Bu araştırma NIH hibe programı K08 AI062732, K12 HD001401 ve 1UL1RR024139-02 ve SB-M Charles H. Hood Vakfı Çocuk Sağlığı Eğitim ve Araştırma Burs tarafından finanse edildi. Stony Brook, New York Eyalet Üniversitesi Araştırma Vakfı tarafından.

1. EBV stok Preparation <ol><li> 75cm 2 doku kültürü şişesi steril tekniği kullanarak 3 x 5 10 hücre / ml; katlanarak büyüyen B95-8 hücreleri (13 ATCC # CRL 1612) Altkültür. Hücreler 37 0.5 mikrogram / ml tam RPMI 1640 yılında sırasıyla% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS), Penisilin / 100U/ml az Streptomisin ve 100 mcg / ml içeren yetiştirilen ve Amfoterisin B ° C varlığında % 5 CO 2. </li><li> Kırk sekiz saat sonra, 1 x 10 6 hücre / ml taze tam RPMI 1640 yılında tekrar süspansiyon hücreleri. Virüs üretim ikna etmek için, standart bir CO 2 inkübatör 1 saat 20ng/ml tetradecanoyl phorbol asetat (TPA) ve hücreleri uyarır. RPMI 1640 TPA kaldırmak için hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Tam RPMI 1640 orijinal hacmi (1.2) hücreleri yeniden süspanse edin ve 96 saat için CO 2 inkübatör şişesi yerleştirin. Bu yöntem, bulaşıcı bir virüs par yüksek titreleri olduğu gösterilmiştirpartikülleri 6. </li><li> 4 az 10 dakika süreyle 600 x g Santrifüj ° C hücreleri EBV içeren kültür süpernatant ayrı. Bir yıl boyunca -70 0.45 mikron filtre, kısım, ve mağaza ° C süzülür süpernatant. ATCC (VR-1492) EBV içeren B95-8 hücreleri süpernatant ATCC tarafından önerilen seyreltme elde etmek ve kullanmak için bir alternatif. </li></ol> 2. Izolasyonu periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) <ol><li> Heparinize şırınga veya heparinize kan tüpü içine vericiden alınan 10 ml kan çizin. Oda sıcaklığında 50 ml konik bir tüp içerisinde 20 ml PBS ile kan sulandırınız. </li><li> 15 ml Ficoll Hypaque lenfosit ayırma orta Underlay seyreltilmiş kan. 30 dakika oda sıcaklığında frensiz, 225 x g&#39;de santrifüjleyin . </li><li> Yeni bir 50 ml konik tüp içine buffy coat ve transfer çıkarın. PBS ile 50 ml hacim kaldırın ve 10 dakika oda sıcaklığında 600 xg&#39;de döndürün. </li><li> Pour süpernatant kapalı. 50 ml PBS içinde pelet resuspending ve 10 dakika oda sıcaklığında 600 x g iplik hücreleri yıkayın. Benzer bir şekilde iki kez daha yıkayın. </li><li> Süspanse edin 1 ml tam RPMI hücreler yıkanır. Tripan mavisi 1 / 10 dilüsyon hazırlamak için 5 mcL hücre kullanın. Hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı. </li><li> 2 x 10 6 / ml, bir hücre konsantrasyonunu elde etmek için 25 cm 2 doku kültürü şişesi tam RPMI kullanarak ses seviyesini ayarlayın. </li></ol> 3. EBV enfeksiyonu <ol><li> 2.6 20 nM son bir konsantrasyonu hücre süspansiyonu FK506 (AG Bilimsel). 37 CO 2 inkübatör Yeri balon ° C &#39;de bir saat. </li><li> Hızla EBV bir kısım Çözülme. Inkübatör balonun çıkarın ve 1 / 10 dilüsyon hücreleri EBV ekleyin. Tipik olarak, bu seyreltme bir İçişleri Bakanlığı 50-100 sağlar. 37 mix ve CO 2 inkübatör dik yerleştirmek Swirl balon ° C </li></ol> Not incibaşarılı bir sonuç tahmin etmek için yapılan Adım 4, isteğe bağlı bir adımdır. Adım 4 yapılacak ise, kontrol olarak 2 x 10 6 hücre / ml un-enfekte hücre ek bir balon inkübe gerekecektir. 4. Hücrelerin hızla çoğalan nüfus (Opsiyonel adımı) belirlenmesi <ol><li> FACS tampon PBS +% 5 FBS: hazırlayın. Mağaza, 4 ° C </li><li> Aşağıdaki antikor hücre boyama Adım 4.6 50 mcL hacmi her karışımları olun. Antikor dilüsyonları içeren 1mg/ml fare IgG (Sigma) antikorlarının non-spesifik bağlama inhibe FACS tampon yapılmalıdır. <ol class="lroman"><li> PE konjuge anti-CD23 antikoru (1 / 50 dilüsyon) ile tek lekeli </li><li> FITC konjuge anti-CD58 antikoru (1 / 50 dilüsyon) ile tek lekeli </li><li> PE-Cy5 konjuge anti-CD19 antikoru (1 / 50 dilüsyon) ile tek lekeli </li><li> triple-lekeli CD23, CD58 ve CD19 (1 / 50 dilüsyon her) </li><li> PE konjuge izotip kontrolü ile tek lekeliantikor CD23-PE için uygun (anti-CD23 antikoru ile aynı konsantrasyonda) </li><li> FITC konjuge izotip kontrol antikoru (anti-CD58 antikoru ile aynı konsantrasyonda), CD58-FITC uygun tek lekeli </li><li> tek lekeli PE-Cy5 konjuge izotip kontrol antikor uygun CD19-PE-Cy5 (anti-CD19 antikoru ile aynı konsantrasyonda) </li><li> Her üç izotip kontrol antikorları ile triple-boyandı. </li></ol> Geçici olarak karışımları 4 ° C&#39;de karanlıkta saklayın. </li><li> EBV günde üç maruziyet sonrası, yavaşça girdap şişesi daha homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için. Şişeden 2ml Eppendorf tüpe 2ml çıkarın. 3000 rpm&#39;de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj tüp Spin. </li><li> 5 x 10 6 1 x 10 7 hücre / ml FACS tampon supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin. </li><li> Bireysel Eppendorf tüpleri içine sekiz 50μl bölüntülerin veya 96-iyi bir V-alt plaka çıkarın. Spin tüpler veya 1500 x g plaka3 dakika. </li><li> Süpernatant ve vorteks tüpler / plaka atın. Her bir tüp içinde süspanse edin hücreleri / 4.2 hazırlanan uygun antikor dilüsyonları içeren FACS tampon 50 mcL. </li><li> Tüpler / plaka, 30 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. 3000 rpm&#39;de 3 dakika Santrifüj hücreleri, süpernatant kaldırmak ve FACS tampon 200 mcL ekleyin. Hücrelerin tekrar santrifüj ve yıkama tamamlamak için süpernatant kaldırmak. Iki yıkar daha tekrarlayın. </li><li> 200 mcL FACS yeniden süspanse hücreler 20.000 olaylar / tüp elde bir akış sitometresinin kullanarak veri tampon ve kazanır. </li><li> WinMDI (PC FACS veri analizi için ücretsiz) kullanarak verileri analiz edin. Ileri ve yan dağılım profilleri kullanarak canlı hücreler üzerinde Kapısı. Daha sonra, canlı hücreleri CD19 + (B hücre belirteci), anti-CD19 antikoru uygun izotip kontrol antikoru ile boyanan hücreler ile karşılaştırırken sonra ifade için kapı . Arsa CD19 + canlı B hücreleri CD23 floresan ile y ekseni üzerinde x-ekseni ve CD58 için floresan. Belirleyin CD23 + ve CD58 + EBV maruz kalan hücrelerin eşleşen izotip kontrol antikorları ile boyandı karşılaştırarak hücreler. EBV maruz kalan kültür CD23 yüksek CD58 + hücreler (Şekil 2C) varlığı, EBV ile infekte büyüme transforme hücreler başarılı bir akıbet öngörüyor. Hücrelerinin EBV (Şekil 2A) maruz kalan ya da EBV (Şekil 2B) olmayan bir immortalizing zorlamalara maruz değildir aksine, CD23 yüksek CD58 + hücreler ortaya yoktur. CD23 yüksek CD58 + hücrelerin çoğalması tabi deneysel olarak gösterilmiş ve daha sonra LCL (14) kurulması olmuştur. </li></ol> 5. LCL genişletilmesi ve kriyoprezervasyon <ol><li> Işık mikroskobu ile hücrelerin Görselleştirme: EBV enfeksiyonundan bir hafta sonra, hücre kümeleri, ışık mikroskobu ile görülebilir. Şekil 3 balonuna erken mikroskobik kümeler (Şekil 3B) bir örnek gösterir. </li><li> Zaman ilerledikçe, mikroskobik kümeler, büyük, yığınlarda görünür halemakroskobik balondaki. Şekil 3C, ışık mikroskobu ile kurulan LCL hücrelerin daha büyük kümeler gösterir. </li><li> Hücreleri Besleme: 12 günlük kültür şişelerinde kültür ortamı hacmi ikiye katlayın. Daha sonra, tam RPMI kullanarak hacmi 2-3 kat artmaktadır kültür genişletin. </li><li> Besleyen hücreleri periyodikliği hücre büyüme oranı esas alınarak tespit edilmelidir. Kültür ortamı, sarı yandığında, genellikle yukarıdaki gibi medya değiştirme zamanı. Genellikle, haftada bir kere ortaya çıkar. Ancak, bazı hücre hatları daha fazla veya daha az sık sık beslenen gerekebilir. Önümüzdeki birkaç hafta içinde 75-100 ml kültür genişletin. </li><li> Kriyoprezervasyon hücreleri aşağı dondurma, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g santrifüj hücreleri. 1 x 10 7 hücre / ml &#39;de% 90 FBS içeren soğuk dondurucu orta ve% 10 dimethylsülfoksit supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Sıvı azot tüpü yerleştirin. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: CD23 yüksek CD58 + hücrelerin varlığı ile başarılı bir sonuç tahmin ediliyor. Bu profili (Şekil 2C) EBV maruz kaldıktan sonra 3-4 gün canlı hücrelerin yaklaşık% 2-3 olmalıdır. Diğer CD23 alt-popülasyonları +, CD23 -, CD58 + ve CD58 hücreler EBV maruz kaldıktan sonra en az 14 çoğalması göstermek gözlenmektedir. EBV olmayan bir immortalizing gerginlik barındıran HH514-16 hücreleri (Şekil 2B), EBV maruz Un-enfekte olmuş hücreleri (Şekil 2A) ve hücreler CD23 yüksek CD58 + hücreler olduğunu göstermez. Bir hafta içinde, Daha önce de belirtildiği gibi EBV enfeksiyonu sonrası, balon hücrelerin küçük kümeler tarafından görülebilir ışık mikroskobu (Şekil 3B): Aynı zamanda başarılı bir sonuç izlemek için ışık mikroskobu ile hücrelerin görselleştirmek olabilir. Zaman ilerledikçe ve hücreleri LCL geliştikçe, mikroskobik kümeler kümeleri balon makroskopik olarak görünür olduğundan (3C Şekil) daha büyük olur. Şekil 1 lenfoblastoid hücre hatları üretimi ve dondurulması için iş akışı. Periferik kan bir Ficoll degrade ile santrifüj edilir. Kurulmuş bir degrade buffy coat PBMC mevcut EBV ilavesi ile takip FK506 maruz kalmaktadır. EBV maruz kalan hücreleri 37 ° C daha sonra dondurulması için LCL kurmak ve genişletmek için 5% CO 2 varlığında yetiştirilmektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> Şekil 2 B hücreleri EBV maruz kaldıktan sonra yayılması geçmesi beklenen bir alt nüfusun belirlenmesi . Un-enfekte hücre (A) veya hücre HH514-16 hücreleri (B) veya B95-8 FK506 varlığı hücreleri (C) elde edilen EBV maruz 3. günde hasat edildi. Hücreler, CD19, CD23 ve CD58 yöneltilen florokrom-konjuge antikor ile boyandı. Yolluk sonra canlı hücres, un-enfekte (A) ve EBV maruz kalan (B ve C) CD19 + B hücreleri CD23 ve CD58 ekspresyonu incelendi. B hücreleri CD23, CD58 ve yüksek düzeyde (CD23 yüksek CD58 +), ifade bir alt nüfus tasvir, sadece dönüşüm yetkin EBV (B95-8 hücreleri elde) maruz kalan hücrelerde gözlemlemiştir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> Şekil 3 EBV ile enfekte hücrelerde hücre kümeleri Görselleştirme. PBMC FK506 ile tedavi edilen ve EBV ile enfekte edildi. Un-enfekte (A) ve EBV maruz kalan (B) hücrelerin faz kontrast mikroskobu (10X büyütme) bir hafta sonrası enfeksiyon incelendi. Beş haftalık lenfoblastoid hücre hattı C ile gösterilir

<ol>
	<li>Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+Epstein-Barr+virus+and+the+origins+of+associated+lymphomas.">Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).</li><li>Kubuschok, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+spontaneous+Epstein-Barr+virus+lymphoblastoid+cell+lines+genetically+modified+to+express+tumor+antigen+as+cancer+vaccines:+mutated+p21+ras+oncogene+in+pancreatic+carcinoma+as+a+model.">Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model.</a> Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li><li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+under+influence:+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus.">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li><li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells:+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus.">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. Med. 10, 871-875 (2004).</li><li>Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells.">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298, 2199-2202 (2002).</li><li>Oh, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes.">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).</li><li>Ventura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simple+method+for+the+Epstein-Barr+virus+transformation+of+lymphocytes+from+members+of+large+families+of+Reunion+Island.">Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island.</a> Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).</li><li>Henderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+transformation+of+lymphocytes+by+Epstein-Barr+virus.">Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus.</a> Virology. 76, 152-163 (1977).</li><li>Bird, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+Epstein-Barr+virus+activation+of+human+B+lymphocytes.">Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes.</a> J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).</li><li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+method+for+the+establishment+of+permanent+growing+lymphoblastoid+cell+lines.">A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines.</a> Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).</li><li>Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphocytes+immortalization+by+Epstein-Barr+virus+in+the+presence+of+cyclosporin+A.">Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).</li><li>Pressman, S., Rotter, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes:+prolonged+experience+with+technique.">Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique.</a> Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).</li><li>Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus:+Transformation,+cytopathic+changes,+and+viral+antigens+in+squirrel+monkey+and+marmoset+leukocytes.">Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).</li><li>Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+sub-population+of+B+cells+that+proliferates+after+infection+with+Epstein-Barr+virus.">Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus.</a> Virol. J. 8, 84-84 (2011).</li><li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Epstein-Barr+virus+(EBV)-immortalized+B+cell+lines.">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu makalede açıklanan yöntemi hızlı ölümsüzleşme ve kriyoprezervasyon kez vericinin periferik kan LCL üretir. FK506 kullanımı sayesinde, T immünosupresan hücre ve bulaşıcı virüsün yüksek titreleri periferik kan mononükleer hücrelerinin EBV ile enfekte B hücrelerinin yayılması teşvik etmek mümkün. Bu müdahaleler, daha sonraki deneyler için hücreleri hızlı bir şekilde genişlemesi sonucunda açıklanan yöntem daha verimli olun. Geleneksel olarak, büyüme dönüşümü maruz kaldıktan sonra yaklaşık bir hafta EBV 6, 15 ışık mikroskobu ile hücre kümeleri görselleştirme tarafından izlenir olmuştur. Ancak, hücre kümelenme EBV-aracılı büyüme dönüşüm belirli bir göstergesi değildir. Daha önce, üç gün kıç, en erken zamanda başarılı sonucunu belirlemek için doğru bir ve belirli bir yöntem sağlayan, flow sitometri 14 ile proliferatif hücre popülasyonu tutarlı bir kimlik gösterdiB hücrelerinin EBV er maruz kalma.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> Fisher Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsülfoksit </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu, ısı ile inaktive </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque lenfosit ayrılması medya </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG Bilimsel </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> Fare serumu ile IgG </td><td> Sigma </td><td> Ben 8765 </td></tr><tr><td> PE konjuge fare anti-insan CD23 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> PE konjuge Fare izotip IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> FITC için konjuge fare anti-insan CD58 </td><td> Pierce Thermo SCientific </td><td> MA1-82.159 </td></tr><tr><td> FITC için konjuge Fare izotip IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> PE-Cy5 konjuge fare anti-insan CD19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> PE-Cy5 konjuge Fare izotip IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 medya </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl phorbol asetat (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS Tampon (1X Fosfat Tamponlu Salin +% 5 fetal sığır serumu) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

B hücreleri Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonu lenfoblastoid hücre hatları in vitro (LCL) kurulması ile sonuçlanan, proliferasyonu ve daha sonraki ölümsüzleşme yol açar . LCL latent EBV ile enfekte olduğundan, onlar EBV gecikme ve virüs kaynaklı B hücre proliferasyonu ve tümörogenez 1 araştırmak için bir model sistem sağlar. LCL immünolojik testleri 2, 3 çeşitli antijenleri için kullanılır olmuştur. Buna ek olarak, LCL, insan monoklonal antikorlar 4, 5 birincil biyolojik materyallere erişim 6, 7 sınırlı bir potansiyel olarak sınırsız bir kaynak oluşturmak ve sağlamak için kullanılabilir. LCL oluşturmak için çeşitli yöntemler tarif edilmiştir. Önceki yöntemleri fitohemaglütininle, lipopolisakkarid 8 mitojenler kullanımı dahil ve EBV-aracılı ölümsüzleşme verimliliğini artırmak için mitojenle 9 pokeweed. Daha yakın zamanlarda, diğerleri immunosuppr kullanılansiklosporin gibi essive ajanlar, enfekte B hücrelerinin 7, 10-12 T hücre-aracılı öldürme inhibe . EBV enfeksiyonu hücre hatlarının kurulması için zaman önemli uzunluğu sürücüler EBV-odaklı B hücre büyümesini dönüşüm için daha hızlı ve daha güvenilir yöntemleri için gereklilik. Yüksek titrede EBV ve immünsupresif ajan bir arada kullanarak, sürekli olarak, enfekte, dönüşümü, ve periferik kan B hücreleri LCL oluşturmak mümkün. Bu yöntem, hücrelerin in vitro kümeler bulaşmış periferik kan mononükleer hücreler küçük bir miktar ortaya konabilir kullanır . FK506, immünosupresan bir T hücre varlığı ile EBV CD23 varlığı. Geleneksel olarak, prolifere olan B hücreleri akıbet EBV enfeksiyonu sonrası yaklaşık bir hafta hücrelerin mikroskobik kümeler görselleştirme tarafından izlenir. LCL kümeleri birkaç hafta sonra çıplak gözle görülebilir. Belirlemek için bir test tarif eğer erken EBV-aracılı growth dönüşüm mikroskobik hücre kümeleri ortaya konabilir önce bile başarılı olur. CD23, varlığı yüksek CD58 + hücreleri gözlenen en erken üç gün sonrası enfeksiyon başarılı bir sonuç gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines at JoVE.com

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Epstein-Barr virüsü ile transforme B hücre hatları üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, üç gün sonra enfeksiyon gibi erken olarak dönüşüm geçirmesi mukadder B hücreleri belirleyebilir bir roman tahlil göstermektedir.

Epstein-Barr Virus Büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K Görüntüleme.  State University of New York at Stony Brook. Epstein-Barr virüsü ile transforme B hücre hatları üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, üç gün sonra enfeksiyon gibi erken olarak dönüşüm geçirmesi mukadder B hücreleri belirleyebilir bir roman tahlil göstermektedir.

Video: Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / -</sup Ve P53 - / -</sup Fare

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...