Bu yöntem, IM'li bireylerin aynı hastalık durumlarında farklı bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonunu sağlayacak ve bu da EBV enfeksiyonunun mekanizması hakkındaki anlayışımızı genişletecektir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir doktor olan Linlin Zhang olacak. Başlamak için, daha önce 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde izole edilmiş PBMC'leri alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de döndürün.
Süper natantı atın ve hücreleri hazırlanan tamponun 80 mikrolitresi ile yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 20 mikrolitre CD 14 mikroboncuk ekleyin, pipetle iyice karıştırın ve tüpü buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Daha sonra PBMC'leri bir mililitre tampon kullanarak yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın.
Tüm süpernatanı atın ve hücreleri 500 mikrolitre tamponla yeniden askıya alın. Manyetik ayırma için, manyetik boncuk ayırıcının üzerine bir sütun yerleştirin ve sütunu tamponun üç mililitresi ile yıkayarak astarlayın. Ardından, hücre askıya alma işlemini sütuna ekleyin.
Geçmesine izin verin ve etiketlenmemiş hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Kolonu üç mililitre tamponla üç kez yıkayın ve tüm atık suyu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Şimdi, kolonu yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin ve kolona beş mililitre tampon ekleyin.
Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri tüpe yıkamak için pistonu sıkıca sütuna itin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve sonraki transkriptom dizilimi için hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Toplanan etiketsiz hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj yaparak toplayın ve hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna her etiketli antikorun iki mikrolitresini ekleyin ve ışıktan korunarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, negatif kontrol numunesi CD 3, CD 4, CD 8 ve CD 19, tek boyama örnekleri ve bir CD 56 veya CD 16 boyama örneği oluşturmak için 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde PBMC hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini aliquot edin.
Daha sonra her tüpe karşılık gelen floresan etiketli antikorun iki mikrolitresini ekleyin ve ışıktan korunarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüm hücreleri daha önce gösterildiği gibi PBS ile yıkayın ve 500 mikrolitre PBS'de tekrar askıya alın. Hücre sıralama sistemini açın ve güç açma programını çalıştırın.
Ardından, 85 mikrometrelik nozulu takın ve sıralama akışını açın. Sıralama voltajını 4.500 volta ve frekansı 47'ye ayarlayın. Kesme penceresinde boşluğu 8'e ayarlayın ve damlacık genlik değerini otomatik olarak belirlemek için tatlı nokta otomatik sıralama modunu açın.
Son olarak, damlacık gecikmesini yan akış penceresinde 30.31'e ayarlayın. İleriye ve yana doğru saçılma nokta grafiği kullanarak, bozulmamış lenfosit popülasyonunu tanımlamak için P1 poligon kapısını çizin. Ardından, yükseklik noktası grafiğine karşı ileri dağılım alanı kullanarak, tek hücreleri tanımlamak için P2 çokgen kapısını çizin ve çiftleri hariç tutun.
Ardından, CPCY 5,5 alan nokta grafiği başına CD 3'e karşı CD 19 FITC alanı kullanarak, CD 3 pozitif T hücrelerini ve CD 19 pozitif B hücrelerini seçmek için dikdörtgen kapı P3'ü çizin. Ardından, CD 4 APCCY 7 alanına karşı CD 8 PE alanı nokta grafiği kullanarak, CD 4 ve CD 8 pozitif T hücrelerini seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin. Son olarak, CD 56 veya CD 16 APC alanı nokta grafiğine karşı bir yan dağılım alanı kullanarak, CD 56 veya CD 16 pozitif doğal öldürücü hücreleri seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin.
Negatif kontrol tüpü için, edinme panosunda yüke tıklayın ve yazılımdaki sitometre ayarlarını seçin. Denetçi penceresinde, parametreler sekmesini tıklatın ve ileri saçılma, yan saçılma ve farklı floresan boyaların voltajlarını ayarlayın. Tek lekeli tüpleri sitometreye yükledikten sonra, edinme panosunda yük'ü tıklayın, ardından metinde açıklandığı gibi telafiyi ayarlamak için telafi sekmesini tıklayın.
Tüpü sitometreye yüklemeden önce hücre süspansiyonunu yavaşça vorteksleyin. Dört toplama akış tüpüne 200 mikrolitre FBS ekleyin ve tüpleri vorteksleyin. Onları sitometre toplama odasına yerleştirin.
Farklı hücre tiplerini dört akış tüpünde ayrı ayrı toplayın. Ayrılmış hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de döndürün ve transkriptom dizilimi için hücre paletine 200 mikrolitre RNA izolasyon reaktifi ekleyin. Bu çalışmada, farklı örneklerin periferik kanından elde edilen immün hücre alt popülasyonları, immünomanyetik boncuklar ve floresan aktive hücre sıralama teknikleri birleştirilerek verimli bir şekilde ayrıştırılmıştır.
Bu protokolde daha da önemlisi, hücre sıralama adımı, hücre canlılığını artırmak için optimize edilmiştir. Sıralanmış bağışıklık hücreleri, enfeksiyöz mononükleozlu hastalarda hem sağlıklı Epstein-Barr virüs taşıyıcılarına hem de enfekte olmamış örneklere kıyasla CD 3, CD 8 pozitif T hücrelerinin artmış bir oranını göstermiştir. Buna karşılık, enfeksiyöz mononükleozlu hastalarda sağlıklı EBV taşıyıcılarına ve EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla CD 3, CD 4 pozitif T hücreleri ve CD 19 pozitif B hücrelerinin oranlarında azalma gözlenmiştir.
Ek olarak, enfeksiyöz mononükleozlu hastalarda EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla CD 56 veya CD 16 pozitif doğal öldürücü hücrelerin oranlarında azalma gözlenmiştir. Hücre canlılığını korumak, sonraki deneyler için hayati öneme sahiptir. Ayırma işlemi sırasında hücreleri buz üzerinde veya buzdolabında tutmak, hücre canlılığı için faydalıdır.
