Bu çalışma, Ekonomi ve Sürdürülebilirlik Enstitüsü (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ve PIE14 / 00034) tarafından desteklenen Institucio Catalana de Recerca Estudis Avançats (ICREA Academia-2010) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, X.M, VF-D ve FC, &quot;Nörofarmakoloji ve Ağrı&quot; akredite araştırma grubuna (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) aittir ve FC için Innovatie kapısı Wetenschap en Technologie (SBO-140028) . Bu çalışma aynı zamanda CAPES (Brezilya )&#39;dan FC&#39;ye &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; tarafından da desteklendi

Tüm hayvanlara ait deneysel prosedürler, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber 11 ve Avrupa Topluluğunun 86/609 / EEC sayılı kanunları uyarınca, Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi (CEEA) tarafından University of Barcelona tarafından onaylanmıştır. CCE, FELASA ve ARRIVE kuralları. Böylece, fareler gıda ve suya ad libitum erişimi olan standart kafeslerde barındırılır ve kontrollü standart koşullar altında tutulur (7:30 AM, 22 ° C sıcaklık ve% 66 nemden başlayan 12 saat karanlık / hafif döngü). 1. Kesintili Bir Şeker Gradyan Kullanarak Fare Beyin Synaptosomları Alınması Not: Bu yöntem daha önce 10 bildirildi. <ol><li> Yeni izolasyon tamponu (IB), pH 7.4 hazırlayın; 2 M sukroz; 1 M sukroz / 0.1 mM CaCI2; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1&#39;e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun. </li><li> SaServikal dislokasyonla beş fare çocuğunu öldürürler. Her bir hayvanın beynini kesip hızla çıkarın. İlgi alanındaki beyin bölgesini (örneğin, hipokampus, 0.25-0.35 g taze doku) parçalara ayırın ve 1 mL IB ile buz üzerinde 5 mL Potter-Elvehjem cam tübüne yerleştirin. </li><li> Dokuyu ısınmayı önlemek için homojenleştirici bir karıştırıcı (dakikada 700-900 devirde 10 vuruşla), tercihen bir buz banyosu içinde dokuyu homojenize edin. </li><li> Homojenize edilmiş dokuyu (1 mL) 6 mL 2 M sukroz ve 2.5 mL 0.1 mM CaCl 2 içeren 15 mL tüp içine yerleştirin. ° C. Tüpü ters çevirerek yavaş yavaş karıştırın. Not: Kalsiyum ilavesi, organeller arasındaki yapışkan etkileşimlerin korunması ve böylece farklı &quot;yoğunlukların&quot; yapısının korunması için gereklidir. </li><li> Çözeltiyi 12 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve sakroz gradyanı oluşturmak için yavaş yavaş her tüpün üstüne 2,5 mL 1 M sükroz / 0,1 mM CaCl2 ekleyin. Not: Konum etiketleme oKalıcı bir işaretleyici kullanarak santrifüj tüpündeki eğim arabirimi. </li><li> Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tüpleri, 100.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 3 saat boyunca santrifüjleyin. Rotoru tüm çelik desteklerle (gerekirse boş olsa) doldurun. </li><li> Miyelin içeren üst tabakayı atın. Bir Pasteur pipetiyle, synaptosome fraksiyonuna tekabül eden 1.25-M ve 1-M sakroz ara fazları arasındaki beyaz halkayı toplayın. </li><li> Bir santrifüj tüpünde IB kullanarak sinaptozomları 9X hacim ile seyreltin. </li><li> Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tamburları, 15.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı atın ve tekrar süspansiyon haline getirin.1.1 mL İB çözeltisi ile pellet. Bu sinaptozomal çözeltiden 100 uL toplayın ve 11,000 x g ve 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. </li><li> Sinaptosomal pelleti% 5 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde tekrar süspanse edin ve bu numuneyi -20 ºC&#39;de saklayın. Not: Bu numune daha fazla Western blot analizi için toplam synaptosome fraksiyonuna tekabül edecektir. Geriye kalan sinaptozom fraksiyonu (~ 1 mL) ya kullanılıncaya kadar -20 ºC&#39;de dondurulabilir veya daha sonraki sübsimaptik fraksiyonasyon için işlenebilir. Sinaptozomlar veya saflaştırılmış sinapslar, toplam hipokampal hacimde% 1 ila% 2&#39;yi temsil eder. </li></ol> 2. Pre-, Post- ve Ekstrasinaptik-izolasyon <ol><li> 2x taze çözündürme tamponu, pH 6.0; 1x çözündürme tamponu, pH 6.0; Çözünürlük tamponu, pH 8.0; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1&#39;e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun. Not: Bu solüsyonların pH değeri doğru olmalıdırİyi bir subsynaptik fraksiyonlamayı elde etmek için ayarlanır. </li><li> 1 mL&#39;lik yeniden askıya alınan sinaptosom fraksiyonunu yavaş yavaş seyreltin (adım 1.12&#39;ye bakın), 5 mL, 0.1 mM CaCl2 ile seyreltin. </li><li> Aynı hacimde (5 mL) buzda soğutulmuş 2x çözünürlük tamponu (pH 6.0) ilave edin ve buz üzerinde bir kapta yüksek çalkalama altında buz üzerinde 50 dakika inkübe edin. Not: pH 6.0&#39;da Triton X-100&#39;in% 1&#39;i tüm plazma membran proteinlerini çözünürken, sinaptik kontaklar veya kavşaklar ( örn . Pre ve postsinaptik yapılar) içindeki proteinleri korur. </li><li> Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, eşdeğer hacimde 0.1 mM CaCl2 ve 2x çözünürlük tamponu çözeltisi (pH 6.0) ile karşılık gelen çelik destekler içinde ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin. </li><li> Tüpleri, 40.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Nihai süpernatan, ekstrasinaptik fraksiyonu temsil eder,Ve pelet sinaptik kavşaklara ( yani pre ve postsinaptik fraksiyonlara) karşılık gelir. </li><li> Ekstrasinaptik fraksiyonu içeren süpernatanı, 4,000 xg ve 4 ° C&#39;de santrifüje tabi tutulan bir 15 mL 10K filtre tüpü kullanarak nihai 200 μL hacme konsantre edin. </li><li> Elde edilen konsantre ekstrasinaptik fraksiyonu (200 μL), 5 hacim (1 mL) önceden soğutulmuş (-20 ° C) aseton ile -20 ° C&#39;de bir gece boyunca çöktürün. </li><li> Ertesi gün, extrasinaptik fraksiyonu 18,000 x g ve -15 ° C&#39;de 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, aseton süpernatantını atın ve herhangi bir aseton izini kaldırmak için peleti kurutun. </li><li> Son olarak,% 5 SDS 200 mcL ile ekstrasinaptik protein içeren pelletini tekrar süspanse edin. Gerekirse peleti son haline getirin. </li><li> Bunu bozmadan, pre ve postsinaptik fraksiyonları içeren pelleti 2 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 6.0 ile dikkatlice yıkayın. Tamponu atın. </li><li> süspanse edinPellet, bir cam Pasteur pipet kullanılarak 10 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 8.0 ile karıştırılır. Not: pH 8.0&#39;da Triton X-100&#39;in% 1&#39;i presinaptik uzmanlaşmayı çözünürken, çözünmeyen postsinaptik yoğunluğu 4 korur. </li><li> Süspansiyonu buz üzerinde bir kabın içindeki yüksek çalkalamayla 50 dakika inkübe edin. </li><li> Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, karşılık gelen çelik destekler içine ve kapatma kapaklarına 1x çözünürlük tamponu çözeltisi, pH 8.0 ile tartın ve dengeye getirin. </li><li> Tüpleri, 40.000 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin; Elde edilen süpernatant presinaptik fraksiyona ve pelletin postsinaptik fraksiyona karşılık gelir. </li><li> Adımlar 2.6-2.9&#39;da tarif edildiği gibi, presinaptik fraksiyonu içeren süpernatanın işlemden geçirilmesi. </li><li> 200 μL% 5 SDS ile postsinaptik fraksiyon içeren pelleti tekrar süspanse edin. Peleti sonlandır, iF gerekli. </li></ol> 3. Membran fraksiyonlamasını doğrulamak için numuneleri immunoblot ile analiz edin <ol><li> Her bir fraksiyondaki protein miktarını ( yani toplam, ekstra, ön, ve son sinaptik fraksiyonlar), biyinkoninik asit protein testini kullanarak belirleyin. </li><li> Her bir fraksiyondan 20 μg protein alın ve SDS-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) numune tamponu içerisinde 50 μL&#39;lik nihai bir hacme kadar seyreltin. 100 ºC&#39;de 5 dakika kaynatın. </li><li> Proteinleri SDS-PAGE elektroforezi% 10 ile, indirgeyici koşullar altında% 4 konsantre jel ile ayırın. Elektrofor, 80 V&#39;luk sabit gerilimle boyanın alt jöse girene kadar voltajını 120 V&#39;a çıkarın. </li><li> Proteinleri bir PVDF zarına aktarın ve sürekli dalgalanma altında oda sıcaklığında 45 dakika için IB engelleme çözeltisiyle bloke edin. </li><li> Memeyi, belirtilen primer antikor ile gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin ( örn. Anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofizin veya anti-GPR37) ile seyreltildi. </li><li> Bağlanmamış birincil antikoru ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır. </li><li> Karışık koşullar altında oda sıcaklığında sürekli çalkalama altında belirtilen ikincil antikor ile inkübe edin. </li><li> Bağlanmamış sekonder antikor ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır. </li><li> Membranı kimyasal parlak substratla inkübe edin (karanlık koşullar altında ve üretici tarafından sağlanan A ve B oranının 1: 1&#39;ini takiben karışımı hazırlayın). </li><li> Membranı bir kemilüminesan algılama cihazında analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

Sinaptik yayın, sinapsın fiziksel bütünlüğüne, Foster ve Sherrington&#39;ın 1897&#39;de erken öngördüğü bir kavrama dayanır. Bu nedenle, hem normal hem de patolojik koşullardaki sinaptik fonksiyonu aydınlatmak için temel sinir iletim bileşenlerini ( örn. Iyon kanalı, reseptör vb. ) Dağılımını anlamak önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), prototipik merkezi sinir sistemi (CNS) sinapslarının mevcut ultrastrüktürel görüşüne muazzam katkılarda bulunmuştur. Öyle ki, EM, oldukça düzgün bir mesafeden (~ 25 nm) 2 bir yarık ile ayrılan pre-ve postsinaptik yoğunluklar arasındaki farkları ince bir şekilde belirledi. İlginç olarak, postsinaptik aparat, plazma membranının altında, postsinaptik yoğunluk veya PSD 2 olarak adlandırılan nispeten sürekli, elektron-yoğun bir kalınlaşma sergilemektedir. Tersine, presinaptik cihazda,E süreksiz sitomatrix ağı, sinaptik veziküllerin plazma membran aktif bölgesine 3 hizalanması ve docklanması için gerekli plazma membranının hemen altında düzenlenmiştir. Bu nedenle, EM, yapısal olarak korunmuş SSS sinapsları içindeki protein dağılımını araştırmak için altın deneysel yaklaşımı oluşturmaktadır. Bununla birlikte, elektron mikrografları tarafından sağlanan bilgiler statiktir. Gerçekten de, biriken kanıtlar in vivo sinapsların son derece dinamik olduğunu ve böylece sürekli sinaptik bulaşmada dramatik yapısal değişikliklerin yaşandığını göstermektedir. Buna ek olarak, sinapsların morfolojisi ve bileşimi, farklı CNS bölgelerinde ve gelişim, olgunlaşma, yaşlanma ve nöropatolojik koşulların gelişimi üzerine değişebilir. Genel olarak, fizyolojik koşullarda farklı sinaptik bölmelere ait proteinlerin izole edilmesine odaklanan bir protokol, sinaptik işleyişin daha kapsamlı bir çalışması için değerli bir araçtır. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada, farklı sinaptik membran bölmelerinin, yani ekstra, ön ve postsinaptik zar alanlarının hazırlayıcı biyokimyasal zenginleşmesine izin veren, bu tür tamamlayıcı deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu membran fraksiyonasyon yöntemi, önce Philips ve ark . (2001) 4 , pre ve postsinaptik aparat içinde oluşan yapışkan etkileşimleri zayıflatan bir pH kaymasına dayalıdır. İlk olarak, pH 6.0&#39;da hafif deterjanlar kullanarak, pre ve postsinaptik aparatı tutan ve çözünürleştirilen ve böylelikle sinaptik kontaklardan ekstraksiyona tabi tutulabilen ekstrasinaptik membran alanından muhafaza edilen adherens kavşağını ayırt etmek mümkündür. Daha sonra, yumuşak deterjanlar varlığında pH&#39;ı 6.0&#39;dan 8.0&#39;a yükseltmek, presynaptik aktif bölgeyi postsinaptik yoğunluğa sıkıca bağlayan adherens bileşkesinin mukavemetini zayıflatır. Bu nedenle, presinaptik bölme öyleYağlanmış ve çoğunlukla korunan postsinaptik yoğunluktan ayrılabilir, çünkü kullanılan deterjan konsantrasyonu çözünürlüğünü arttırmaz 4 . İlginç bir şekilde, fraksiyonasyon etkinliği, sonunda% 90&#39;dan daha yüksek olarak, farklı alt sinaptik belirteçler tarafından teyit edilebilir: i ) presinaptik aktif bölgeden sinaptozomal bağlantılı protein 25 (SNAP-25); Ii ) synaptophysin, extrasinaptik fraksiyondan ( yani, aktif bölge dışındadır ve mikrozomlar dahil); Ve iii ) postsinaptik yoğunluğa göre postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95). Özellikle, bu beyin zar fraksiyonasyon yöntemi başarıyla kullanılmıştır. Buna göre, alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropionik asit (AMPA) reseptörleri 5 , adenosin A 1 reseptörü (A 1 R) 6 gibi farklı reseptörlerin alt sinaptik lokalizasyonunu kesin olarak saptamak mümkün olmuştur ,Adenosin A 2A reseptörü (A 2A R) 7 , adenosin trifosfat (ATP) P2 reseptörleri 8 , nikotinik asetilkolin reseptör altbirimleri 9 ve Parkinson hastalığına bağlı reseptör GPR37 10&#39;dur . Bununla birlikte, birtakım sınırlamalar, belirli bir nöronal proteinin sinaptik dağılımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini engelleyebilir. Dolayısıyla, bu prosedürde, tüm protokolü tam olarak tanımlamakla kalmamakla birlikte, oldukça fazla miktarda doku, düşük protein verimliliği ve verimliliğin doğrulanması için zorunlu gereksinim gibi dikkate alınması gereken bazı kritik noktaları vurguluyoruz Kesin ayrımı yapmadan önce her ayrım.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H2O</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Non fat dry milk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Compact Balance EK-610</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td><td></td><td>Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td></td><td>Primary antibodies diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:30,000</td></tr></tbody></table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

Sinaptik protein kompozisyonunun ve fonksiyonunun değerlendirilmesi sinirbiliminde önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bununla birlikte, sinapslarda oluşan sinir iletimini değerlendirmek kolay değildir çünkü dinamik protein-protein etkileşimleri ve fosforilasyon olayları tarafından yüksek derecede düzenlenir. Buna göre, sinaptik bulaşmayı incelemek için herhangi bir yöntem kullanıldığında, bu geçici fizyolojik değişiklikleri korumak temel hedeftir. Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz. Başka bir deyişle, protokol, presinaptik, postsinaptik ve extrasinaptik bölmelerden protein zenginleştirmesini gerçekleştirmek için bir biyokimyasal metodoloji açıklamaktadır. Birincisi, sinaptozomlar veya sinaptik terminaller, kesintili bir sükroz gradyeni aracılığıyla tüm sinaptik bölmeleri içeren sinir hücrelerinden elde edilir. Not, bu başlangıç ​​sinaptik zar hazırlığının kalitesi critical. Ardından farklı subynaptik bölmelerin izolasyonu, diferansiyel pH koşullarında hafif deterjanlar kullanılarak hafif çözünürlükle elde edilir. Bu gradyan ve izopiklik santrifüjlerle ayrılmaya izin verir. Son olarak, farklı subjunaptik bölmelerdeki protein zenginleştirmesi ( yani, öncesi, sonrası ve ekstrasinaptik membran fraksiyonları), iyi karakterize edilmiş sinaptik protein işaretleyicileri ( örn., SNAP-25, PSD-95 ve sinaptofizin) kullanılarak imünoblot analizi ile doğrulanır Sırasıyla), böylece belirli bir nöronal proteininin sinaptik dağılımının doğrudan değerlendirilmesini sağlar.

Tanımlanan metodoloji genel olarak sinirsel proteinlerin alt sinaptik analizi için ve özellikle sinaptik reseptörlerin 5 , 6 , 7 , 8 , 9 izolasyonu ve biyokimyasal olarak karakterize edilmesi için büyük ölçüde kullanılmaktadır. İlginçtir, burada gösterilen temsili sonuç, yetim bir G proteinine bağlı reseptör...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K Görüntüleme.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz. 

Video: Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Nörobilim

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Süreksiz Sukroz Degrade&#39;yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS induces generalized tonic-clonic seizures with low mortality and neuronal death and is a widely-used model to screen anti-epileptic drugs. Here, we describe an ECS induction method in which a brief 55-mA current is delivered for 0.5 s to male rats 200 - 250 g in weight via ear-clip electrodes. Such bilateral stimulation produced stage 4 - 5 clonic seizures that lasted about 10 s. After the cessation of acute or chronic ECS, most rats recovered to be behaviorally indistinguishable from sham &#34;no seizure&#34; rats. Because ECS globally elevates brain activity, it has also been used to examine activity-dependent alterations of synaptic proteins and their effects on synaptic strength using multiple methods. In particular, subcellular fractionation of the postsynaptic density (PSD) in combination with Western blotting allows for the quantitative determination of the abundance of synaptic proteins at this specialized synaptic structure. In contrast to a previous fractionation method that requires large amount of rodent brains, we describe here a small-scale fractionation method to isolate the PSD from the hippocampi of a single rat, without sucrose gradient centrifugation. Using this method, we show that the isolated PSD fraction contains postsynaptic membrane proteins, including PSD95, GluN2B, and GluA2. Presynaptic marker synaptophysin and soluble cytoplasmic protein &#945;-tubulin were excluded from the PSD fraction, demonstrating successful PSD isolation. Furthermore, chronic ECS decreased GluN2B expression in the PSD, indicating that our small-scale PSD fractionation method can be applied to detect the changes in hippocampal PSD proteins from a single rat after genetic, pharmacological, or mechanical treatments.

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy for severe depression. ECS globally stimulates activity in the hippocampus, leading to synaptogenesis and synaptic plasticity. Here, we describe methods for ECS induction in rats and for subcellular fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in synaptic proteins.

Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

Fonksiyonel Çalışmalar için İnsan Sinaptik Reseptörlerini Yeniden Aktive Etmek için Sinaptik Membranların Mikrotransplantasyonu

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.

Sinaptik Bileşenlerin Murin Beyinden İzolasyonu için Hücre Altı Fraksiyonasyonu

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler