Kültür gün önce hazırlıklar: <ul><li> Steril diseksiyon çözüm (DS) hazırlayın. </li><li> NBM/B27 (B27 takviyeleri ile Neurobasal Mediom) hazırlayın. </li><li> Gerekirse Otoklav GKD 2 O ve cam coversilps sterilize edin. </li><li> Poli-D-lizin ile Coat doku kültürü yemekler ya da cam lamelleri. </li></ul> Poly-D-Lizin Kaplama: Steril koşullar altında kültür bir gün önce hazırlayın. <ul><li> 10X PDL ve buz üzerinde yer çözülme kısım. </li><li> PDL 1 ml 9 ml steril ultra-filtrelenmiş su ekleyin ve iyice karıştırın (1X). </li><li> 1X PDL ile aşağıdaki gibi oda sıcaklığında gece Coat yüzeyler: <ul><li> cam lamelleri (Bellco Cam, Inc Kedi # 1.943-00.012): 75 ul / lamel VEYA </li><li> 24 kuyu kültür plaka: 300 ul / iyi VEYA </li><li> 35mm kültür çanak: 1ml/dish </li></ul></li><li> 5X steril su (sıvı aspirat steril Pasteur pipetler) ile durulayın. </li><li> Yüzey tamamen kuruyana kadar su çıkarın. </li></ul> Kültürleme prosedürü (steril koşullar altında laminer akış kaput yapılan) <ol><li> Süper yapıştırıcı kullanarak mikrotom Vibraslicer (Chipping Instruments Ltd) destek blok üzerine agar blok ve tutkal bu kesin. </li><li> Geç embriyonik evre (E17-18) fare fetusların euthanise baraj kullanırken, embriyonik çuval rahim ve ücretsiz bireysel fetusların çıkarın. Steril Petri kabı içine yerleştirin fetus ve devam aşağıda özetlendiği gibi. </li><li> Başını kesmek fare fetüs veya yavru (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış takip esaslar). </li><li> Soğuk DS ile dolu bir 60mm petri Whatman filtre kağıdı diske deri ve kafatası yer ve beyin çıkarın. </li><li> Steril bir jilet kullanarak beyincik kesti. </li><li> Spatula kullanarak beyin Pick up ve filtre kağıdı üzerinde aşırı sıvı drenaj yerinde Vibraslicer destek blok ve tutkal beyin (kaudal tarafında ve karın kısmı karşı karşıya agar), daha sonra beyin transfer. </li><li> Odasının soğuk DS ile doldurun. Hız seçici 8-9 ayarlayın. </li><li> Koku alma ampul itibaren, 200-400 mikron bölümden kesin. Vibraslicer bıçak korteks içeri girdiğinde, 600μm koronal bölümleri kesme başlar. P0 fare beyin kullanılabilir 4-5 dilim verimleri E17-18 fare beyin, genellikle, 3-4 kullanışlı dilim verir. </li><li> 10 ml cam yeniden süspanse un-takılı ters ucunu kullanarak DS 2 etiketli 35 mm petri beyin dilimleri aktarın. </li><li> Korteks inceleyin ve kılcal tüpler çıkarılmış cam iğneler kullanarak meninksler kaldırmak. </li><li> Kortikal kabuklar, 0.5-1 mm uzunluğunda küçük parçalara kesin. </li><li> Süzülür ES 0.2 mm, 35 mm petri içine 5 cc şırınga bağlı filtre. </li><li> Kortikal doku parçaları süzülmüş ES içeren petri kabına aktarın. </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li></ol> Bu arada: <ol><li> Davlumbaz, Vibraslicer ve kesme araçları temizleyiniz. </li><li> 60 mm petri içine sıcak NBM/B27 5 ml ekleyin. </li></ol> 30 dakika sonra. inkübasyon: <ol><li> 10 ml DS doku transferi. 1 dakika dinlendiriniz. </li><li> Ilk Merhaba tüp swirls doku transferi ve 2-3 dk razı bekleyin. </li><li> İkinci Hi aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> İlk Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> İkinci Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> Üçüncü Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> Medya ile 60 mm çanak doku transferi. </li></ol> Diseksiyon mikroskobu altında: <ol><li> Temizlik doku enkaz ve doku hafifçe gevşetmek için çekti damlalıklı cam (delik boyutlarını azaltarak kullanabilirsiniz) geçerek her bir parça çiğnemek. </li><li> 15 ml konik tüp NBM + B27 dinlenme (- 35 mm yemekleri hafifçe karıştırın ve yerleşmek için büyük doku parçaları için bekleyin 5 için 24 plaka ya da 11 ml, 13 ml toplam olun) içeren hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Transfer hücre süspansiyonu (24 plaka ya da 2 ml / 35 mm kültür çanak / de 0,5 ml). </li><li> Cam lamelleri kullanırken, lamel başına 80 ul hücre süspansiyonu ekleyin ve 1 saat içinde doku kültürü inkübatör izin hücreleri NBM/B27 medya ile daha odasına sel önce uyması için. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO 2 kültürler koruyun. </li></ol> Sonraki Gün 24 plaka: NBM/B27 orta klimalı 0.5 ml nöronal olmayan hücre ile her iyi besleyin (cNBM/B27 cNBM/B27 orta hazırlanması için protokol altında görüntülenir) 35mm yemekler: cNBM/B27 orta ile 0,5 ml değiştirin. 0.5 ml taze cNBM/B27 2-3 günde bir orta yerine kültür koruyun. Kültür ortamı glia hücre çoğalması teşvik olmamasına rağmen, kültürler gerekirse glial hücrelerin sayısını azaltmak için kültür günde 3-5 5μM FDU (5-Fluoro-2&#39;-dezoksiuridin, Sigma F0503) ile tedavi edilebilir. SET<html> -UP Diseksiyon ve Kültür % 70 EtOH diseksiyon araçları sterilize veya onlara otoklavda: <ul><li> Makas (med. küçük) Spatula (med. ve küçük) </li><li> Cımbız (med. ve küçük) jilet </li><li> Blade vibraslicer Tampon banyo için </li><li> Beyin için bıçak Destek için küçük metal kama </li></ul> Diğer malzemeler: <ul><li> Petri kapları (60 mm) </li><li> Petri kapları (35 mm) </li><li> Filtre kağıdı </li><li> Cam pipetlemeyin 10 ml </li><li> Steril tek kullanımlık pipetler, 5,10 ve 25 ml </li><li> Şırınga filtre 0.2 mikron </li><li> Şırınga 5 cc </li><li> Santrifüj tüpleri, 15 ml </li><li> Steril Pasteur cam pipetler </li><li> PDL kaplı kültür kaplarına veya cam lamelleri </li></ul> Etiket altı 15 ml santrifüj tüplerine ve hazırlık uygulayın: Tüp # 1: Enzim çözüm: Içeren 5 ml DS papain (Worthington LS 03.126) 50 U ekleyin: <ul><li> L-sistein 100μl (0.8mg) </li><li> 7 ul 0,1 N NaOH </li><li> 50 ul APV (5mM) </li></ul> Temizlemek için, oda sıcaklığında çözüm bırakın. Bu enzim çözeltisi ilk &#39;bulutlu&#39; görünür ve kullanmadan önce temizlemek gerekir. Tüp # 2 # 3: Merhaba Enzim İnhibitörü: 3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 ul APV (5mM). Kabarcıkları önlemek için yavaşça karıştırın, daha sonra iki 1.5ml alikotları bölmek. Tüp # 4 - # 6: Düşük Enzim İnhibitörü: 8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ul APV (5mM). Kabarcıkları önlemek için yavaşça karıştırın, üç 2.6 ml alikotları bölmek. Yeri tüpleri, buz üzerinde # # 6 üzerinden 2 sayılı. Tüp # 1 (Enzim Çözüm) oda sıcaklığında bekletin. Çözümler VE Alikot <ul><li> Çözüm A (Tuzlu Tamponlanmış) Sigma Formula wt 500 ml [kons.] </li><li> Sodyum Klorür NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm </li><li> Potasyum klorid KCl P-4504 74,56 4.0g 5.4mM </li><li> Sodyum Fosfat Dibazik susuz Na 2 HPO 4, S-0876 142,0 0.24g 0.17mM </li><li> Potasyum Fosfat mono susuz KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0.3g 0.22mm </li></ul> 400 ml ultra filtre edilmiş su ile çözülür kadar tüm malzemeyi ve karıştırın tartılır. Son hacim 500 ml getirin. , Temiz bir şişe ve otoklav yerleştirin. Mağaza, 4 ° C ve etiket &quot;DS Çözümü&quot;. <ul><li> Çözüm B (HEPES) Sigma Formula wt 250 ml [kons] </li><li> HEPES HEPES H-3375 283.3 20.97g 9,9 </li></ul> 200 ml ultra-filtrelenmiş su ekleyin. Eriyene kadar karıştırın ve son hacim 250 ml getirmek. , Temiz bir şişe ve otoklav yerleştirin. Mağaza, 4 ° C ve etiket &quot;DS Çözüm B&quot;. <ul><li> Çalışma Çözüm 500 ml kons.] </li><li> Ultra süzülmüş su 400 ml </li><li> Stok çözelti 25 ml </li><li> Stok Çözüm B 14 ml </li><li> D-Glukoz (+) Sigma G-8270 3.0 g 33.3mM </li><li> Sakkaroz Sigma G-0389 7.5 g 43.8 mM </li></ul> 1N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. Ultra filtre edilmiş su ile 500 ml son hacim kazandırın. Temiz bir cam şişe ve otoklav içine süzün. 4 ° C saklayınız Etiket, &quot;Diseksiyon Çözüm&quot;. Poly-D-Lizin Hazırlanışı: <ol><li> 1mg/ml steril H 2 O; 10x stok solüsyonu poli-D-lisin (Sigma P-7280 PDL) hazırlayın. </li><li> 1.0 ml alikotları olun. Bu çözüm için -20 ° C&#39;de 3 aya kadar saklanabilir. </li></ol> MEDYA <ol><li> 10ml B-27 Supplement (Gibco 17.504-044), 500 ml NBM şişe (Neurobasal Orta, Gibco 21.103-049). </li><li> 4 40 ml alikotları ve mağaza olun ° C </li></ol> APV <ol><li> APV 10 mg flakon 10 ml steril H 2 O (2-Amino-5-phosphonopentanoic asit, Sigma A-5282) ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> -20 ° C&#39;de 180 ul alikotları ve mağaza hazırlayın </li></ol> BSA / Ti <ol><li> 1 g BSA (Bovine Albumin. Sigma A-7030) ve 1 g tripsin inhibitörü (Sigma T-9253) 10 ml DS eritin. </li><li> 1N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. </li><li> 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtreleme ile sterilize edin. </li><li> -20 ° C&#39;de 400 ul alikotları ve mağaza içine Böl </li></ol> L-sistein Eppendorf tüp 200 ul DS 0.6 mg L-Sistein (Sigma C-7755) çözülür. AGAR (% 4) <ol><li> 100 ml steril su Bacto Agar 4 g (Difco 0140-01) eritin. Kültür için gerekli 4 ° C kadar tutun. </li><li> Mikrodalga Agar 35 mm petri eritebilir ve doldurun. Soğumasını ve polimerize bekletin. </li></ol> Papain (Worthington LS 03.126) Nunc Kültür şişelerde E_TITLE &quot;&gt; nöronal olmayan KÜLTÜRLER KAPLAMA Kültür ŞİŞE (4 Nunc şişe) <ol><li> 1X PDL yapmak için 3 tüplerin 10X PDL her birine 9 ml steril su ekleyin. </li><li> İlk şişe 30 ml 1X PDL aktarın. </li><li> Tüm büyüme yüzeyleri kaplıdır kadar hafifçe hareket ettirin. 1 dakika boyunca bekletin. </li><li> Ikinci şişe 1x PDL aktarın. 1 dakika boyunca bekletin. </li><li> Üçüncü ve dördüncü şişe ile tekrarlayın. </li><li> Durulama 150 ml steril H 2 O. ile 2X dört şişe </li></ol> ENZİM ÇÖZÜM (ES) HAZIRLANMANIZI: <ol><li> Kristalleri eriyene kadar 0,6 ml santrifüj tüpüne ağırlığı 0.8 mg L-Sistein (Sigma C7755) dışarı, 150ml DS ve vorteks eklemek. </li><li> 15 ml konik tüp 5 ml DS aktarın, sonra L-Sistein 150ml ekleyin. </li><li> 50 ünite Papain ekleyin. (Worthington LS 03.126) </li><li> 7ml 0.1N NaOH ekleyin. </li></ol> PREPARE MEM (Gibco # 11.090-081) <ol><li> 65 ml, 500 ml MEM şişeden çıkarın. Glikoz hazırlamak için 10 ml kaydedin. </li><li> 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15.070-063) ekleyin. </li><li> 10 ml 1M Glikoz (Sigma G-8270) (1.8 g / 10 ml MEM) </li><li> 50 ml fetal Bovine Serum (Gibco # 16.140-071) veya Sığır Buzağı Serumu (Omega BC-04). </li><li> Iyice karıştırınız, 4 kısım ve mağaza ° C </li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27 EKİ (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21.103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17.504-044) <ol><li> NBM şişe ve karıştırmak için B-27 flakon tüm içeriği ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de kısım ve mağaza </li></ol> BEYİN DOKU VE DİSEKSİYON <ol><li> Kuru araçları diseksiyon diseksiyon önce% 70 EtOH. </li><li> 3-15 ml tüp her 10 ml DS aktarın. </li><li> Fare yavrular (P0-P3) seçin, 4 şişe üç beyinleri gerekecektir. </li><li> 35 mm petri soğuk DS ekleyin. </li><li> Fare yavru başını kesmek ve beynini teşrih. </li><li> Soğuk DS içeren petri içine yerleştirin beyinleri. </li><li> Doku bir cam pipet geçmesine kadar küçük parçalar halinde doğrayın. </li></ol> ENZİM AYRILMA <ol><li> Tabak Pasteur pipeti ile mümkün olduğu kadar çok DS kaldırın. </li><li> 0.2 mikron filtre ve 5cc şırınga ES süzülür. </li><li> ES doku ile tabak koyun. </li><li> 37 ° doku inkübe dakika süreyle 30 ° C inkübatör (CO 2 ücretsiz). </li></ol> DOKU YIKAMA <ol><li> İlk DS tüp cam pipet ile transfer doku, mümkün olduğunca az ES olarak elde etmek için emin olun. </li><li> 1500 devirde 30 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Doku ve tekrar işlem iki kez daha aktarın. </li></ol> Öğütme <ol><li> 50ml santrifüj tüpü içine 38 ml MEM / FBS yerleştirin. </li><li> Bu petri 35 mm çanak ve transfer dokusu, MEM / FBS 3 ml ekleyin. </li><li> 1000μl Eppendorf pipetlemeyin ucu ile hafifçe triturating tarafından doku ayrıştırmaları. </li><li> MEM / FBS içeren tüp 38ml hücre süspansiyonu aktarın ve iyice karıştırın. </li></ol> KAPLAMA <ol><li> Her şişe eşit miktarda hücre süspansiyonu ve medya kültürü şişeleri dik durun. </li><li> Her kültürün şişe 90 ml MEM / FBS koyun. </li><li> Her şişede 10 ml hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> Etiket: Sigara Nöronal, baş harflerini ve tarih. 37 ° ° C ve% 5 CO 2 inkübe edin. </li></ol> BESLEME <ol><li> Gün 3 veya 4, sıcak MEM / FBS (süzün tüm medya ve MEM / FBS 100 ml) ile beslenirler hücreleri,. Kültürler konfluent olmak için 7-10 gün sürebilir. </li><li> Gün 7-10 NBM/B27 için ortam değiştirin. </li><li> Ertesi gün, medyanın toplamak. 0.22μm Filter </li><li> 40 ml hacimde ve MEM / FBS ile kültürü beslemek. </li><li> Sonraki 2 ya da 3 gün, NBM/B27 ortamı değiştirmek </li><li> Ertesi gün, toplamak ve işlemi tekrarlayın. </li><li> Yaklaşık medya toplama tutun. 2 hafta. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S9625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibraslicer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassim Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D (+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Media (NBM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invirtogen (Gibco)</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-Amino-5-phosphonopentanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9253</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide, 1N solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SS266-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0140-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Papain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington </td>
<td>LS 03126</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 0.2 &micro;m Syringe Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>DDA02025S0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Coverslips, No1, &#216;12mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bellco Glass Inc.</td>
<td>1943-00012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>11090-081</td>
<td>with Earle's salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>15070-063</td>
<td>for non-neuronal culture</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>16140-071</td>
<td>needed for non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-25</td>
<td>Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass bottom "Imaging dishes"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-10-C</td>
<td>Glass bottomed, &#216;35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare beyin kortikal nöronal kültürlerin üretmek için süreç boyunca size rehberlik edecektir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme, protein ve / veya RNA izolasyon da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir. Bu kültürler de, geç embriyonik ya da doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal gelişim çalışması için bir platform sağlar. Bu prosedür, nispeten düz ileri doku kültürü tekniği biraz tecrübe gerektirir ve düzgün bir şekilde hazırlanır 2-3 saat daha uzun sürmemelidir. Talamo-kortikal fiber kanaldan kortikal kabuklu dikkatli olarak ayrılması istenmeyen non-nöronal hücrelerin sayısını azaltacaktır. Nöronal hücrelerin verimi enzim inkübasyon adımdan sonra yavaşça kortikal doku parçalarını çiğnemek artırmak için. Hücreleri ve erken nöronal hücre ölümü gereksiz hasarı önlediğini Bu zorunludur. Bu kültürlerin glia besleyici hücrelerin yokluğunda korunur, aynı zamanda nöronlarda zenginleştirilmiş büyüyen kültürlerin ilave bir avantaj sağlayacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures at JoVE.com

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare kortekste nöronal kültürlerin üretmek için bir prosedür gösterir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme için kullanılan ve doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal geliştirme çalışması için bir platform sağlamak olabilir.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

preparation-of-dissociated-mouse-cortical-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K Görüntüleme.  University of California, Irvine (UCI). Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare kortekste nöronal kültürlerin üretmek için bir prosedür gösterir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme için kullanılan ve doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal geliştirme çalışması için bir platform sağlamak olabilir.

Video: Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biyoloji

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.