunca Vortex anti-CD31 kaplı boncuklar. Her iki mililitre hücre süspansiyonu için 30 mikrolitre boncuk ekleyin ve kapağı sabitleyin.
Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca uç döndürücünün üzerinde bir uçta inkübe edin. Ardından tüpleri iki dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Süpernatantı aspire edin ve tüpü mıknatıstan çıkarın.
Tüpe üç mililitre bazal ortam ekleyerek ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek boncuk hücresi peletini yeniden askıya alın. Manyetik ayırıcı üzerindeki tüpü iki dakika boyunca değiştirin. Ardından, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
Son yıkamadan sonra, süpernatant berraklaştığında, boncuk hücresi peletini üç mililitre tam büyüme ortamında tekrar askıya alın ve bir T75 şişesine aktarın. Tam büyüme ortamının yedi mililitresini ekleyin ve inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri kalsiyum ve magnezyum olmadan HBSS ile tekrar yıkayın.
Sonra 10 mililitre tam ortam ekleyin. Hücreler% 90 ila% 95 oranında birleştikten sonra, ikincil immünoboncuk izolasyonu için hazırdırlar. İlk immünoboncuk seçimi, parke taşı oluşumunda büyüyen CD31 pozitif hücreleri tanımlar.
Anti-CD102 kaplı boncuklarla ikinci bir immünobead seçimi endotel hücre saflığını arttırır ve hücre popülasyonunun CD31 pozitif ve CD102 pozitif olduğunu doğrulamak için floresan aktive hücre sıralaması kullanılır. Endotel inflamatuar yolaklarını ve endotel bariyer fonksiyonunu incelemek için, P değeri 0.01'den düşük olan endotel hücreleri tarafından önemli IL-6 üretimini indüklemek için murin Cytomix ile tedavi kullanıldı. Ayrıca endotel geçirgenliği artmış göstererek transendotel direnci azalmıştır.
İzole endotel hücreleri, endotel disfonksiyon bozuklukları için endotel bazlı terapötik hedefleri keşfetmek için endotel hücre stimülasyonlarında veya bariyer fonksiyon testlerinde kullanılabilir.
