PMSCV YARDIM-I-Thy1.1 ve pKat2 vektörler DG Schatz ve pVSV-G, pRSV-Rev bir tür hediye ve pMDLg / pRRE vektörler BR Cullen bir tür hediye edildi.

1. Örnekleri ve hücrelerin hazırlanması <ol><li> DNA (midiprep) aşırı ekspresyonu veya shRNA içeren yapıları ve retroviral ambalaj vektör pKat2 veya lentiviral ambalaj vektörler pVSV-G, pMDLg / pRRE ve pRSV-Rev 25 orta ölçekli bir hazırlık gerçekleştirin . Her bir yapı için 6 mg DNA ve ya pKat2 pVSV-g, pMDLg / pRRE her 4 mg (retroviral enfeksiyonları için) veya 1.5 mg DNA ve pRSV-Rev ambalaj vektörler (lentiviral enfeksiyonlar için) kullanın. </li><li> Bosc 23 medya hazırlayın. Transfeksiyon için, düzelmeyen Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM) yanı sıra tam DMEM kullanın. Tam DMEM yapmak için, DMEM bir şişe% 1 Hepes tampon,% 1 penisilin-streptomisin-glutamin (PGS), ve% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS) ekleyin. </li><li> Ramos ortam hazırlayın. Enfeksiyon adım için,% 1 Hepes,% 1 PGS ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) RPMI bir şişe ekleyerek orta RPMI-1640 (RPMI) tamamlamak. Tek hücre tohumlama adım, m, 2 gün boyunca tam RPMI Ramos hücreler büyüyor, 4 dakika için 400 X g hücreleri down iplik ve steril bir şişeye filtresi 0.2 mikron ile süpernatantı filtreleme AKE &quot;klimalı&quot; medya. Diğer eksiksiz bir medya gibi, klimalı ortam gereklidir 4 ° C &#39;ye kadar saklanır. </li><li> , Hücrelerin% 50-60 gün Transfeksiyondan confluency olacağını gün önce transfeksiyon kadar 10 ml tam DMEM 100 mm plaka Bölünmüş 3 x 10 6 Bosc 23 hücreleri . Transfecting planı her bir vektör için hücrelerin bir tabak olun. Kültür hücreleri çok uzun süre tutuldu olması önemlidir; düşük geçiş sayısının hücre ya da son zamanlarda çözülmüş hücrelerin transfeksiyon ve iyi bir enfeksiyonu sigorta için enfeksiyon adımları kullanın. </li><li> Deneyler için kontroller içerir. Transfections ve enfeksiyonlar için, bir negatif kontrol (untransfected veya bulaşmamış hücreleri) ve pozitif kontrol (GFP ve puromycin direnç geninin ifade virüs) oluşturun. ShRNA knock-down exper içiniments, şifreli veya alakasız shRNA kontrolü ile iyi bozar. </li></ol> 2. Bosc 23 hücreleri Transfecting <ol><li> 37 düzelmeyen DMEM ve tam DMEM şişe Sıcak ° C </li><li> Bosc 23 hücrelerden ortamı çıkarın ve 5 ml tam DMEM ile değiştirin. Adım 2.6 &#39;da kullanıma kadar 37 ° C inkübatör hücrelerin dönün. </li><li> 5 dakika sonra kısaca vorteks (&lt;1 saniye), oda sıcaklığında FuGENE 6 şişe ısıtın. </li><li> 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe kısım 600 mcL düzelmeyen DMEM. </li><li> 600 mcL düzelmeyen DMEM, vorteks kısa bir süre (&lt;1 saniye) içine 30 mcL FuGENE 6 seyreltilir ve sonra beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Medya doğrudan pipetle dikkatli olun. FuGENE 6 tüp kenarlarına temas etmesine izin vermeyin. </li><li> DMEM / FuGENE 6 karışımı, girdap bri 6 mg inşa ve ya 4 mg pKat2 (retroviral enfeksiyonları) veya 1.5 mg pVSV-G, pMDLg / pRRE her, ve pRSV-Rev (lentiviral enfeksiyonlar) ekle<html> sonra efly (&lt;1 saniye) ve 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bosc 23 hücrelere DNA / 6 DMEM / FuGENE karışımı ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C inkübatör dönmek. </li><li> 24 saat sonra, 5 ml tam DMEM transfekte hücreler eklemek ve başka bir 24 saat süreyle 37 ° C inkübatör dönmek. </li></ol> 3. Viral parçacıkların Hasat <ol><li> 10 ml, 10 ml şırınga ile transfekte Bosc 23 hücreleri medya Hasat. </li><li> 0.45 mikron şırınga sonuna kadar filtre takın ve temiz bir 15 ml&#39;lik polipropilen tüpe medya filtre. </li><li> -80 Viral medya hemen kullanın veya 1 ml, 2 ml kriyojenik flakonlarda alikotları olarak dondurmak ° C </li><li> Viral medya hasat sonra, verimli transfeksiyon FACS pozitif kontrol hücrelerinde meydana geldiğini teyit etmektedir. Inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa Bu aynı zamanda tüm örnekler için yapılabilir. </li></ol>itle &quot;&gt; 4 Enfekte B hücreleri <ol><li> 6 plaka enfeksiyon 24 saat önce içine tam RPMI 2 x 10 5 hücre / ml Ramos hücreleri Tohum 2 ml. Yine, iyi enfeksiyon sigortalamak için düşük geçit sayısı hücreleri veya son çözülmüş hücreleri kullandığınızdan emin olun. </li><li> Virüsün dondurulmuş alikot kullanıyorsanız, 37 hızla viral medya Çözülme ° C </li><li> , 10 mg / ml polybrene 3 mcL 1 ml viral medya karıştırın. Polybrene son konsantrasyon 10 mg / mL, 3 mL hacimde olmalıdır. </li><li> Hücrelere pipetleme tarafından virüs / polybrene karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. 1 ml tam RPMI ve 3 mcL polybrene iyi yerine 1 mL virüs ekleyin; gibi daha önce, biri de bulaşmamış olduğu bir kontrol olarak kullanılan olmalıdır. Eşleştirilmiş bir negatif kontrol ile iyi bir bulaştırmak için emin olun. Ayrıca FACS enfeksiyonu etkinliğini belirlemek için, GFP içeren bir vektör ile iyi bir bulaştırmak. </li><li> 3000 X g de 90 dakika oda sıcaklığında 6 plaka santrifüjleyin. </li><li> Plaka dön.48 saat boyunca 37 ° C inkübatör. </li><li> 4 dakika oda sıcaklığında 48 saat sonra, 400 X g 15 ml polipropilen tüp içinde enfekte olan hücreleri aşağı doğru döndürün. Hücre pelletini rahatsız emin olmak, aspirasyon medya çıkarın. Taze RPMI hücrelerin tekrar </li><li> FACS pozitif kontrol örneği enfeksiyon verimliliğini onaylayın. Daha önce olduğu gibi, inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa tüm örnekler için yapabilirsiniz. </li><li> (Uygunsa) hücre seçimi başlayın. Bizim shRNA içeren yapıları bir puromycin direnç kaset içerir. Biz 0.25 mikrogram / mL puromycin ile shRNA enfekte Ramos hücreleri seçin. Biz Ramos hücreleri türevleri bazen puromycin duyarlılık değişmiş göstermek ve bu nedenle, biz her türevi puromycin konsantrasyonu optimize etmek için eğriler öldürmek gerçekleştirmek bulabilirsiniz. Ayrıca bu seçimin etkin olduğunu onaylamak için puromycin bulaşmamış kontrolü hücreleri tedavi. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Tek hücreli tohumlama Tek ekim iki yöntemden biri uygulanabilir: sıralama veya elle FACS. <ol><li> FACS: tohum, 1 hücreli bir tabak adaptörü ile kullanın / FACS sıralayıcı iyi bir 96 plaka% 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 100 mcL ile önceden doldurulmuş. Bu yöntem çok daha tek bir hücre klonlar plaka başına verir. </li><li> Elle: hücreleri sayın. % 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 10 hücre / ml &#39;ye bir kısım hücreler sulandırınız. Seyreltilmiş hücrelerin her numaralı seribaşı plaka için 10 ml kullanın. Farklı klonlar, bu nedenle birkaç plakaları farklı konsantrasyonlarda (3 ila 20 hücre / ml &#39;ye kadar) kurmak için yararlıdır, bu aşamada değişken kurtarma gösterecektir. Birden fazla hücre doğan klonların önlemek için daha az çıkıntılar) üreten birini kullanın. 100 mcL ile seyreltilmiş hücrelerinin tohum 96-iyi plakalar, çok kanallı pipet kullanın. </li><li> 2 hafta boyunca 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin. </li><li> Bireysel kuyular kontrol under hücrelerinin varlığı tohumlama bir gün sonra onaylamak için mikroskop. Tek hücreler doğru derinlikte odaklanma ihtiyacı nedeniyle bulmak zor olabilir. 96-plaka altındaki baskılı iyi sayılar üzerinde yoğunlaşırken yardımcı olacaktır. Hücreleri çoğu kuyu hücre beri FACS sıralayıcı numaralı seribaşı bulmak daha kolay. </li><li> 2 hafta sonra, büyüyen koloniler zor, alttan plakaları bakarak çıplak gözle görülebilir. Bunlar mikroskop altında görmek çok daha kolay. Kolonileri farklı kuyularda aynı kenarı boyunca büyümeye bir tabak iyi ve tipik koloniler kenarlarında büyümek eğilimindedir. Mark sağlam hücre büyümesi ile kuyu ve 1 ml RPMI 24 kuyucuğu hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör dönmek. </li><li> 1 x 10 1 - 5 x 10 6 hücre / ml hücreleri koruyun. 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreler eğirme ve gerektiği gibi medya kaldırarak medya değiştirin. 1 ml taze RPMI ile değiştirin. </li><li> Birkaç d sonrabüyüme AYS, 6 plaka hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör büyümeye devam. </li><li> 3 hafta sonra, klonlar IgM kaybı (aşağıda açıklandığı gibi) için analiz eder. </li><li> 2 hafta boyunca hücreler büyümeye devam eder ve daha sonra 5 haftalık bir zaman noktasında klonlar yeniden analiz. </li></ol> 6. Analizi: IgM kaybı (3 hafta ile 5 hafta) <ol><li> Kısım 5 x 10 5 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g hücreleri aşağı doğru döndürün. Lekesiz bir kontrol için shRNA-knock-down kontrol ve kuyu her hücrelerin yanı sıra bir numune kullanın. </li><li> 1 mL PBS hücrelerin yıkayın ve sonra oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g tekrar döndürebilirsiniz. </li><li> 50 mcL, PBS (lekesiz kontrolü) veya PBS içinde süspanse edin + PE-etiketli α-insan IgM antikoru seyreltme 01:20. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreleri aşağı spin. </li><li> C yıkayın400 X g PBS ve spin 4 dakika için 1 ml oda sıcaklığında her zaman iki kere arşın. </li><li> PBS 100 mcL supernatant ve tekrar süspansiyon haline getirin çıkarın. Yeniden süspanse boyanan hücreler FACS tüpüne aktarın. </li><li> FACS makine kullanarak hücrelerin analiz edin. </li><li> ShRNA çaldı aşağı hücreleri vs kontrolleri hücrelerin IgM yüzde karşılaştırın. Daha önce de belirtildiği gibi, gibi FACS tarafından ölçülen IgM kaybı Ramos hücreleri içinde SHM güvenilir bir yarı-nicel bir ölçüsüdür. </li></ol> 7. Analiz: kantitatif RT-PCR (5 hafta) knock-down onaylayın <ol><li> Kısım 3 x 10 6 Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün. </li><li> RNA hücre kısım hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre TRIzol kullanın. </li><li> RNA hazırlık cDNA hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre 2 mikrogram RNA ve Üstsimge II. </li><li> CDNA doğrulayıcı için kantitatif PCR gerçekleştirinm tak-down. Biz 10 mcL toplam reaksiyon hacmi bir normalleşme kontrolü ve SYBR FAST qPCR kiti gibi GAPDH kullanın. </li></ol> 8. Analiz: Genomik sıralama (5 hafta) <ol><li> Kısım 5 x 10 6 Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün. </li><li> Bu hücrelerden genomik DNA izole edin. Biz üretici tavsiyelerine göre Wizard SV genomik DNA saflaştırma kiti kullanın. </li><li> PCR, Ig V genleri 19 (Tablo 1) ve ilgi KAPA HiFi DNA polimeraz kullanarak herhangi bir diğer genler genomik DNA yükseltmek . Biz düşük hata oranları nedeniyle bu polimeraz kullanabilirsiniz, ancak herhangi bir yüksek sadakat PCR Polimeraz kabul edilebilir olmalıdır. </li><li> Jel QIAquick jel ekstraksiyon kiti kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri arındırmak. </li><li> Diğerleri yok iken bazı polimerazları, PCR ürünleri 3 &#39;uçları tek bir deoksiadenozin (A) kalıntı eklemek. Bu 3 &#39;A kuyrukları TOPO TA için gerekli olanklonlama adımı. KAPA HiFi polimeraz 3 &#39;A kuyrukları bırakmaz. A-tail, 72 ° C&#39;de 30 dakika süreyle 3 mcL 10x Taq reaksiyon tamponu, 1 mcL 10 mM dNTP ve 1 birim Taq polimeraz 25 mcL jel saflaştırılmış PCR ürünü kuluçka PCR ürünleri. </li><li> TOPO TA Klonlama kiti kullanılarak jel saflaştırılmış PCR ürünleri klonlama. Sağlanan E. TOPO reaksiyon ürünleri Dönüşümü coli DH5α-T1 R 100 mcg / ml ampisilin ve üretici tavsiyelerine göre 1.6 mg X-gal ile desteklenmiş içeren LB / Agar plakaları yetkili hücreleri ve plakası. </li><li> Sıralama için ayrı ayrı koloniler gönder. </li><li> Türleri ve mutasyonlar yerleri belirlemek için dizi analizi yapın. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar: Önce de belirttiğim gibi, biz, hem de GFP yanı sıra bir puromycin direnç geninin ifade pozitif kontrol viral vektör kullanın. Genellikle iki günde% 50-75 GFP + hücrelertransfeksiyon sonra. Enfeksiyonlarda, genellikle% 50-70 oranında hücreler enfeksiyon + iki gün sonra ancak seçim öncesi GFP bakın. Seçimi tamamlandıktan sonra, hücrelerin&gt;% 95 GFP +. Temsilcisi deneyler olarak, eksprese YARDIM veya Ramos hücrelerinde tamir faktörü aşağı vurma etkilerini göstermektedir. Özellikle, biz Bosc 23 hücre içine retroviral ambalaj vektör pKat2 birlikte Thy1.1 bir IRES sitesi ile bağlantılı YARDIM retroviral aşırı ekspresyonu vektör transfekte. Virüs içeren medya süzüldükten sonra Ramos hücreleri enfekte etmek için kullanılır oldu. Her iki vahşi tip (WT) ve YARDIM eksprese (AID hi) hücreleri tek hücre (Şekil 3 QRT-PCR (Şekil 2) ve IgM FACS tarafından kaybı için gen ekspresyonu için analiz edildi ve bu noktada, tohumlari ve 3 hafta boyunca yetişen .) FACS boyama için, hücreler PE-etiketli α-insan IgM antikoru yanı sıra 1:400 sulandırılmış FITC etiketli α-sıçan CD90/mouse seyreltilmiş hem de 1:20 ile inkübe edildi.CD90.1 (Thy1.1) antikoru. Ayrı bir deneyde, ya ilgisiz bir shRNA (kontrol) veya karşı shRNA SHM karşı korumak için beklenen bir hi-fi DNA tamir faktörü içeren lentiviruses Bosc 23 hücreleri yapıldı ve ardından YARDIM hi klon Ramos hücrelerinin içine bulaşmış. Yine, gen ekspresyonu (Şekil 4) ve IgM kaybı (Şekil 5) 3 hafta sonra, tek bir hücre klonlar olarak incelendi. Tamir faktörü SHM sırasında mutasyonlar karşı koruma sağlamak için düşünülen bu yana, biz faktör yokluğunda IgM kaybı ve SHM bir artış görüyoruz. Biz nakavt, SHM ile ilişkili mutasyonlar üreten ilgili bir faktör olsaydı, bunun yerine IgM kaybı bir azalma gördük. Beklendiği gibi, Mah-PCR sonuçları, YARDIM ifade aşağıdaki YARDIM aşırı ekspresyonu vektörü (Şekil 2) ile hücrelerin enfeksiyonu belirgin bir artış göstermektedir, bu faktör karşı hedef shRNA varlığında DNA tamir faktörü damla düzeyleri (Şekil 4 .) Çünkü bireysel clonees değişebilir, gen ekspresyon düzeylerinde bazı değişiklikler görebilirsiniz. Gen ekspresyonu değişebilir, çünkü daha fazla analiz planı her klon ifade onaylamak için gereklidir. Aynı gen karşı farklı shRNAs yanı sıra, bu nedenle en büyük etkiye sahip olduğunu belirlemek için çeşitli shRNAs ekranı olmalıdır gen ekspresyonu üzerinde farklı etkileri olabilir. Demonte de immün protein düzeyinde teyit edilebilir. Benzer şekilde, bireysel klonlar IgM kaybı seviyeleri büyük ölçüde değişebilir. Bazı klonlar bir IgM mutasyon erken hücre bölünmeleri birinde meydana gelen bir &quot;jackpot&quot; etkisi göstermektedir - örneğin, hücrelerin IgM oldu çünkü&gt;% 50 IgM kaybı göreceksiniz - İki hücre aşamasında . Birkaç tek hücre klonları için medyan hesaplanırken bu klonların etkisi en aza indirilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg" /> Şekil 1 şematik için transIgM kaybı infeksiyonu, enfeksiyon ve analizi. Ayrıntılar için metne bakınız. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg" /> Şekil 2 Ramos hücreleri YARDIM aşırı ekspresyonu. WT ve YARDIM hi Ramos hücreleri bireysel klonlar noktası YARDIM ifade QRT-PCR ile ölçüldü klonlanmış ve 3 hafta boyunca yetişen, tek bir hücre. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg" /> WT hücrelere kıyasla Şekil 3 YARDIM hi hücrelerin IgM kaybı Artan. Yüzey IgM 3 haftalık bir zaman noktasında FACS tarafından ölçüldü ve IgM kaybı yüzde WT ve YARDIM hi hücreleri için hesaplanmıştır. (A) WT klon ve YARDIM hi klon Temsilcisi FACS arsa. YARDIM aşırı ekspresyonu vEctor YARDIM IRES sitesi üzerinden Thy1.1 ile bağlantılı, bu yüzden ifade Thy1.1 YARDIM ifade için bir vekil olarak kullanılır vardır. (B) IgM kaybı birkaç WT ve YARDIM hi klonlar kantitasyonu. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg" /> Şekil 4 YARDIM hi hücreleri tamir faktörü demonte. Hücreler ya da ilgisiz bir shRNA kontrolü (kontrol) veya ilgi shRNA (shRNA) ve tek bir hücre numaralı seribaşı ile infekte edildi. 3 hafta sonra, bireysel klonlar gen ekspresyonu QRT-PCR ile ölçüldü. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg" /> Şekil 5. Artan IgM kaybıYARDIM hi bir onarım faktör-devrildi seviyeleri ile hücreleri. 3 haftalık bir zaman noktasında FACS çeşitli klonlar Yüzey IgM ölçüldü ve hücreleri hala eksprese YARDIM IgM kaybı yüzdesi hesaplanır. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Tablo 1" /> Ig genleri 19 Tablo 1. Primer dizileri sürekli bölge Cμ, ağır zincir V bölgesi (V H), ve hafif zincir V bölgesi (V L).

<ol>
	<li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation.">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li><li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+somatic+hypermutation.">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li><li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li><li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice.">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li><li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li><li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein.">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li><li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting.">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li><li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice.">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li><li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A/T+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse.">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li><li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A:T+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation.">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li><li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53.">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li><li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells.">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li><li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice.">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li><li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality,+abnormal+embryonic+development,+and+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li><li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5.">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li><li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination.">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li><li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates.">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li><li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions.">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li><li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line.">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li><li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines.">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li><li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes.">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li><li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position.">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt's+lymphoma+cell+line.">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li><li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a:T+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location.">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Daha önce tartışıldığı üzere, antikor çeşitlendirilmesi için hücre hattı modelleri, antikor çeşitlendirilmesi sırasında farklı adımlar etkiler roman proteinleri tespit etmek için popüler bir başlangıç ​​noktası haline gelmiştir. Biz burada, Ramos, B-hücre hattı viral enfeksiyon ya knock-aşağı veya eksprese proteinlerine kullanmak için bir yöntem mevcut ve sonra SHM üzerindeki etkisini incelemek. Bu çalışmalar için, biz WT Ramos ve YARDIM hi Ramos hücreleri kullanır. YARDIM hi hücreleri YARDIM ifade etkileyen faktörler hariç WT hücreleri hedefleme ya da YARDIM oluşturulan lezyonların tamiri YARDIM ifade yanı sıra yer alan faktörleri incelemek için kullanılabilir. SHM başlangıçta IgM + hücreleri bir nüfusa IgM kaybı için assaying burada ölçülür, bu da dikkate alınmalıdır. Alternatif olarak, IgM ile başlamak mümkündür. Hücreleri ve reversion tayininde IgM + hücreler bir kazanç için 23 bakmak &lt;/ P&gt; Farklı seçim belirteçleri (örneğin puromycin, hygromycin, GFP veya Thy1.1) kullanarak, biz de aynı protokol ile aynı anda birden fazla enfeksiyonların gerçekleştirebilirsiniz. Ancak, biz bulduk, iki farklı antibiyotik seçimi belirteçleri, hücrelerin değişim hassasiyetleri kullanırken. Aynı anda iki antibiyotik seçimi için koşulları optimize etmek için ek öldürmek eğrileri gerçekleştirmek için gerekli olacaktır. Biz iki farklı faktörler ya da başka bir faktör artı bir aşırı ekspresyonu, vb bir knock-down çift knock-çıkışlar kolaylıkla üretebilirsiniz Biz aynı zamanda B-hücre-line modeller için bu protokol adapte var. Örneğin CH12F3-2 hücreleri (KSS incelemek için kullanılan bir fare B-hücre hattı) 26,27, aynı enfeksiyon adımları, enfeksiyon gününde seribaşı 1 x 10 6 CH12F3-2 hücreleri (varyasyon bulaştırmak için kullanılır . adım 4.1). Bu hücreler puromycin 1 mcg / ml ile seçilir. Benzer şekilde, aynı protokolü deYARDIM başlatılan gen dönüşüm için bir hücre hattı modeli - tavuk DT40 hücreler için kullanılabilir.

Önerilen reaktifler bunların çoğu diğer satıcılardan benzer ürünleri ile değiştirilebilir. <table border="1" ><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th > Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td > 6-net TC ile tedavi edilen levhalar </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ml BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Tıp </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-iyi net TC-tedavi plakalar </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > TC-96-net bir düz dipli polistiren tedavi mikropleytin </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-tedavi kültür kaplarına </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Acrodisc şırınga filtreler, 0.45 mikron </td><td > Pall Yaşam Bilimleri </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agaroz </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampisilin </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / ml suda </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II akış sitometresinde </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > ya da benzer </td></tr><tr><td> BD Falcon yuvarlak alt polistiren tüpler </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > FACS için </td></tr><tr><td > Bosc 23 hücreleri </td><td > ATCC </td><td > CRL 11270 </td><td ></td></tr><tr><td > 37 yeteneğine sahip CO 2 inkübatör ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco modifiye Eagle orta) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (fetal sığır serumu) </td><td > İkizler Bio-Ürünler </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antikor </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCa-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES tamponu çözümü </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi DNA polimeraz </td><td > KAPA Biyosistem </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB Broth (lysogeny suyu - Luria) Pudra </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MİSYON TRC shRNA bakteriyel gliserol stoku </td><td > Sigma </td><td ></td><td> shRNA vektörler </td></tr><tr><td > NCS (yeni doğmuş buzağı serumu) </td><td > İkizler Bio-Ürünler </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (fosfat tampon çözelti) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > 1x su içinde seyreltilir </td></tr><tr><td > PE α-insan IgM antikoru </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penisilin-streptomisin-glutamin çözüm) </td><td > İkizler Bio-PÜ r ü nler </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine bromür) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > Suda 10 mg / ml </td></tr><tr><td > PureYield Plazmid Midiprep Sistemi </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 mg / ml suda </td></tr><tr><td > QIAquick jel ekstraksiyon kiti </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) hücreleri </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 ortamı </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > Üst Simge II. </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR kiti </td><td > KAPA Biyosistem </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA Polimeraz </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Klonlama kiti </td><td > İnvitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Sihirbazı SV Genomik DNA arıtma sistemi </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > DMSO 40 mg / ml </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

V (D) J rekombinasyon tarafından oluşturulan düşük afinite antikorları B hücreleri ile onların yaşam başlar. Ancak, bir patojen tespit üzerine, immünglobulin (Ig) geninin değişken (V) bölgesinde yüksek afiniteli antikorlar 1,2, yaklaşık 100.000 kat daha fazla somatik hipermutasyon (SHM) ile genomun geri kalanından daha mutasyona uğramış olan. Buna ek olarak, sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS), belirli bir patojen için gerekli olan immün yanıtın türüne bağlı olarak farklı efektör fonksiyonları ile antikor üretir. Hem KSS ve SHM uracils üretmek için DNA&#39;da sitozin kalıntılarının deaminates aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID), tarafından başlatılan. Bu uracils sonuçta, mutasyon ve 1-3 rekombinasyon, tamir yollarının hata eğilimli formları tarafından işlenir . SHM ve CSR moleküler ayrıntıları mevcut anlayış farelerde çalışmaların bir kombinasyonu gelen, birincil hücreler, hücre hatları ve hücre-free deneyler. Fare modelleri birçok onarım faktörler (örneğin UNG, Msh2, Msh6, Exo1 ve polimeraz η) 4-10 için kritik roller gösteren genetik tırnakları ile altın standart olmaya devam etmektedir. Ancak, bütün genleri nakavt çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Örneğin, birkaç çift iplikli sonu onarım proteinleri tırnakları embryonically ölümcül veya B-hücre gelişimi 11-14 bozar. Ayrıca, bazen SHM veya KSS bir proteinin belirli bir işlevi nakavt neden daha fazla küresel hasar maskelenmiş olabilir. Buna ek olarak, farelerde deneyler bu yana aday genler 15-18 tanımlanması ve karakterize hücre hatları tek tek genlerin ifadesi giderek daha popüler bir ilk adım haline gelmiştir değiştirerek, uzun süreli olabilir . Ramos - yapısal SHM uğrar Burkitt lenfoma hücre hattı - SHM 18-24 incelemek için popüler bir hücre-line model olmuştur. Ramos hücrelerinin bir avantajı yerleşik rahat yarı olmasıSHM, nicel bir ölçüsüdür. Vahşi tip hücreleri mutasyonlar, bazı mutasyonların IgM ifade knock out pick up, IgM ifade ve. Bu nedenle, floresan ile aktive olan hücre tarama (FACS) IgM kaybı assaying SHM düzeyi için hızlı okuma sağlar. SHM daha nicel ölçümü doğrudan antikor genleri sıralama elde edilebilir. Ramos hücreleri transfect zor olduğundan, biz istikrarlı ve türevleri üretmek, sırasıyla aşırı ekspresyonu kaset ya da kısa bir saç tokası RNA (shRNA), ya içeren retroviral veya lentiviral yapıları hücrelerini enfekte artış ya da bireysel bir gen ifade düşürdü. Burada, biz Ramos hücreleri enfekte ve sonra SHM (Şekil 1) belirli genlerin rolünü araştırmak için bu hücrelerin nasıl kullandıklarını açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes at JoVE.com

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği tarif

Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K Görüntüleme.  Duke University. Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği tarif

Video: Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

Hücresel stres ve ayrık oksitosin salgılayan beyin çekirdekleri içinde yenidoğan sıçan iltihabı önce ve sonra ilk kolostrum besleme değerlendirilmesi

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...