Yazarlar, Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı Dr. Boris Reizis yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, akım sitometri ve video düzenleme ile ilgili yardım için Lu Huang ile teknik yardım için, Cornell Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı Dr Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell ve Deequa Mahamed teşekkür etmek istiyoruz. / - Fareler Yazarlar ayrıca p53 ıslahı ve genotipleme için kritik gözden geçirilmesi, el yazması ve video prodüksiyon ve Stephanie Yazinski Weiss laboratuvar Duhamel ve Weiss laboratuarlar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Bu araştırma, ABD Tarım Departmanı, Kooperatif Devlet Araştırma, Eğitim, ve Yayım Hizmetleri, Hayvan Sağlığı ve Hastalıkları Araştırma Programı (GED ve RSW) ve NIH hibe R03 HD058220 ve R01CA108773 (RSW) tarafından sağlanan fonları tarafından kısmen desteklenmiştir. Video Duhamel &amp; Weiss laboratuvarların personeli tarafından in-house imkanlarını kullanarak imal edilmiştir.

1. Tümör diseksiyonu <ol><li> Tümör diseksiyonu için, temiz bir kağıt havlu ya da tek kullanımlık cerrahi örtü diseksiyon pad üzerinde yerleştirilir ve% 70 etanol ile püskürtülür. </li><li> Fareler, bu protokol için rutin olarak CO 2 ile ötenazi ötenazi fare diseksiyon yastık yerleştirin ve etanol ile hayvanın her iki tarafta sprey . Bacakları içeri sokulur ve% 70 etanol ile iyice püskürtülür dört veya daha fazla itme pimleri kullanarak fare diseksiyonu ped üzerine bir yerde tutulur. </li><li> Steril makas kullanılarak altta yatan kasları kaçınarak ve vücut boşluklarında nüfuz ederken, orta hat üzerinde cilt pubis kafa tabanına kesilir. </li><li> Steril makas ve forseps iç organların zarar vermemeye dikkat ederek yeni bir çift ile karın boşluğuna açın. </li><li> Diseksiyon ve zararlı kan damarları olmadan ortaya çıkarmak için, tümörün göğüs kafesi saptırma ile göğüs boşluğu açın. </li><li> Diğer organlarda tümör ayırın ve soğuk PBS içine bir parça toplam tümör yaklaşık% 40-50 (yaklaşık 1.5 X 0.8 X 0.8 cm) transfer buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> Tümör kalan kısmı diğer deneyleri için kaydedilebilir ve tam bir nekropsi şu anda yapılabilir. </li></ol> 2. Kültürleme Lenfoma Hücreler <ol><li> % 70 etanol ve biyogüvenlik kabini transfer disseke tümör içeren tüp püskürtün. </li><li> Steril bir 150 mm 2 Petri kabı için 10 ml kültür ortamı ekleyin. </li><li> Petri kabı içine bir pipet ile hafif bir emme parça tümör aktarın. </li><li> Eğimli yan bakan iki steril 18 iğne bükün. </li><li> Bükülmüş iğneler kullanarak tümör ayrıştırmaları. </li><li> Swirl çanak hafifçe dokunun ve tümör büyük parça kaçınırken, bir yan hücre süspansiyonu toplamak için bir açıyla yerleştirin. </li><li> Tümörün büyük parça kaçınırken, 50 ml konik bir tüp içine hücre süspansiyonu ve transfer aspire edin. </li><li> Tümörün büyük parça kaçınırken, aynı tüp içine 10 ml orta ve transferi ile plaka yıkayın. </li><li> , Hafifçe lenfositler ve stromal hücrelerden oluşan hücre süspansiyonu karıştırın ve bir T-75 doku kültürü balona bir T-25 doku kültürü şişesi ve 10 ml 5 ml transfer. Matara yavaşça girdap. </li><li> 2.5 mL son hacmi (kültür damarlarının çeşitli türleri kullanarak farklı yoğunlukları kültür hücreleri T-hücre hattı kurulması olasılığını en üst düzeye çıkarır), 2, 4, 10.100 ve 1000 kat dilüsyonları yapmak için kalan hücre süspansiyonu kullanın. </li><li> 6 plaka bireysel kuyulara her seyreltme Levha 2.0 mL. Yavaşça girdap plakası. </li><li> Nemlendirilmiş CO 2 atmosferde hava hücreler 48 saat inkübe edin. </li></ol> 3. Besleme Lenfoma Hücreleri <ol><li> Inkübasyon 48 saat sonra hücrelerin minimal rahatsızlık ile duvar boyunca orta, T-75 balona T-25 orta şişeyi ve 10 ml 5 ml ekleyin. </li><li> 6 plaka hücrelerin minimal rahatsızlık ile duvar boyunca her iyi orta 2 mL ekleyin. </li><li> Ek bir 72 saat için hücreler inkübe </li></ol> 4. Lenfoma Hücreleri Pasajlanması <ol><li> İlk pasaj <ol><li> Inkübasyon beşinci günün sonunda orijinal şişeler ve levhalar (ilk geçişleri sırasında yaklaşık 3x106 / ml &#39;lik bir konsantrasyon hücre yoğunluğu korumak başarılı bir şekilde kurulması teşvik koruyarak, hücreler, 1:1 oranında geçişli. sürekli hücre hattı). <ol class="lalpha"><li> T-25 şişesi için 5 ml orta içeren yeni bir balona, ​​5 ml hücre süspansiyonu aktarın. Orijinal balona orta 5 ml ekleyin. </li><li> T-75 şişesi için, 10 ml orta içeren yeni bir balona 10 ml hücre süspansiyonu transfer. Orta orijinal balona 10 ml ekleyin. </li><li> 6 plaka için, her iyi orta 2 mL içeren yeni bir plaka ilgili kuyuların içine 2 ml hücre süspansiyonu her bir kuyudan aktarın. Orijinal kuyuların her bir kuyunun içine orta 2 mL ekleyin. </li></ol></li><li> Ek bir 72 saat boyunca tüm matara ve plakalar inkübe Bizim tecrübelerimize göre en hücre hatları bu geçit bir kültürler (gevşek yapışık süspansiyon hücre agrega varlığı ekli stromal hücreleri üzerinde kurulmuş bir hücre hattı erken bir göstergesidir) kurulmuştur. </li><li> Az ya da gevşek olarak yapışmış bir süspansiyon hücre agrega ile kültürleri için, dikkatli bir şekilde her 72 saat orta yaklaşık% 50 değiştirerek matara veya plakalar beslemek Orijinal kültür hücreleri kaldırarak önlemek için, kültür damarları supernatant orta hafif aspirasyon önce yerçekimi altındaki hücreleri tortu izin soluklu ve en az 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakılır. </li></ol></li><li> Kurulan hücre hatları bakımı <ol><li> Kurulan hücre hatları, yeni şişeler ve tabaklar içine geçişli. T-25 ve T-75 şişeler için, orijinal veya 5 ml ekleyingeçmesine orta 5 ml süspansiyon. 6-iyi plakalar için, T-25 balonuna orta 7 mL aslı veya geçit bir hücre süspansiyonu 3 mL ekleyin. Yem ve taze kültür ortamı ile temizlenebilir hacmi değiştirerek bir kültür aslı veya geçit korumak. </li><li> Passage, yeni T-25 şişeler içine hücre hatları kurdu. 18-24 saat hücre hatları iki katına zaman var Kültürleri rutin olarak 1-3x106 / ml yoğunlukta devam ve 3 gün her geçişli. Önceki pasaj kültürünün gerekli hacmi, 10 ml telafi etmek için yeni bir orta ekleyin. Yem ve özgün kültürünü korumak. </li><li> Birkaç pasajlar sonra, yapışmaz hücreler kendini yapışık stromal hücreler olmadan sürdürmek ve yapışık hücrelere daha küçük bir sayı her geçiş yapılır. Bu noktanın ötesinde, kültürleri, T-25 şişeler tedavi olmayan doku kültürü muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> 5. Lenfoma Hücre Hatları dondurulması ve Kurtarma <ol><li> Hücre hatları% 20 FBS ve% 10 DMSO içeren taze hazırlanmış RPMI 1640 orta dondurulur. </li><li> T-25 balonuna (yaklaşık 1.5x10 6 hücre / ml) 48 saat eski kültür Hücreler oda sıcaklığında 5 dakika 1500 rpm&#39;de santrifüj. Atarak süpernatantı sonra, 2 mL soğuk dondurma orta hücrelerin yeniden askıya alınır. Her balona iki hücre süspansiyonu 1.0 mL hacimli hemen -80 dondurulmuş, donma şişeleri yerleştirilir ° C, ve ertesi gün sıvı azot aktarılır. </li><li> Hücreler, hızlı bir çözülme ve 10 ml taze kültür ortamı içindekilerin resuspending sıvı azot depolama kurtarıldı. Alternatif olarak, 10 ml taze kültür ortamı resuspending önce DMSO kaldırmak için taze çözülmüş hücreler ılık kültür ortamı kez yıkanır. Hücreleri sonraki geçirilmesinden önce en az 72 saat süreyle kültüre. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bir Atm / - T-hücre hattı bu protokolü kullanılarak geliştirilen ve belirlenmiş DWJ-Atm-1 anti-CD3-FITC, anti-CD4 APC ve anti-CD8-PE ve akış sitometri analizi (Şekil 1) ile boyama ile karakterize edilmiştir. T-hücrelerinin% 90&#39;dan fazlası, CD3, CD4 ve CD8 triple-pozitif. <img src="/files/ftp_upload/2598/2598fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 bu protokolü kullanarak geliştirilen T-hücre hattı Karakterizasyonu. / - - Kurulmuş bir Atm hücre yüzey belirteçleri hücre hattı DWJ-Atm-1 ile boyanması ile karakterize edilmiştir atanmış anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE ve flow sitometri analizi. Kısaca, 1x10 6 taze hücreler soğuk PBS (1500 d / 5 dk) bir kez yıkanmış ve 4 inkübe ° C, PBS içinde% 1 BSA ile 1:200 dilüsyon antikor kokteyli (her antikor mcL 200 ile 10 dk . taze veya daha sonra analiz için sabit. Sabit hücreleri bir final konsantrasyon% 4 (hacim / hacim) ekleyerek nötr tamponlu formalin tarafından hazırlanan ve 30 dakika santrifüj yoluyla hasat, (4 ° C&#39;de inkübe ise hücreler hemen incelenebilir 1500 d / 1 X 10 4 hücrelerinin toplam 5 dakika) ve% 1 BSA ile PBS 200 mcL yeniden bekletildi. BD FACS Calibur analizörü ve CellQuest yazılımı (BD Biosciences, San Jose, CA) kullanılarak analiz edildi.

<ol>
	<li>Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm-deficient+mice:+a+paradigm+of+ataxia+telangiectasia.">Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.</a> Cell. 86, 159-171 (1996).</li><li>Elson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+defects+in+ataxia-telangiectasia+protein-deficient+mice.">Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).</li><li>Kuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Atm-/-+thymic+lymphoma+cell+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+by+dexamethasone.">Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).</li><li>Browne, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+a+catalytic+antioxidant+corrects+the+neurobehavioral+defect+in+ataxia-telangiectasia+mice.">Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice.</a> Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).</li><li>Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spectrum+analysis+in+p53-mutant+mice.">Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.</a> Curr Biol. 4, 1-7 (1994).</li><li>Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+T+cell+leukemia+cell+lines+established+from+SCL/LMO1+double+transgenic+mice.">Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice.</a> Leukemia. 15, 141-147 (2001).</li><li>Sharma, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+contributes+to+mouse+T-cell+leukemia+by+directly+inducing+the+expression+of+c-myc.">Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc.</a> Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).</li><li>Maser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers.">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447, 966-971 (2007).</li></ol>

Bu protokolde, iki farklı fare genotipleri fare T-hücre hatları kurmak için ayrıntılı yordamlar sağlar; - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] ve p53 - / - Atm [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . / - Ve üç (5 girişimleri), p53 - / - Bu protokol, 6 olmak üzere toplam (7 girişimleri) Atm kullanarak fare T-hücre laboratuvarda kurulmuştur. / - Bu hücre hattı DWJ-Atm-1, bir <em...

<ul><li> Buz kovası </li><li> % 70 etanol </li><li> Alüminyum folyo ve pimler ile kaplı köpük blok oluşan Diseksiyon ped </li><li> İki takım küçük steril makas ve forseps </li><li> Steril 150 mm 2 Petri kabı (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, kedi # 08-757-13) </li><li> Steril 18 insülin iğnesi </li><li> 50 ml konik tüpler (Corning Inc Corning, NY, kedi # 430.829) </li><li> % 10 formalin solüsyonu </li><li> Doku kültürü matara <ul><li> T-25 (DYP, Trasadingen, İsviçre; kedi # 90025.) </li><li> T-75 (DYP, Trasadingen, İsviçre; kedi # 90.075) </li></ul></li><li> 6-kuyucuğu (Corning Inc, Corning, NY, kedi # 3506) </li><li> Steril fosfat tuzlu pH 7,2 (PBS) tamponlu </li><li> Kültür ortamı <ul><li> L-glutamin (Lonza, Walkersville, MD; kedi # 12-115F) 200 mM, 25 mM HEPES RPMI 1640 aşağıdaki ile desteklenebilir: <ul><li> Inaktive% 10 ısı (56 ° C, 30 dakika) fetal sığır serumu (FBS; Hyclone Logan, UT, kedi # SH30088.03) </li><li> % 1 penisilin ve streptomisin (Mediatech, Manassas, VA, kedi # 30-002-CI) </li><li> % 1 aminoasitlerin (Mediatech; kedi # 25-025-CI) </li><li> 55 mM 2β merkaptoetanol (Sigma, St Louis, MO, kedi # M752) </li></ul></li></ul></li><li> Dimetil sülfoksit (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA, kedi # 317.275) </li><li> Antikorlar (eBioScience, San Diego, CA) <ul><li> anti-CD3-FITC (kat. no 11-0031-85) </li><li> anti-CD4-APC (kat. no 17-0041-83) </li><li> anti-CD8-PE (kat. # 12-081-85) </li></ul></li><li> Sığır serum albumin (BSA; Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NY, kedi # 11.018-017) </li><li> Concanavalin A (Sigma kedi # C5275) </li><li> 1.8 mL dondurma şişeleri (Nunc, Roskilde, Danimarka, kedi # 368.632) </li></ul>

derivation of thymic lymphoma t-cell lines from atm-/- and p53-/- mice

Kurulan hücre hatları araştırma laboratuvar hayvanları kullanımını azaltmak kritik bir araştırma aracı. ATM gibi genetiği değiştirilmiş farelerde Bazı suşları / - ve p53 - / - sürekli erken ömrü 1,2 timik lenfoma geliştirmek, ve böylece, fare T-hücre hatları türetilmesi için güvenilir bir kaynak olarak hizmet verebilir. Burada gerek kalmadan önceki protokoller 1,3 açıklandığı gibi interlökinler eklemek için kurulan fare timik lenfoma T-hücre gelişimi için ayrıntılı bir protokol mevcut. Tümörler, hunched duruş gözlem dayalı görünür tümörlerin erken göstergesi, üç ila altı ay arası farelerden alınan hasat nefes alma, yetersiz bakım ve duyarlı bir gerginlik 1,4 de israf yorucu. / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 ve p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 fareler Biz bu protokolü kullanarak çeşitli T-hücre hatları ve Atm kendilenmiş suşları başarıyla kurduk. Daha kurulan T-hücre nüfusunun% 90&#39;dan daha fazla CD3, CD4 ve CD8 ifade ettiğini göstermektedir. Stably kurulan hücre hatları ile tutarlı, mevcut protokolü kullanılarak üretilen T-hücrelerinin, bir yılı aşkın bir süredir geçişli olmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice at JoVE.com

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Bu video, fare timik lenfoma hücre hatları kurmak için bir protokol göstermektedir. Ve p53-/ - farelerde timus lenfoma ile bu protokolü takip ederek, başarıyla birkaç Atm / T-hücre hatları kurduk.

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / -</sup Ve P53 - / -</sup Fare

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

derivation-of-thymic-lymphoma-t-cell-lines-from-atm-and-p53-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

12.1K Görüntüleme.  Cornell University. Bu video, fare timik lenfoma hücre hatları kurmak için bir protokol göstermektedir. Ve p53-/ - farelerde timus lenfoma ile bu protokolü takip ederek, başarıyla birkaç Atm / T-hücre hatları kurduk.

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / - Ve P53 - / - Fare

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm^{- / - Ve P53^{- / - Fare}}