Name: preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient at JoVE.com

Biz, elektron mikroskobu için, Wisconsin-Madison Elektron Mikroskobu Tesisi Üniversitesi&#39;nden BK Ağustos teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe R01-DA026067 ve P30-HD03352 (JSM) tarafından desteklenmiştir.

1. Hazırlıklar 1-4 <ol><li> 50 ml 2.5 M sakkaroz bulamaç karıştırılarak 500 mL (GM), degrade orta tampon hazırlayın, 1M Tris-HCl, pH7.5 hisse senedi ve 0,5 m EDTA 0.1 ml 2.5 ml, pH 8.0, stok Mili S su hacmi. Çözümü, kısım ve mağaza dondurulmuş sterilize edin Filtre. </li><li> Mili-Q H 2 O. 1 mM çözüm yaparak tetrodotoxin (TTX) 1000x stok hazırlayın TTX alikotları -20 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Mili Q suyu 100 mM Tris (pH 7.5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3 ve 800 mM NaCl çözeltisi yaparak 10x Uyarım Tampon hazırlayın. Stok 4 saklanabilir ° C </li><li> Pre-cool santrifüjler için 4 ° C </li><li> Mili Q suyu 2.5 M sakkaroz (2 ml) 1 hacim Percoll (18 ml) 9 hacim ekleme Isosmotic Percoll (SIP) stok solüsyonu hazırlayın ve iyice karıştırın. </li><li> GM tampon SIP ilgili tutarların eklenmesi ve her karıştırma 3, 10, 15, ve% 23 degrade katmanları hazırlayın: </li></ol><img alt="Tablo 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" /><ol start="7"><li> P1000 Gilson Pipetman kullanarak kapaklar Beckman santrifüj tüplerine 2 ml 23, 15, 10, ve% 3 isosmotic Percoll çözümleri pipetleme degrade katmanları dökün. Katmanlar arasında arayüz katmanları hiçbir karıştırma ile açıkça ayırt edilebilir olmalıdır. Gradyanlar kullanmadan önce en az 20 dakika süreyle 4 ° C&#39;de saklayın. Gradyanlar aynı gün kullanılması tavsiye edilir rağmen 24 saate kadar saklanabilir. [Deneyimsiz laboratuvar personeli mavi boya katmanı arayüzleri görünüm için isomotic Percoll çözümler ekleyerek hazırlanıyor gradyanlar pratik.] </li></ol> 2. Fare diseksiyonu 1 <ol><li> Tüm fare hayvancılık ve ötenazi prosedürleri NIH ve Üniversite kurallarına uygun olarak yapılır emin olun. Karbondioksit boğulma ya da hayvan protokolü olarak onaylanmış bir yöntem ile yavrular (yaş P13 P21) Euthanize. </li><li> Diseksiyonu kuruluna fare Pin ve etanol ile boyun ve baş arkasında sprey. Kafatası tabanında omurilik kesti keskin bir makas kullanarak, kafatasının üst deri kaldırmak parietal kemik ve interparietal kemik arasında veya beyin ve korteks bölgelerinde arasındaki yanal kafatası kesmek. Sonra burun tabanı (sagital sütür boyunca) kafatasının kesilmiş, dikkatle yumuşak parietal kemik tarafında her yarımkürede çekerek çıkarın ve bir spatula ile korteks kaldırmak. Spatula beyincik Yukarıdaki beyin içine takın ve daha sonra korteks kepçe ve buz GM tampon yerleştirmek. Homojenizasyon adıma hemen geçin. Korteks bu SNS oluşumunu olumsuz etkileyecek, çok uzun süre buz tampon oturmak izin vermeyin. </li></ol> 3. Homojenat ve SNS 1-4 hazırlanması <ol><li> Buz GM tampon korteks yıkayın ve soğuk GM tampon 5 ml içeren bir cam Dounce homojenizatör iki korteks transferi. </li><li> Yavaşça gevşek havaneli 5-10 vuruş ile korteks homojenize (havaneli &quot;A&quot;), 5-10 vuruş sıkı havaneli (havaneli &quot;B&quot;) izledi. Darbeleri hızlı ama hava kabarcıkları neden yeterince yavaş olmalıdır. Programı 1 homojenizasyon sonra Homojenat bir resim. Vuruş sayısı, bireysel Homojenizatör ve beraberindeki havan bağlı olarak değişecektir. Gradyanlar vuruş sayısı değilse, güçlü bir SN band verdiği ayarlamanız gerekir bitirdi. </li><li> 4 15 ml konik ve 1000xg az 10 dakika süreyle santrifüj ° C sallanan bir kova rotor (Allegra 6KR santrifüj) Homojenat pelet hücresel enkaz ve çekirdekler aktarın. Bükülmüş Homojenat Resim Programı 1. </li><li> 4 5 dakika 32.500 xg&#39;de Percoll-sukroz gradient, kap tüpleri, santrifüj başına süpernatant Layer 2 mL ° C (Beckman J2-21 santrifüj, JA-17 rotor) sabit açılı rotor (uygun adaptörler kullanarak Reaktifler ve Ekipmanları Masa bakınız. ) </li><li> Pipet ve cam Pasteur pipeti kullanarak SN bant çözümü yukarıda atın. 15/23% arayüzü SN bant kapalı Pipet, buz üzerinde konik ve mağaza aktarın. Her degrade veya bir korteks 0,9-1,1 ml SN üretecektir. </li><li> 12 nM bir final konsantrasyon 1000x CaCl 2 ve nonspesifik uyarma bastırmak için 1 mcM bir son konsantrasyonu 1 mM TTX stok eklemek SNS tuz konsantrasyonu, 10x stimülasyon tampon onda biri hacmi ekleyerek ayarlayın. (Downstream SN uygulamaları ile engel olacak CaCl 2 ilavesi isteğe bağlıdır). </li><li> Micro BCA Protein Testi Kiti kullanarak SNS protein konsantrasyonu belirleyin. (Bradford protein testi Percoll çıkarımlar nedeniyle tavsiye edilmez.) </li><li> SNS protein transla doğrudan ve hızlı bir şekilde kullanılabilirTION çalışmalar. Diğer uygulamalar için SN lizat temizlenmeli veya Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanarak konsantre olabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Fare korteks süreksiz Percoll-sakaroz gradyanlar (Şekil 1), 6 bant veya kesirler homojenize ve ayrıldı (Şekil 1) görüldü. Daha önce, yüksek molekül ağırlıklı gruplarından bileşenlerinin membran ve miyelin kırık ve pelet malzeme (Tablo 1) mitokondri veya organelleri yer alan olduğunu serebral korteks 3,5 sıçan gösterildi . % 23 /% 15 arayüzü (Band 5) zenginleştirilmiş SNS içeriyordu. Sağlam SNS içeren% 23 /% 15 arayüzü, bant kaldırılır ve daha önce açıklandığı gibi, elektron mikroskobu (EM) tarafından incelenmiştir. 2,6 EM sağlam sinaptik veziküllerin varlığı ve presinaptik ve postsinaptik elemanlarının korunması (Şekil gösterdi 2). Pre-ve postsinaptik bölmeleri izolasyonu, sinyalizasyon ve her iki bölümlerinde meydana protein sentezi, incelenmesi için önemlidir. 7-13 Percoll sukroz gradient SN fraksiyonu küçük hücresel, nükleer ve organel kirlenme gördüm, böylece ham arıtma ama genel ayrılması iyi oldu. Western Blot bakıldığında, Percoll kesirler SN bant (Şekil 3, Tablo 2) sinaptik saflık bir artış bekleniyor protein damgalı içeriyordu. Synaptic ve nöronal belirteçler zenginleştirilmiş SN bant (Band 5) muhafaza edildi ama diğer belirteçlerin bolluk önemli ölçüde azaldı. Özellikle, yapısal ve sinaptik belirteçler muhafaza veya gelişmiş iken GFAP, glial kökenli astrosit ve neoplastik hücreler için bir marker ve Lamin-B1, nükleer bir marker, varlığı, azdı. Buna ek olarak, protein sentezinde önemli bir rol oynayan mitokondri ve golgi gibi organelleri, belirteçleri saklama vardı. BCA protein testi ile belirlenen SN grup için tipik verim mcL başına protein 250-500 ng. SNS 50 mcM glutamate/10 mcM glisin ile uyarılmış olduğu SNS faaliyet de novo protein sentezi miktarı tespit edildi [35S]-Met dahil edilmesi (Şekil 4) tarafından izlenir gibi mevcut. 2 Bazal translasyonel aktivite 1.56 kat arttı (Glu) ya da aktif kat 5.12 Pin1 inhibitörü juglone&#39;un. Pin1 inhibisyonu [35S]-Met eklenmesi de novo protein sentezinin artması nedeniyle olduğunu onaylamak için artan protein sentezini 2 bilinir, biz 40 mcM anisomycin, protein sentezi inhibitörü eklenen ve belirgin bir azalma dahil gördüm bazal düzeylere göre Glu Mobile varlığı ve yokluğu. Ayrıca,% 2 SNS bütünlüğünü bozan Triton-X 100, ek üzerine, bazal çeviri% 75 oranında azalmıştır. 2 Buna ek olarak, en sinaptik işaretleyici zenginleştirme gösterdi bantları (B4-B6) incelerken, SNS veya Band 5 de novo protein sentezi (Şekil 5) en büyük faaliyet vardı. Böylece, süreksiz Percoll sakaroz gradyanlar hızlı protein çeviri çalışma için kullanılabilecek bir aktif ve yüksek derecede zenginleştirilmiş SN bant üretir. Çünkü sert koşulları tarafından mekanik hasarlara neden süreksiz Percoll sukroz gradient işlemi diğer yöntemlere göre daha avantajlıdır. Kortikal Homojenat temizlenir filtrasyon yöntemi ile karşılaştırıldığı zaman boyutunda azalma, 3,14-15 Percoll yöntemi, daha fazla aktivite ile daha fazla SNS formları filtreleri bir dizi geçirilir. Şekil 6, 15/23% arayüzü çok daha az kırık membranların SNS ve büyük miktarda vardır Percoll sukroz gradient üzerinde filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS bir kısım geçti görüldüğü gibi. De novo protein sentezi S35-met birleşme yoluyla ölçüldü, filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS çok daha az aktif olan (Şekil 7). Translasyonel aktivite en üst düzeye çıkarmak için P14 ve P18 yaş arasında olan fareler kullanın. SN yetişkin farelerin hazırlanan, ancak juvenil fareler (Şekil 8) hazırlanan SN translasyonel aktivite önemli ölçüde artış görülmektedir olabilir. <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" /> Tablo 1. Homojenize fare korteksin süreksiz Percoll degrade since gruplarından bileşenleri 3,5 <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" /> Tablo 2. Süreksiz Percoll sukroz gradient bant bileşenlerinin Batı cıvata analizinin özeti her grubun kesirler Bağıl protein konsantrasyonları süreksiz Percol kullanarak izolel-sukroz gradient Western Blot tarafından belirlenir. Proteinini yok (-) 0 ≥ 0.2 (+), 0.2 ≥ 0.8 (++), veya&gt; 0.8 (+++) kat daha fazla n süpernatant (S, santrifüj korteks Homojenat), temsilci protein mevcut = 3. <img alt="Programı 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" /> Programı 1: süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanarak SN hazırlanması şematik Fare beynin korteks disseke homojenize ve homojenize olmayan doku, hücre çekirdekleri ve membranlar gibi tüm organelleri kaldırmak için düşük hızda santrifüj edildi. Süreksiz degrade katmanları açıkça tanımlanmış olması gerekir. Inset resim sadece katmanları görselleştirmek için amaçlıdır mavi boyalı olan katmanları, bir örnek gösterir. Süpernatant süreksiz Percoll sakaroz degrade üst katmanlı ve orta hızda santrifüj edilir. SN grup, daha sonra degrade alınan ve kullanıma hazır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" /> Şekil 1. Süreksiz Percoll sakaroz degrade Homojenat fraksiyonasyon. Fare korteks homojenize ve 6 bantlar veya kesirler sebebiyet veren bir süreksiz Percoll-sukroz gradient ayrıldı. Saflaştırılmış, aktif SNS (*) Band 5 bulundu. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" /> Şekil 2. SN hazırlıkları presinaptik ve postsinaptik unsurlarını muhafaza SNS heterojen bir karışım verir. SN hazırlık C57BL / 6 farelerinde (yaş P13 ile P21) hazırlanan bir elektron mikrografı korunmuş presinaptik ve postsinaptik elemanları ile daha önce açıklanan ve gösterir SNS olarak yapıldı. 2 6 Kırmızı oklar noktası post-sinaptik yoğunlukları. Ölçek çubuğu 1 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" /> Şekil 3. SN hazırlıkları Western Blot analizleri sinaptik ve nöronal işaretleri saflaştırılmış SNS muhafaza olduğunu gösterdi (Band 5), ancak diğer belirteçlerin bolluğu önemli ölçüde azaldı. Süpernatant Immunoblots (S, kortikal Homojenat santrifüjle) ve bir süreksiz Gruplar 1-6 Percoll-sukroz gradient (postsinaptik yoğunluğu β-Aktin (yapısal, yükleme kontrolü), GFAP (astrositik), GP73 (Golgi), HSC70 (sitoplazmik ve nükleer), Lamin-B1 (nükleer), Prohibitin (mitokondrial) PSD95 için probed ), SNAP25 (sinaptik), sinaptofizin (sinaptik) ve β3-tubulin (nöron-spesifik). Bantları temsilcisi n = 3, Storm 860 Phosphorimager kullanılarak görüntülendi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" /> Şekil 4. SNS aktif ve [35S]-Met eklenmesi ile de novo protein sentezi gösterirler. SNS 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle ön-dengelenmiş. Sonra SNS, 37, 40 mcM anisomycin veya 1 mcM juglone&#39;un ile 15 dakika süreyle tedavi edilmezse veya ön tedavi ° C-Met, 20 ul Express Pro Etiket artı veya eksi Glu 37 S35 Kolay Etiket Mix [35S] ilave edilerek takip ° C 30 dk. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" /> Şekil 5. Band süreksiz Percoll sukroz gradient 5 de novo protein sentezinin en yüksek seviyede yer alıyor . 4, 5 ve 6 Gruplar ve supernatant (S), kortikal Homojenat santrifüjle 37 ön-dengelenmiş ° C 10 dak. Sonra, [35S]-Met, Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket eklendi, artı ya da eksi 37 ° Glu ° C de 30 dakika oldu. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" /> Şekil 6. Filtrasyon yöntemi hazırlanan SNS süreksiz Percoll sukroz gradient yöntemi hazırlanan SNS daha kırık membranlar ve daha az bütün SNS içerir . SNS, daha önce açıklandığı gibi gözenek boyutu azalan filtreler bir dizi homojenize korteks geçerek hazırlanmıştır. 3,14-15 filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS bir kısım süreksiz Percoll sukroz gradient üzerinde santrifüj ve eşdeğer bir miktara göre süreksiz Percoll-sukroz gradient yöntemi kullanılarak malzeme. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" /> Şekil 7. Filtrasyon yöntemi hazırlanan SNS SNS fro hazırlanan daha az de novo protein sentezi aktivitesi içerenm süreksiz Percoll sukroz gradient yöntemi. SNS azalan gözenek boyutu ile daha önce açıklandığı gibi filtreler, 3,14-15 bir dizi ile homojenize korteks geçirerek ve süreksiz Percoll-sukroz gradient metodlar tarafından hazırlanmıştır. SNS hem hazırlıkları 37 ön-dengelenmiş ° C 10 dak. Sonra, [35S]-Met, Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket eklendi, artı ya da eksi 37 ° Glu ° C de 30 dakika oldu. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" /> Şekil 8. Genç farelerde (P14) SNS yaşlı farelerin (P85) daha büyük translasyonel bir faaliyet var. SNS Glu Mobile ile 10 dakika süreyle 37 ° preequilibrated süreksiz Percoll-sukroz gradient yöntemi, ° C kullanarak farklı yaşlı farelerde hazırlanan tedavi veya tedavi edilmemiş edildi varlığı [35S]-Met, çıtçıt dondurulmuş, 30 dakika (Express Pro Etiket S35 Kolay Etiket Mix) ve daha sonra Pierce, SDS-PAGE Örnek Hazırlık Seti ile temizlenir. SNS, sonra% 12 SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak kurutulmuş ve n = 3, ± SEM Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, temsilci görüntülü edildi. P14 fareler SNS P85 farelerin en az 3 kat daha aktif.

<ol>
	<li>Westmark, C. J., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+mediates+mGluR5-dependent+translation+of+amyloid+precursor+protein.">FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein.</a> PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).</li><li>Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+and+PKMzeta+sequentially+control+dendritic+protein+synthesis.">Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis.</a> Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).</li><li>Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+isolation+of+synaptosomes+directly+from+an+S1+fraction:+Homogeneity+and+morphology+of+subcellular+fractions.">A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions.</a> Brain Res. 441, 59-71 (1988).</li><li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes.">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li><li>Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+a+filtered+synaptoneurosome+preparation+from+guinea+pig+cerebral+cortex:+cyclic+adenosine+3':5'-monophosphate-generating+systems,+receptors,+and+enzymes.">Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes.</a> J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).</li><li>Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+pre-embedding+double+immunogold-silver+labeling+at+the+ultrastructural+level.">A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).</li><li>Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+translation:+stepping+out+of+the+postsynaptic+shadow.">Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow.</a> Front. Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whereas+short-term+facilitation+is+presynaptic,+intermediate-term+facilitation+involves+both+presynaptic+and+postsynaptic+protein+kinases+and+protein+synthesis.">Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis.</a> Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49, 349-356 (2006).</li><li>Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+synthesis+of+CREB+in+a+presynaptic+neuron+is+required+for+synaptic+enhancement+involved+in+memory+consolidation.">De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation.</a> J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).</li><li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translational+control+in+dendrites+and+its+role+in+long-term+synaptic+plasticity.">Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity.</a> J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).</li><li>Li, K. -. W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+rat+brain+postsynaptic+density:+implications+of+the+diverse+protein+functional+groups+for+the+integration+of+synaptic+physiology.">Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology.</a> J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).</li><li>Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+proteomic+analysis+of+rat+forebrain+postsynaptic+density+fractions+by+mass+spectrometry.">Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).</li><li>Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+II+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation+triggers+production+and+release+of+Alzheimer's+amyloid+&#x03B2;42+from+isolated+intact+nerve+terminals.">Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid &#x03B2;42 from isolated intact nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).</li><li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+ion+stimulation+triggers+protein+translation+in+synaptoneurosomal+poiyribosomes.">Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes.</a> Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).</li><li>Billard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing,+hippocampal+synaptic+activity+and+magnesium.">Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium.</a> Magnes Res. 19, 199-215 (2006).</li><li>Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neuronal+excitability,+synaptic+plasticity,+and+learning+in+aged+Kvbeta1.1+knockout+mice.">Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice.</a> Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).</li><li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+Age-Related+Alterations+in+Synaptic+Plasticity+by+Blockade+of+L-Type+Ca21+Channels.">Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels.</a> J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li><li>Sallert, M., Malkki, H., Segerstr&#228;lea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+kainate+receptor+agonist+ATPA+on+glutamatergic+synaptic+transmission+and+plasticity+during+early+postnatal+development.">Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development.</a> Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).</li><li>Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+experience-dependent+expression+of+synaptic+NMDA+receptors+in+visual+cortex+in+vivo.">Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo.</a> Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).</li><li>Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+control+of+proteins+synthesis+at+developing+synapses.">NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses.</a> Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).</li><li>Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+synaptoneurosomes+and+postsynaptic+densities+from+adult+mouse+hippocampus.">Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).</li><li>Weiler, I. J., Greenough, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis.">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex.">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li><li>Haj&#243;s, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity.">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li><li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptosome+Proteomics.">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li><li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized:+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes.">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li><li>Pertoft, H., Laurent, T. C., Catsimpoolas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopycnic+separation+of+cells+and+cell+organelles+by+centrifugation+and+modified+colloidal+silica+gradients.">Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients.</a> Methods of Cell Separation. , 25-65 (1977).</li><li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+&amp;gamma;-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster.">High affinity uptake of L-glutamate and &amp;gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li><li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints.">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li><li>Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+composition,+kit+and+method.">Cell separation composition, kit and method.</a> US patent. , (1997).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan süreksiz Percoll sukroz gradient hazırlık sinaptik iletim deneyler çeşitli kullanılabilir aktif SNS, izole etmek için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Dunkley ve ark. 3,4 tarafından geliştirilen yöntem dayanmaktadır Bu gradyan yöntemi, birbiri ile ilişkili hem de pre-ve postsinaptik membran kaynaklı veziküller izole bir hücre içi beyin fraksiyonasyon işlemdir. Ileri arıtma olmadan bu SNS immunoprecipitation, batı blot, flow sitometri, [35S] üzerinden Met dahil, ele...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Testi Kiti </td><td> Delmek </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Balıkçı </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 gaz </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Balıkçı </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Balıkçı </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Balıkçı </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE Örnek Hazırlık Seti </td><td> Delmek </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Balıkçı </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Balıkçı </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Diseksiyon araçları </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce homojenizatör, 7 ml (iki cam ile birlikte &quot;A&quot; ve &quot;B&quot; etiketli havan) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8 Rotor, Sallanır kova rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Santrifüj </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman tüpleri ile kapaklar </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Beyaz duvarlı adaptörleri </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Mavi duvarlı adaptörleri </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, Sabit açılı rotor </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Batı lekeler için kullanılan antikorların Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Antikor Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Ev Sahibi Türler </th><th> Seyreltme Faktörü </th></tr><tr><td> beta-aktin </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> fare </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65.343 </td><td> fare </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-134.509 </td><td> tavşan </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> fare </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-6261 </td><td> keçi </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28.259 </td><td> tavşan </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> fare </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> tavşan </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Sinaptofizin </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> fare </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-tubulin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80.016 </td><td> fare </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient

Synaptoneurosomes (SNS) fare beyin korteksi homojenizasyon ve bölümleme sonra elde edilir. Bunlar kortikal doku homojenize akson terminalleri kurtulmak vezikül veya izole terminalleri kapatılmalı. SNS sinaptik iletim çalışmasında faydalı kılan, pre-ve postsinaptik özelliklerini korurlar. Nöronal sinyal kullanılan moleküler makine korumak ve alımı, depolama ve nörotransmitterlerin salınımı yeteneğine sahiptir. Aktif SNS üretim ve izolasyon sitotoksik ve SNS mekanik hasar nedeniyle düşük aktivite neden olabilir, yüksek yoğunluklu ve filtrasyon ve santrifüj yöntemleri nedeniyle genişletilmiş santrifüj gerektirebilir Ficoll gibi sorunlu kullanarak medias olabilir. Ancak, süreksiz Percoll sakaroz yoğunluğu gradyanlar SNS izole etmek için kullanmak translationally aktif SNS iyi verim üretmek için hızlı bir yöntem sağlar. Percoll sukroz gradient yöntemi, hızlı ve nazik bir pelet SNS ve mekanik hasara neden olduğu, izotonik koşullar istihdam ve daha az ve daha kısa santrifüj spin santrifüj adımları önler.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient at JoVE.com

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Fare beyin korteksi translationally etkin, sağlam synaptoneurosomes (SNS) hazırlamak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, aktif SNS hızlı hazırlanması için izin veren bir süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanır.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.5K Görüntüleme.  University of Wisconsin. Fare beyin korteksi translationally etkin, sağlam synaptoneurosomes (SNS) hazırlamak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, aktif SNS hızlı hazırlanması için izin veren bir süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanır.

Video: Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Biyokimya

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Biyoloji

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Süreksiz Sukroz Degrade&#39;yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Nörobilim

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.

Sinaptik Bileşenlerin Murin Beyinden İzolasyonu için Hücre Altı Fraksiyonasyonu

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Mononuclear Cell Isolation from Mouse Brain: A Density Gradient Centrifugation Technique to Isolate Brain Resident Mononuclear Cells

Source: Ji, Z. et al. <a href="https://www.jove.com/v/61050/flow-cytometric-analysis-lymphocyte-infiltration-central-nervous">Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we perform the isolation of mononuclear cells from a mouse&#8217;s brain using density gradient centrifugation. The isolated mononuclear cell suspension can be used for further downstream analysis.

Fare Beyninden Mononükleer Hücre İzolasyonu: Beyinde Yerleşik Mononükleer Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Tekniği

Source: Ji, Z. et al. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

Sinir Sistemi Kanserleri

Ex vivo çalışmalar

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

First, use a razor blade to chop each brain region into fine pieces that are less than 1 cubic millimeter. Using a 1-milliliter pipette with the tip cut off, transfer the tissue pieces into pre-chilled Dounce homogenizers. Homogenize the tissue by slowly twisting the piston in and out of the Dounce homogenizer for 6 to 10 full strokes until no visible chunks are present. Then, transfer the dissociated tissues into 50-milliliter tubes through 70-micrometer strainers.
Rinse each Dounce homogenizer and piston with a total of 6 milliliters of cold medium A, then transfer the rinsing to a 15-milliliter tube for centrifugation. Centrifuge single-cell suspension at 400 times g and at 4 degrees Celsius for 5 minutes with a break at 5.
Rinse one large depletion column and three large selection columns in a magnetic separator with 3 milliliters of MCS. When the centrifugation for the tissue samples is complete, pipette out and discard the supernatant without disturbing the pellet. Resuspend the cells in MCS buffer that contains RNase inhibitor.
Add 100 microliters of myelin removal beads to each tube containing resuspended cells from the cortex and cerebellum, and add 50 microliters of myelin removal beads to each of the tubes containing resuspended cells from the hippocampus and striatum. Incubate the tubes on ice for 10 minutes.
After this, add MCS to the tube containing cortical cells to bring its volume up to 2 milliliters, and to the remaining tubes to bring each of their volumes up to 1 milliliter. Once the columns are empty of rinsing buffer, load 2 milliliters of cortical cells onto the large depletion column and 1 milliliter of each other cell suspension onto separate large selection columns. Next, wash the large depletion column once with 1 milliliter of MCS buffer, and wash each large selection column twice using 1 milliliter of MCS buffer for each wash.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir