Bu yöntem, Epstein Barr virüsü parçacıklarını P3HR1 hücre hattından izole etmemize ve çeşitli araştırma amaçları için kullanılabilmesi için virüs stokunu ölçmemize izin verecektir. Bu tekniğin temel avantajı, bir EB viral stoğu hazırlamak için nispeten kolay, ucuz, hızlı ve güvenilir bir yöntem sağlamasıdır. Bu teknikle üretilen hayati parçacıklar, EB.To başlangıcının teşhisi için birçok in vitro veya in vivo deneysel modelde kullanılabilir, 15 mililitrelik bir konik tüpte bir hücre süspansiyonu A hacmi hazırlar, hacmi 100 milimetrelik bir kültür plakası için hücre sayısı kabaca 2.2 milyon hücre olacak şekilde ayarlar.
Tüpe beş mililitre tam kültür ortamı ekleyin. Tüpe 80 mikrolitre dimetil sülfoksit ekleyin. Daha sonra tüpe mililitre PMA başına bir miligramlık 350 mikrolitre ekleyin.
PMA'nın nihai konsantrasyonu mililitre başına 35 nanogram olmalı ve DMSO'nunki% 0.08 olmalıdır Toplam hacim 10 mililitre olacak şekilde 4.27 mililitre kültür ortamı ekleyin. Borunun içeriğini eğerek karıştırın, ardından içeriği 100 milimetrelik bir kültür plakasına aktarın. Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe beş gün boyunca 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte bırakın.
İnkübatörde beş gün sonra, hücreleri peletlemek için plakanın içeriğini sekiz dakika boyunca 120 G'de santrifüj edin Süpernatant içeren hücresiz virüsü toplayın ve hücre peletini atın. Virüs parçacıklarını peletlemek için süpernatantı dört santigrat derecede 90 dakika boyunca 16.000 G'de tekrar santrifüj edin. Süpernatantı atın ve virüs peletini beş mililitre kültür ortamında yeniden askıya alın, Aliquot viral süspansiyonu her biri 250 mikrolitre viral süspansiyon içeren 20 tüpe dönüştürün ve süspansiyonu eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Proteinleri DNA'dan ayırmak için, viral preparatı içeren tüplerden birine 500 mikrolitre Tris doymuş fenol ekleyin. Pembe bir emülsiyon elde etmek için 100 mikrolitre su ve vorteks kuyusu ekleyin. 9.650 G'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın, süpernatantı toplayın ve yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın.
Soğuk sodyum asetatın süpernatant hacminin onda birine eşdeğer bir miktar ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra mililitre glikojen başına bir mikrolitre 20 miligram ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Süper natantın soğuk% 100 etanol hacminin üç katını ekleyin ve gece boyunca eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Viral DNA santrifüjünü dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 9.650 G'de izole etmek için. Bir DNA pelet elde etmek için süpernatantı atın ve peleti bir mililitre soğuk% 70 etanol ile üç kez yıkayın. Yine 15 dakika boyunca 9.650 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
Pelet yaklaşık 10 dakika boyunca hava ile kurutulduktan sonra, peleti 10 ila 50 mikrolitre nükleaz içermeyen damıtılmış suda yeniden askıya alın. Numuneleri daha sonra işlenmek üzere eksi 20 santigrat derecede veya maksimum DNA çözünmesini sağlamak için gece boyunca dört santigrat derecede saklayın, ardından eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bir mikro spektrofotometrenin kaidesini hassas bir görev sileceği ile temizledikten sonra, hazırlanan DNA örneğinin bir mikrolitresini yükleyin ve numunedeki DNA konsantrasyonunu not edin.
Hem 260 ila 280 nanometrede hem de 260 ila 230 nanometrede absorbans oranlarını kontrol edin. DNA 260 nanometrede, proteinler 280 nanometrede emecek ve fenol gibi organik maddeler 230 nanometrede emecektir. Gerçek zamanlı PCR için 1.8'e 2 oranı yeterli kabul edilir.
PCR reaksiyon karışımlarını hazırlamak için, 0,2 mililitrelik PCR tüplerine beş mikrolitre siber yeşil gerçek zamanlı PCR karışımı yerleştirin. Her tüpe mikrolitre ileri astar başına bir mikrolitre 7.5 piko mol ve mikrolitre ters astar başına bir mikrolitre 7.5 piko mol ekleyin. Burada EBV küçük RNA 2 geni güçlendirilir.
EBV genom kopya numarasını belirlemek. Daha sonra tüplerden birine iki mikrolitre nükleaz içermeyen su ve bir mikrolitre viral DNA ekleyin. Reaksiyon karışımının toplam hacmi 10 mikrolitredir.
Bilinen EBV genom kopya numaraları ile standart olarak kullanılacak diğer tüpleri hazırlayın. PCR karışımlarını, aktivasyonun ilk adımından başlayarak 95 santigrat derecede beş dakika boyunca çalıştırın. Daha sonra 15 saniye boyunca 95 santigrat derecede 40 döngü ve 30 saniye boyunca 58 santigrat derecede döngü.
Tüm veri sayfalarını CSV dosyaları olarak dışa aktarın ve standart tüp başına EBV genom kopyası sayısının günlüğünü ve ortalama CQ değerlerini hesaplayın. Standartların BT değerlerini, genom kopyalarının sayısının günlüğüne göre çizerek bir qPCR standart eğrisi oluşturun. Standart eğri grafiği denklemini kullanarak, indüklenen viral DNA'yı içeren PCR tüpündeki EBV genom kopyalarının sayısını türetir.
Son olarak, indüklenen viral preparatın konsantrasyonunu hesaplamak için ekranda gösterilen formülü kullanın. Burada X, standart eğriden türetilen EBV genom kopyalarının sayısıdır ve F, PCR reaksiyonu başına DNA'yı ayarlamak için kullanılan seyreltme faktörüdür. Bir hemositometre odası kullanılarak hücre sayımı burada gösterilmiştir.
Dört kadran bir ışık mikroskobu kullanılarak sayılır. Burada mavi ile belirtilen hücreler sayılmalı, kırmızı renkli hücreler ise kadranının üst, sağ, alt veya sol kenarlıklarına dokundukları için sayılmamalıdır. En yüksek sayıda EBV partikülü verecek PMA ve dimetil sülfoksit konsantrasyonlarını belirlemek için bir optimizasyon çalışması yapıldı.
% 0.8'lik bir DMSO konsantrasyonu ve% 0.8'lik bir PMA konsantrasyonu mikrolitre başına 35 nanogramlık bir PMA konsantrasyonu optimaldi ve yüksek EBV konsantrasyonlarına neden oldu. Laboratuvarımız bu virüse karşı prootoimmün veya enflamatuar yanıtları incelemek için bu teknik tarafından üretilen hayati parçacıkları kullandı. Yeni anti-EBV ajanları geliştirmenin yanı sıra.
