Bu çalışmaya katkıda ve en Yapısal Membran ve Fonksiyonel Biyoloji Grup, geçmiş ve şimdiki üyeleri hem birçok kim vardır. Tüm etmek bizim en içten teşekkürlerimizi ve şükranlarımızı. Bu eser Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM75915, P50GM073210 ve U54GM094599) ve FP7 COST Action CM0902 hibeleri ile kısmen desteklenmiştir.

1. Kristalleşme Plaka hazırlama Robotik bir kristalleşme deneme yapmak için ayarlama referans 2 ayrıntılı olarak açıklanan cam kristalleşme sandviç plaka (Şekil 2), ve temel levha hazırlanması ile başlar. Taban plakası ilk Silanlanmış olmalı ve kuyuları oluşturur delikli çift sopa boşluk, plaka uygulanması gerekir. Bunun için gerekli malzeme ve sarf malzemeleri Malzeme altında maddeler halinde sıralanır. <ol><li> Bir kağıt havlu üzerine plaka yerleştirin, çözüm silanizing birkaç damla uygulayın ve bir kağıt mendille plaka yüzeyi üzerinde eşit biçimde dağıtın. </li><li> Su bir behere plaka daldırarak aşırı silanizing çözüm çıkarın. </li><li> Beher plaka çıkarın, kuru bir kağıt havlu, Silanlanmış tarafta o kadar yerleştirin ve kağıt havlu ile hafifçe silerek kendi yüzeyidir kurulayın. </li><li> Delikli, çift-çubuk boşluk üzerinde koruyucu kapak soyunve cam levha kuru, Silanlanmış yüzeye, spacer, yapışkan tarafı aşağı geçerlidir. Boşluk sol üst köşesinde ve spacer bitişik iki ve çakışık plaka ile taban plakası üzerine doğru şekilde yerleştiğinden emin olun. </li><li> Taban plakası üzerinde boşluk düzleştirmek için ve aralarında sıkı bir mühür oluşturmak için bir rulo veya brayer kullanın. </li></ol> Önceden birleştirilmiş plakaları (; MD11-55-100, moleküler boyutları; ve LCP96T-UVP70U, Swissci HR3-151, Hampton Research), ticari olarak mevcuttur. Maliyet nedenlerden dolayı, yukarıda protokolü takip kendi plakaları monte tercih. 2. Mezo Robot 1&#39;de Bu video madde olarak gösterilmesi için mezo robot içinde ilk olarak şu anda MS &amp; FB grubu (Şekil 3) de kullanılan biridir. Robotun tüm ayrıntıları Malzemeler altında ve Referans 5. bölümünde bulunabilir. Malzeme ve equipment Malzeme altında maddeler halinde robot kullanarak bir kristalizasyon deneme kurmak için gereklidir. <ol><li> Robotun güvertede Bölüm 1 &#39;de hazırlanan boşluk ile taban plakası yerleştirin. Bu taban plakası uyum amaçları için iyi bir pozisyon ile işaretlenmiş kendi platformuna sahiptir. Plaka tanımlama amaçlı etiketlenmiş olmalıdır. </li><li> Kristalleşme plakasının yanına robot güvertesinde kendi platformunda 96-çöktürücü blok sabitleyin. </li><li> Plastik sızdırmazlık kapağı soyulması tarafından dikkatle blok açın. </li><li> Nemlendirici açın ve robot güverte taban plakası üzerinde ve genelinde nemli hava akışı yönlendirmek. Nemlendirici çökelti çözeltisi buharlaşmasını azaltmak için ve kristalleşme plaka 5 üzerinde tekrarlanabilirliğini artırmak için gösterilmiştir. Bu Mezofaz ve dağıtım başlamadan hemen önce, aksi takdirde ortam bağıl nem düşük olduğunda alanı önceden nemlendirmek veya önceden açık olarak set-up açılabilir. </li><li> Üreticinin yönergelerini takip robotu başlatılamıyor. Tam prosedürler zamanla değişecektir çünkü Enstrüman özgü talimatlar burada ayrıntılı olarak tarif edilmeyecektir. Esasen, ne başlatılıyor sırasında olur robot kolu dağıtım Mezofaz üç ortogonal yönde X, Y ve Z yönünde referans konumları ile sağlanan olmasıdır </li><li> Robotun Kol 1 (Şekil 3), iğne dağıtım ile tam bir Hamilton şırınga protein yüklü Mezofaz takın. Şırınga içine yüklemek için Mezofaz ve nasıl hazırlamak için nasıl tam ayrıntıları Kaynaklar 3,7-10 tarif edilmiştir. </li><li> Kristalizasyon taban plakası üzerinde boşluk gelen üst koruyucu kapağı çıkarın ve taban plakası platformda fiducials ile plaka üzerinde kuyular hizalayın. Not, bu video amacıyla, koruyucu kapak hizalama basamağı sırasında Görüntüleyici yardımcı olmak üzere yer bırakılmıştır. </li><li> Dozaj syring bir iğne ucu hizalamakristalleşme plaka (O A1) sol köşesinde iyi üstteki alt sahip e. Bu iğne ucu da alt söz konusu ne kadar yakın izlerken dağıtma kolunun yükseklik ya da Z-koordinat ayarlayarak göz tarafından yapılır. Ucu sadece kuyunun dibinde dokunuyor Bu dağıtım kolunun yüksekliğini ayarlayarak çok hafif iken platformda yan yana plaka taşıyarak karar olabilir. </li><li> Bilgisayara uç temas plakası dağıtma kolunun Z-koordinat girin. Dağıtıcı 80 mikrometre bu referans baz plakasının yüzeyine karşılık gelen Z-pozisyonundan iğne ucu ile yer almak üzere programlanmıştır. </li><li> Göz de A1 merkezinde iğne ucu ile yerleştirin. Kontrol bilgisayarı referans X, ucu merkezli dağıtım kol Y koordinatı saklayın. Bu koordinat levha üzerinde kalan kuyu merkez tanımlamak için kullanılır. </li><li> Prtaze mezofaz sağlamak için robot bilgisayarda uygun komutu kullanılarak ime şırınga ve iğne dağıtıcı birinci ve bunu takip eden kuyular mezofaz bunların tamamlayıcı almasını doldurur. Bir doku ile iğnenin ucunda çekilmiş Mezofaz siliniz. </li><li> Robotun Kol 2 çöktürücü dağıtım ipuçları yıkanır ve çöktürücü blok çözümler aspire hazırlanan adımları kızarma yuvarlak başlatmak için Run Robot (X-AP) programını başlatın. </li><li> Etkinleştir hareket çöktürücü çözümleri (genellikle 800 nl) izledi ilk protein yüklü Mezofaz (genellikle 50 nl), bir seferde sekiz kuyu bir sütun ile kuyu sıralı yükleme ayarlamak için robot işlevini dağıtmak. Yükleme sütunları arasında, iğnenin ucundaki bir yerleştirilen bir park konumuna mezofaz dağıtma kolu döner kurumasını ucunda mezofaz önlemek için sünger ıslattı. Dağıtım Mezofaz ve çöktürücü süreci tekrarlanırPlaka üzerinde 11 kez plaka dolana kadar. Mezofaz ve çöktürücü ile bir 96-kuyulu plakanın yükleme tamamlamak için 5 dakika sürer. </li><li> Plaka doldurulur ve robot kollar kendi parkta konumlarına geri dönmüşlerdir bitmez, robot güverte plakasını çıkarın ve düz bir katı yüzey üzerine yerleştirin. </li><li> Derhal, iyi kompozisyon zamana bağımlı değişiklikler en aza indirmek için bir kapak-cam plaka mühür. Bu kapak cam taban plakası ile kare hizalanmış ve kapak cam hiçbiri taban plakasının izi ötesinde olduğunu, 96 kuyu tamamen kapalı olduğundan emin olmak için önemlidir. Bir silindir veya brayer kapak camı ile boşluk arasında sıkı ve eşit bir mühür oluşturmak için kullanılır. </li><li> Olması gerektiği gibi set up gitti emin olmak için plakasını kontrol edin. Ne bir arayan her kuyuda görünümü &#39;Bir tavada kızarmış yumurta&#39; dir. Kızarmış yumurta sarısı mezofaz karşılık gelir. Yumurta ve beyaz bir çökeltici madde solutive pan kenarına iyi kristalleşme çevre uzunluğudur. İdeal olarak, üç konsantrik vardır. </li><li> Kristal büyümesi için sıcaklık kontrollü bir depolama alanı içinde plaka yerleştirin. </li><li> Artık plakaları kurmak isteniyorsa, robot güverte çöktürücü bloğu kaldırmak, sıkıca kapatın ve depolama içine geri koymak. </li><li> Robotun dağıtım kolundan Mezofaz içeren şırınga çıkartıp parçalayarak, bir sonraki kullanım için hazırlık metanol ve kuru dikkatlice dağıtım iğne ve yüksük gibi parçaları, yıkayın. </li></ol> 3. Mezo Robot 2&#39;de. Sivrisinek LCP Sivrisinek LCP robot (Şekil 4) Robot 1 tarafından kullanılana benzer bir mezofaz dağıtıcı içerir. Robot 1 aksine olarak, tek kullanımlık uçları ile çökeltici madde dağıtır. Programlama yazılımı özellikle kristallenme tabak ve precipit çalışmak için araç ayarlamak için kullanılırkarınca blok ve belirli bir sırayla Mezofaz ve çöktürücü kullanıcı tanımlı birimler dağıtmak için. Bu gibi ayrıntılar üreticisi tarafından sağlanan ve burada tarif edilmeyecektir. <ol><li> Gibi Robot 1 altında ve Jüpiter madde 1712 1, içinde açıklanan iğne ile birlikte ve protein yüklü mezofaz ile doldurulmuş bir şırınga Hamilton, hazırlayın. </li><li> Robotun dağıtım kolunda pozisyonda şırınga Kelepçe. </li><li> Güverte kullanın X ve dağıtım şırınga iğne Y koordinatları kurmak için lazer sensörü monte. Bu mezofaz plaka üzerindeki her bir kuyucuğa merkezine doğru sürülür sağlamak için gereken önemli bir adımdır. </li><li> Kontrol paneli üzerindeki bir düğmeye dokunarak, asal şırınga iğne Mezofaz sınırdışı. Kuyu yüklemek için robot kullanarak hazırlık bir doku ile iğne ucundan ekstrüde Mezofaz çıkarın. </li><li> Robot nemli güvertede kristalizasyon plaka yerleştirmeden öncekapilarite tarafından yerinde plaka tutma yardımcı olmak için su ile bir kaç damla platform yüzeyi en. </li><li> Cam taban plakası üzerinde boşluk koruyucu kapağı çıkarın ve iyi yapışma sağlamak için sıkıca platform üzerine yerleştirin. Böylece dağıtım iğne ucu ile ilgili olarak plaka kuyuları doğru konumlandırılmasını sağlayabilir 3 köşe kuyu hizalamak için platform üzerinde üç fiducials kullanın. Cihaz artık bir dağıtım döngüsü girmek için komut verilir. </li><li> Döngüsü Mezofaz taze Mezofaz ile kuyu yüklemeye geçmeden hemen önce, küçük bir cam plaka üzerine sürülür, ikinci bir astar adımla başlar. Sonra robot ilk Mezofaz plaka üzerinde 8 kuyu dikey bir sütun ile yükler ve Mezofaz bolus üstüne çöktürücü solüsyonu dağıtmak için tek kullanımlık uçları kullanır. Bütün yuvalara dolana kadar işlem plakasının uzunluğu boyunca 11 defa tekrarlanır. Tüm süreci tamamlamak için yaklaşık 5 dakika sürer. </li><li> Çıkarmakdolu robotun platformunda, plaka ve Robot 1 altında yukarıda tarif edilen bir kapak camı ile izole edin. </li><li> Kristal büyümesi için bir sıcaklık kontrollü bir ortam içinde, uygun şekilde etiketlenmiş, plaka yerleştirin. </li></ol> 4. Mezo Robot 3&#39;te. Gryphon LCP Gryphon LCP robot (Şekil 5) robot 1 ve 2 için yukarıda anlatılana benzer bir mezofaz dağıtma sistemini içerir. Ne diğer iki ayıran 96 Çöktürücü çözümleri eşzamanlı reçete olmasıdır. <ol><li> Protein yüklü mezofaz hazırlayın ve robot 1 ve 2 uyarınca, yukarıda tarif edildiği gibi, dağıtma şırınga içine yükleyin ve Jüpiter madde 1712 1. </li><li> Robotun dağıtım kolunda pozisyonda şırınga Kelepçe. </li><li> Robotun güvertesinde çökelti çözeltisi blok ve kristalizasyon plakası yerleştirin. </li><li> 96-ucu hea yükleyinÇöktürücü çözümleri ile d. Bir kullanıcı tanımlı gecikme süresi viskoz presipitanlar aspire kolaylaştırmak için sağlanmıştır. </li><li> Bir dağıtım döngüsü girmek için alet komutu. Döngüsü mezofaz tamamlanması için yaklaşık 1 dakika süren bir süreç içinde 96 kuyu içine ardışık olarak dağıtılmış olması ile başlar. 96-ucu kafası sonra kristalizasyon kuyularda Mezofaz bolus üstüne kerede 96 Çöktürücü çözümler dağıtır. Tüm plaka yükleme işlemi 2 dakika içinde bitti. </li><li> Robot platformu dolu plakasını çıkarın ve Robot 1 altında yukarıda belirtildiği gibi bir kapak-cam ile kapayın. </li><li> Kristal büyümesi için bir sıcaklık kontrollü bir ortam içinde, uygun şekilde etiketlenmiş, plaka yerleştirin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bu video makalenin amacı bir viskoz, cam toplam yüzeyi membran proteini yüklü Mezofaz ile otomatik kristallendirme çalışmalarında nasıl kurulacağını göstermek içinh 96-kristalleşme plakaları. Vurgu az manuel müdahale gerektiren uzmanlaşmış robotlar aracılığıyla otomasyonu üzerinde. Bir robot kullanıldığında Mezofaz ve çöktürücü kalmaması ve iyi içinde hem yerleştirme, hacimleri açısından Tekrarlanabilirlik ve hassasiyet, bekleniyor. Bu crystallogenesis destekleyen şartlar etkin tarama bakış açısından önemlidir. Ayrıca görüntüleme cihazları ile genellikle yapılır kristal büyümesini değerlendirmektir analiz boru hattı sonraki adım için kritik öneme sahiptir. Damla veya bolus konumu görüntüleme sürecinin anahtarı olduğu ve kuyuya bolus düzensiz ve yanlış yerleşimi genellikle düzeltmek için kullanıcı müdahalesi gerektirir ve zaman alır. Örnekleme amaçları için, uygun bir şekilde ve doğru bir biçimde yüklü levha örnekleri Şekil 6 &#39;da gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> <html> Şekil 1. Akış mezo-yetiştirilen membran protein kristalleri üretimi, hasat ve kriyo-soğutma dahil adımları özetlemektedir. Kesikli kırmızı çizgi ile çevrili Adımlar Bu Jove makalenin odak vardır. Robotlar Adımlar 29-32 yılında Mezofaz ve çöktürücü çözümleri dağıtmak için kullanılmıştır. Referans 3 Gönderen. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. A tam yüklü ve mühürlü 96-cam sandviç kristalizasyon tabağı. Her iyi 50 nl kübik faz ve 1 ul çökelti çözeltisi içerir. Anlaşılır olması için, kübik faz Sudan Red ile boyanmış ve çökelti çözeltisi Metilen Blue içerir olmuştur. Referans 5 Gönderen. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 3 &quot;/&gt; Şekil 3. Mezo robotu (Robot 1). Robotun iki kolu var. Kol 1 dağıtır protein yüklü lipidik Mezofaz. Kol 2 Çöktürücü çözümler dağıtır. Dolum sırasında, 96-plaka kendisini hareketsiz robot güvertede pozisyonda sabit kalır. Iki kol Mezofaz ve çöktürücü çözümler sunmak için hareket. Referans 3 Gönderen. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Sivrisinek LCP robotu (Robot 2). Robot 1, 96-kuyulu plaka ve çökelti çözeltisi blok üzerine oturduğu Sivrisinek LCP ve güverte farklı olarak, dolum esnasında yatay olarak hareket eder. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Gryphon LCP Robot (robot 3). Bir sırasındakurmak, lipidik kübik faz dağıtıcı 96-plaka üzerine protein yüklü Mezofaz sunmak için hareket eder. Güverte sonra çökelti çözeltisi ucu başının altına plaka konumlandırmak için yatay çevirir. Tüm 96 Çöktürücü çözümleri aynı anda dağıtılır. Resim üreticisi (kaynaklı <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) ve etiketli. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6.. Bir tam yüklü ve mühürlü 96-cam sandviç plaka (A) ve uygun bir şekilde kuyu (B) ve uygun olmayan şekilde (C, D), mezo robot (Robot 1) kullanılarak doldurulur. In plaka üzerinde barkod etiketi bir plaka inkübatör / görüntüleme cihazı içinde plaka izlemek için kullanılır. Panellerde BD, çökelti çözeltisi ve Mezofaz sırasıyla P ve M, işaretlenir. Beklenen &#39;bir tavada kızarmış yumurta&#39;B iyi görünümü, bir uygun şekilde yüklenebilir ve sızdırmaz bir özelliğidir. C, çöktürücü bir off-merkezi konumda iyi düzgün akar olmuştur ve boşluk ile temas geldi. C, bu Mezofaz hacmi olması gerekenden daha az olduğunu da görünür. Çökelti çözeltisi ile tamamlanmamış yükleme için bir örnek ölçek için D&#39;de gösterildiği gibi, tüm kuyu çapı 6 mm &#39;dir.

<ol>
	<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501 (2011).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallization.">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li><li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II:+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping.">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li><li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution.">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li><li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis.">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography.">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video yazıda otomatik bir protein yüklü lipidik Mezofaz kullanarak 96-sıra cam sandviç plakaları mezo kristallendirme çalışmalarında kurmak için bir robot nasıl kullanılacağını göstermiştir. Bu çalışmada kullanılan orijinal olarak 7 robot özel olarak tarif edildiği gibi, viskoz ve yapışkan bir mezofaz nanolitre hacimleri doğru ve tekrarlanabilir bir dağıtımı için bir pozitif yer değiştirme cam şırıngaya içerecek şekilde tasarlanmıştır. Doğruluk ve hassasiyet bir robot önemli özellikleridir. Ancak, bu özellikleri robotun performansı değerlendirilir ve kalibrasyon gerçekleştirilir derece ve düzenlilik olarak sadece iyi. Bireysel plakaları kurmak edilirken robotun performansını değerlendirdi gerektiğini söylemeye gerek yok. Bu robotun kusursuz çalışır ve katılımsız çalıştırmak için robot bırakmak olduğunu varsaymak uygun değildir. Özenli ve dikkatli operatörü bir pos olmalıdırition bir ses falan düzgün çalışmıyor ve hemen düzeltmek için bir görünümü ile dikkat. Ayrıca, her plaka dikkatle en kısa sürede plaka mühürlü yanı içeriklerin bütünlüğü için göz tarafından kontrol edilmelidir ve kristalizasyon denemeleri için uzağa koymak önce. Bu sadece bir sonraki levha yüklenirken birkaç saniye gerçekleştirmek ve yapılabilir gerektirir. Fark, örneğin, özellikle kuyu tam dolu olmayan belirli bir çöktürücü boşaltım ucunu arızalı olduğu gerçeğini aydınlatabilir. Mezofaz teslim düzensiz olduğu görüldü olmalı, ilgili arızalı öğe hemen düzeltilmesi gerekir. Bu konularda dikkat ve kurulum sırasında ilgili ayarlamalar yaparak kadar değerli ve lipid membran proteini içeren, zaman ve malzeme tasarrufu olacaktır. Bir kamera kristal büyüme izlemek için kullanılırsa, doğruluk ve hassasiyet de görüntüleme sırasında izlenebilir. Damla veya hap ile Örneğin, sistematik problemlerkamera tarafından konumu bir şey doğru değildir ve protokol yerde akıntıya düzeltici eylem gerekli olduğunu gösterir. Güvenilir performans çıkarları nedenle robotu düzenli aralıklarla kalibre edilmeli ve gerektiği gibi. Kalibrasyonları çökeltinin kuyuya bolus ve Çöktürücü yerleşim yanı sıra teslim Mezofaz hacmi içermelidir. Açıkçası, mümkün kalibrasyon kalite kontrol egzersiz kapsadığı dönemde yapılan çalışmalarda kullanılacak benzer hacimleri ve malzemeler kullanılarak yapılmalıdır. Kalibrasyonu kadar önemlidir bu yüzden de stok robotu parçaları ve malzemeleri yeterli kaynağı yaşıyor edilir. Afet ve beklenmedik arızaları, tıkanıklıkları ve çöker ve meydana yapabilirsiniz. Böyle bir durumda, müsait bir yedek çöktürücü teslim ucu olan, örneğin, çok değerli bir zar proteini hazırlama gerektiği gibi kullanılmış olduğu anlamına olabilir veboşa değildir. Bir robotun avantajları bazıları aslında devamlı çalışmak ve yorgunluğu &#39;şikayet&#39; ya zarar vermez olacak gerçeğini içerir. Bir robot, aynı zamanda aydınlatma kontrollü ve çevresel şartlar altında, böyle karanlıkta insan dostu olarak kabul edilmez koşullar altında kullanılan ve aşırı sıcaklıklarda olabilir. Bu makale gösterilen robotlar tüm ~ 20 ° C&#39;de ortam koşullarında kullanıldı Ancak, proteinlerin ve non-ortam sıcaklığında, kontrollü 11,12 ışık ve bir oksitleyici veya indirgeyici bir ortamda 13. gerektirmez proje vardır. Bütün bunlar, bir kristalizasyon robot kullanılan göreceli olarak kolay olan, yiyecek ve içecek olabilir. Önceki bir Jüpiter Video yazıda mezo yöntemi ile kristallendirme çalışmalarında elle 1 kurmak nasıl gösterdi. El ile güvenilir bir şekilde vazgeçilebilir mezofaz arasında minimum hacmi b sınırlıdırçalışmaların oluşturulmasını kişinin y keskinliği görsel ve istikrarlı ellilik. Bizim tecrübelerimize göre, 100 nl gibi düşük Mezofaz hacimlerini kolaylıkla işlenir. Biz varsayılan hacmi 40 nl hakkında elle dağıtılan bir laboratuar biliyorum. Ancak, oldukça küçük hacimli bir robot kullanarak mümkündür. Bunların yanı sıra, 550 pikolitre gibi düşük mezofaz miktarlar robot 14 vazgeçilebilir olduğunu göstermiştir. Bu iş bakıldığında robot tarafından daha fazla minyatür uygulandığı takdirde, bir kristalizasyon deneme gerçekleştirmek için gerekli olan değerli zar proteini miktarının büyük bir azalmaya yol açacak olan, mümkün olduğu anlaşılmaktadır. Bu video makalede, üç ticari robotlar lipidik mesophases kullanarak high-throughput membran protein kristalizasyon göstermek için kullanılmıştır. Bunlardan ilk olarak Jove 1712 1 anlatılan manuel denemeler kurma tecrübesine dayanarak MS &amp; FB Grubu, geliştirilmiştir. Bu aletler olduğument ile en aşinalık var ve mevcut makale toplu kullanımı için ayrılmıştır. Diğer iki robot makale yazılmış ve ilgili görüntüleri eksiksizlik çıkarları buraya dahil edilmiştir zamanda MS &amp; FB Grubu gösteri vardı. Her üç robotlar çok aynı Mezofaz dağıtım sistemi, pozitif deplasmanlı cam şırınga 5,7 olduğu temel özelliğini kullanın. Onlar Çöktürücü teslimat ile ilgili en belirgin olarak farklıdır. Robotlar 1 ve 2 8 kuyu, bir anda bir kristalizasyon plaka üzerinde tek bir sütuna aynı anda çöktürücü başarabilenin. Buna karşılık, Robot 3 tek bir eylem tüm 96 Çöktürücü çözümler dağıtır. Robot 2 tek çöktürücü dağıtım ipuçları ile yalnızca bir araçtır. Özellikle uygulamaya bağlıdır farklı enstrümanlar ile ilişkili artılarını ve eksilerini vardır ve bu burada ayrıntılarıyla olmayacak. Her üç çalışma söylemek yeterlidir ve beni kristaller ürettimezo yöntem ile mbrane proteinleri. Makromoleküler kristalografisi tarafından yapı tayini genel sürecinde sonraki adımları hasat ve kriyo-serin kristalleri için bu videoyu makalede anlatıldığı gibi kurmak plakalar ve kayıt ve onlardan süreci X-ışını kırınımı için vardır. Bu konular bu serinin 1,15 ayrı vallahi makaleler kaplıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Bileşenleri </td></tr><tr><td> Brayer (rulo) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Gaz sızdırmaz şırınga </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Cam lamelleri </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Cam levhalar </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Sanat Robbins </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Mezo robot </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Çeşitli </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Sivrisinek LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Delikli çift sopa ayırıcı bant </td><td> Saunders Corporation (delik açılmış) </td><td> özelleştirilmiş </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Çöktürücü çözümleri </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Arıtılmış su </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Yağmur-X </td><td> Shell Oto Bakım </td><td> 80199200 </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Şırınga ipuçları </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (manometre 22) </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Dokular </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Su şişesi </td><td> çeşitli </td><td> NA </td><td> Reaktif </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

Membran proteinlerinin yapı-fonksiyon çalışmaları büyük ölçüde makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX) aracılığıyla sağlanır türü mevcut yüksek çözünürlüklü 3-D yapılar sahip yararlanacak. MX temel bir madde ideal kırınımı kaliteli kristaller sabit bir kaynağı olduğunu. Mezo ya da zar proteinleri kristalize edilmesine ilişkin bir lipidik kübik faz (LCP) yöntemi de membran proteinleri kristalizasyonuna yönelik çok sayıda yöntem biridir. Bu kristallerin büyümesi de bir bicontinuous mezofaz kullanır. Bir yöntem olarak, geç bazı muhteşem başarılar olmuştur ve şimdi kullanarak ilgilenen birçok araştırma grupları ile çok dikkat çekti. Yöntemi ile ilişkili sorunlardan biri barındırma Mezofaz kalın bir diş macunu andıran, son derece ağdalı ve yapışkan olmasıdır. Böylece, kristalizasyon kuyulara küçük hacimli bir tekrarlanabilir bir şekilde elle dağıtma beceri, sabır ve elinizi sabit tutmanız gerekir. Ju yapmak için bir protokolMembran Fonksiyonel ve Yapısal Biyoloji (MS &amp; FB) Grup 1-3 geliştirilmiştir st. Yöntemini açıklayan Jüpiter Video yazılar mevcuttur 1,4 bulunmaktadır. Mezo çalışmalarda kurmak için manuel bir yaklaşımla bu tür kristal optimizasyonu ve türevlendirme gibi özel uygulamalar ile belirgin avantajları vardır. Ancak düşük bir verim yöntemi olmaktan muzdarip yok. Burada, robotik mezo kristallendirme çalışmalarında gerçekleştirmek için bir protokol göstermektedir. Bir robot hız, doğruluk, kesinlik, minyatür ve indirgeyici bir ortamda ya da düşük veya yüksek sıcaklıklarda, örneğin karanlık gibi düşmanca koşullar olarak kabul edilebilir ne altında uzun süre sürekli çalışabilecek olmanın avantajlarını sunmaktadır. Doğru kullanıldığında mezo robot, bir ölçüde de yavaş adımlardan biridir kristalizasyon kolaylaştırarak membran protein yapısını verimlilik ve işlevi araştırma artırabilirgenel yapısının belirlenmesi boru hattı. Bu video yazıda, mezo crystallogenesis içinde ayrılmaz viskoz ve yapışkan Mezofaz başarabilenin üç piyasada mevcut robotların kullanımını göstermektedir. İlk robot MS &amp; FB Grubu 5,6 geliştirilmiştir. Diğer iki son zamanlarda kullanılabilir hale gelmiştir ve tamlığı için buraya dahildir. Bu makalede anlatılan protokol bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Bütün manipulasyonlar oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) koşullar altında yapıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases at JoVE.com

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K Görüntüleme.  Trinity College Dublin. Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Video: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biyoloji

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...