Biz bizim ortak teşekkür ederim, Stephen Jones, Nia Charrington, Dr. Dianna Maar ve Doktor Samantha Cooper onların tahlil tasarım dijital Biyoloji Merkezi'nden (Bio-Rad Inc CA) desteği; Nezar Rghei ve Dr. Moemen Abdalla (Norgen Biotek, Kanada) RNA ayıklama protokolü en iyileştirirken kritik tavsiye için; ve test gereksinimleri ve ticari izleme Shannon Campbell, Scott Thurston, Jeff Fensterer, Shannon Martello ve Joellyn Enos konusunda yardım almak için.

Üreticilerin yönergeleri için aşağıda listelenen reaktifler aksi belirtilmedikçe sürece takip edilmektedir. PCR deneyleri piyasada bulunan ürünler ROS1 ve RET füzyon algılamak için tasarlanmış bulunmaktadır.
1. çalışma ile ters transkripsiyon (RT) için hazırlık RNA-dPCR: Laboratuvar en iyi yöntemler
<ol><li>RNA ile çalışırken RNase içermeyen bir ortam oluşturun.<ol>
<li>Piyasada bulunan spreyler bulaşıcı RNases devre dışı bırakabilirsiniz için tasarlanmış kullanın.</li>
		<li>Kullanım RNase free reaktifler, ipuçları ve tüpler sertifikalı. RNases getirilmesi veya çapraz bulaşma örneklerinin önlemek için bariyer ipuçları için pipettors kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her zaman tanecikleri örneğinizi giydirilmiş düşmesini önlemek için bir laboratuvar önlüğü giyiyorsun. RNA işlenmesi ile kullanmak için bir laboratuvar kat özel belirleyin.</li>
	<li>RNases örnek kirlenme cilt önlemek için eldiven giymek. Eldiven sık sık değiştirin. Not: Ortama maruz kalır bu yana laboratuvar yüzeyler RNase ile kontamine varsayıyorum. Cilt, saç, kapı tokmakları, dondurucu kolları, kalemler/işaretleri, vb temas eldivenler artık RNase free olarak kabul edilir.</li>
	<li>Pipettors, benchtops, santrifüj ve diğer çalışma yüzeyleri kullanın RNase inactivation sprey önce bir ile dezenfekte etmek.</li>
	<li>Mümkünse, ekipman sadece RNA kullanılmak üzere bir dizi korumak.</li>
	<li>Laboratuvar alanlarda hava akımı kesintiye uğraması örnekleri düşen veya çalışma alanının kirletici partiküller önlemek için RNA örnekleri ile çalışırken en aza indirmek.</li>
	<li>Mağaza RNA-80 ˚C saf.</li>
	<li>Bu bozulma neden olabilir RNA örneklerinin birden çok donma thaws önlemek.</li>
</ol>2. nesil olumlu denetimleri için analitik RNA malzeme
<ol><li>Sentetik DNA faiz10füzyon türevleri için yayımlanmış mRNA dizileri kullanarak tasarlayın.<ol>
<li>Verilen füzyon varyant için fusion sitesinde artı yeterli uzunlukta PCR amplicon karşılamak için her iki tarafta kanat içerir bir mRNA füzyon serisi seçin.</li>
		<li>Nükleotit dizileri arasında 50-250 nt trombosit zenginleştirilmiş plazma ile yakalanan RNA dolaşan boyutta taklit etmek için seçin.</li>
		<li>T7 organizatörü sıra Ekle (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') 5' uç hedef sırasının için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çift telli deoksiribonükleik asit (DNA) parçaları da sentetik dizileri sipariş.</li>
	<li>Tris-EDTA (TE) arabelleği 10 ng/µL son bir konsantrasyon için sentetik DNA sulandırmak.</li>
	<li>60 ng sentetik DNA RNA vitro transkripsiyon kullanarak dönüştürmek.</li>
	<li>Fenol/guanidin tabanlı reaktif12kullanarak RNA transkript arındırmak.<ol>
<li>Dnaz dahil ben RNase kalan şablon DNA kaldırmak için ücretsiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arıtılmış vitro RNA özel boyalar ve standartları ile piyasada bulunan bir yer kullanma RNA konsantrasyon ölçmek. RNA için seçilen standartlar kabul edilebilir aralık içinde olduğundan emin olun. Seyreltme gerekli olabilir.</li>
	<li>Başarılı transkripsiyonu RNA jel leke ve yüksek aralığı 50-250 nt boyutu aralığı da dahil olmak üzere RNA merdiven ile karıştırılarak % 2 özel jel kullanarak Jel Elektroforez ile onaylayın.<ol>
<li>Her vitro RNA bir jel üzerine yük 500 ng.</li>
		<li>Jel 5 V/cm çalıştırın.</li>
		<li>Tek grup aydınlatma kullanarak görselleştirmek ve sonuçları belge.</li>
		<li>Her biri (Adım 2.1.2 tasarımında temel) füzyon türevleri için beklenen transkript boyutunu doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her vitro RNA RT-dPCR eşleşen değişken özgü PCR tahlil kullanarak tarafından algılanmasını onaylamak (bkz: adım 5-8 Bu protokol).</li>
	<li>İsteğe bağlı: vitro RNA her füzyon türevleri ve denetim gen GUSB içeren bir ekimolar karışım hazırlayın.</li>
	<li>Adım 2,9 gerçekleştirilirse: algılama her varyant özgü PCR deneyleri (bkz: adım 5-8 Bu protokol) kullanarak dPCR tarafından kontrol karışımı dahil füzyon versiyonlarının onaylayın.</li>
	<li>İstenen giriş konsantrasyonu analitik olumlu denetimler için 0,25 2.5 fg10' a kadar konsantrasyonları sınayarak belirlemek. İstenen kopya numarası çıktısı üzerinde dayalı konsantrasyon seçin.</li>
	<li>Onay 10 µL tek kullanımlık aliquots analitik RNA'ın olumlu denetim (Adım 4.4) ve-80 ˚C dükkanında kullanmak için hazır olun.</li>
</ol>3. donör numuneler
<ol><li>RNA boş hücre koruyucu madde içeren 10 mL insan tam kan örnekleri 10 mL kan toplama tüpler (BCT) toplamak. Not: Tüm insan bağış kullanım araştırma için izin ve donör özgü tanıtıcı bilgi toplanan veya sınama sırasında kullandığı.</li>
	<li>Tam kan örnekleri BCT üreticisi tarafından belirtilen süre içinde işlem.</li>
	<li>Havuza alınan normal insan plazma analitik olumlu denetim içinde kullanılmak üzere ticari bir kaynaktan satın alınabilir. Tek kullanımlık, 1 mL aliquots havuza alınan normal insan plazma ve-80 ˚C mağazasında olumlu denetim (Adım 4.4) ile kullanmak için hazır olun.</li>
</ol>4. kurtarma RNA plazma üzerinden dolaşan
Not: Bu yordam sırasında hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir.
<ol><li>200 x g 20 dk için de tam kan tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>İlâ 4 mL plazma serolojik pipet kullanarak centrifuged kan toplama tüpünden toplamak. Rahatsız ya da buffy kat tabaka Aspire edin değil dikkatli olun.</li>
	<li>Dolaşımdaki RNA exosomes, trombosit ve boş hücre RNA plazma üzerinden yakalayabilir piyasada bulunan bir seti kullanarak yalıtmak. Her toplu iş iş yanında olumlu denetim örnekten RNA yalıtmak.</li>
	<li>
Pozitif kontrol klinik örnekleri her toplu işlem için aşağıdaki şekilde hazırlayın:
	<ol>
<li>1 havuzlu mL normal insan plazma aliquot (Adım 3.3) çözülme.</li>
		<li>10 µL analitik RNA aliquot (Adım 2.12) çözülme.</li>
		<li>Pozitif kontrol etanol lysate plazma eklendikten sonra 10 µL analitik RNA normal insan plazma örnek ekleyerek hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri 100 µL nükleaz ücretsiz su ile elute. Hemen RNA ile temizlemek devam ve konsantrasyon.<ol>
<li>Örnekleri ıslak buz üzerinde depolanabilir ve kapalı, bir saat kadar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sütun tabanlı yöntemi kullanma RNA konsantre ve su RNase free 9 µL içinde elute.<ol>
<li>Derhal adım 5'e gidin veya örnekleri ıslak buz üzerinde bir saat kadar tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cDNA için RNA'ın ters transkripsiyon
<ol><li>Konsantre dolaşımdaki RNA örnek cDNA rasgele astar (bkz. Tablo 1 için bileşenleri) gibi bir ticari olarak mevcut ters transkripsiyon tepki kit kullanarak dönüştürmek. Not: Gene belirli astar isteğe bağlıdır ve test türevleri için tasarlanabilir. Astar dayalı hedef RNA dizisi olarak tasarlanmıştır. Füzyon varyant sıraları kimden adım 2.1 kullanmak.<ol>
<li>Ters transkriptaz denetim örnek yok ve hiçbir RNA denetimi örneğini içerir (bkz. Tablo 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>CDNA piyasada bulunan bir DNA yoğunlaştırıcı spin sütun kullanarak ters transkripsiyon reaksiyon gelen izole et. Not: Bu adımı enzimler, astar ve ücretsiz deoxynucleotide trifosfatlardan (dNTPs) kaldırılmasını kolaylaştırır.</li>
	<li>CDNA hemen PCR reaksiyonları kullanın veya-80 ˚C saklayabilirsiniz.</li>
</ol>6. dijital PCR
Not: Bu PCR için damlacık belirli dijital PCR (bkz: Malzemeler tablo).
<ol><li>
PCR karışımı önlemler.
	<ol>
<li>Tek kullanımlık laboratuvar mont ve nitril eldiven giymek.</li>
		<li>Kullanım PCR reaktifler bir adanmış reaktif hazırlık alanda karıştırın. CDNA salt reaktif hazırlık alanında işleyemez.</li>
		<li>Sonda gelen ışık onları korumaya çalışırken kapsar. Aşırı ışık fotoğraf için sonda bağlı floresan boya çamaşır suyu.</li>
		<li>Kaplı karışımları, taşıma ve ışıktan, cDNA önce ayrı bir ön amplifikasyon alana eklenecek korumalıdır.</li>
		<li>Test edilecek cDNA ekle öncesi güçlendirme alanında bulunan PCR karışımı bir PCR temiz Hood.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR karışımları Tablo 2göre 20 µL son tepki hacmi için hazır olun.</li>
	<li>Dağıtmak PCR karışımları + cDNA PCR plakaları için. Not: Olarak bir rehber tavsiye bir plaka düzenini kullanın.</li>
	<li>Bir çıkarılabilir plaka mühürleyen kullanarak plaka kapak.</li>
	<li>Kısaca kuyu dibinde örnekleri toplamak için tabak santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>10 için düşük bir ayara üzerinde plaka shaker Mix s.</li>
	<li>Kısaca Kuyunun dibinde örnek toplamak için tabak santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Plaka mühürleyen kaldırın. Damlacık üretimi PCR-cDNA karışımı ile ikisinden biri için el ile veya otomatik damlacık üretimi sistemi uygulayın.<ol>
<li>Manuel damlacık üretimi için 20 µL PCR karışımı örnek wells için damlacık üretimi çıkarma, aktarın. Damlacık üretimi Petrol 70 µL ekleyin. Kauçuk conta ve transfer kartuş damlacık üretimi başlatmak için el ile damlacık jeneratör için kapak. Damlacık üretimi, üretici tarafından önerilen ipuçlarını kullanarak bir taze PCR plaka damlacıkları aktarın. Aspire edin ve damlacıkları yavaş yavaş, 5'e 6 üzerinden dağıtmak s her ucuna kadar damlacık kartuş veya plaka açılışı dokunmadan.</li>
		<li>Otomatik damlacık üretimi için bir folyo mühür ve damlacık jeneratör transfer ile plaka mühür. Tüm ipuçları, kartuşları, emin olun ve plakaları damlacık üretimi başlamadan önce yerdesiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki damlacık üretimi ve damlacıkları aktarmak taze PCR plaka mühür bir folyo plaka mühürleyen ve Tablo 3' te ayarlarla termal döngüsü plakaları ile.</li>
	<li>Termal cycler sonra Çalıştır bir damlacık okuyucu kullanarak plaka okuma tamamlanmıştır. Denetimleri, örnekleri, vb, konumunu tanımlar okuyucu bilgisayar yazılımı için bir plaka düzen oluşturmak ve okumak başlatmak için yazılımı içine yük.</li>
</ol>7. veri analizi ve inceleme ve sonuçları nesil
<ol><li>Piyasada bulunan yazılım kullanarak sonuçları okumak plaka analiz.</li>
	<li>İki boyutlu (2D) genlik araziler görüntülemek için analiz menüsüne yönlendirir.</li>
	<li>Damlacık veri inceleyerek verileri genel kalitesini değerlendirmek.<ol>
<li>Olaylar menüsünü kullanarak toplam kabul edilen olay numaraları için verileri değerlendirmek. İyi ücret daha az 10,000 olayları ise ek sorunlar için veri dikkatle değerlendirin.</li>
		<li>Anormal Floresans genlikleri verilerini denetleme. Önemli genlik farklılıkları ve konsantrasyon Çoğalt örnekleri arasındaki farklar zavallı işleme veya örnekleri karıştırma gösteriyor.</li>
		<li>Sprey desenleri ile damlacık kümelerde kalitesiz damlacıkları ya da sorunlu örnekleri göstergesidir bir 45 derecelik eksen notlar.</li>
		<li>Pozitif kontrolü, hayır ters transkriptaz (Hayır RT) ve Hayır RNA denetim (NRK) veri önce denetleyin. Tüm kontrol örnekleri seçin ve küme kalite 2D çizim tarafından inceleyin. Uygun eşik için damlacık kümeleri arasında net bir ayrım belirgin olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her tahlil varyant için denetim wells göre eşik ayarlayın.<ol>
<li>Eğer çift negatif damlacık nüfus kontrolü gen nüfus (5'-hexachloro-floresein-CE phosphoramidite sonda ile etiketli olan), y ekseni ve varyant gen nüfus, ayırt etmek ince artı aracını kullanarak 2D araziler üzerinde küme eşikleri mevcut) floresein amidite ile OR 6-carboxyfluorescein sonda etiketli olan), x ekseni.</li>
		<li>Toplam Çoğalt her şey tek bir örnek için kopyalar.</li>
		<li>Test sonuçlarını varyant kopya tespit olarak hızlı. Not: Olumlu ya da olumsuz bir örnek, aradığınız için analitik kesme biçimi değerini belirlemek çalıştırmak için normal bir sağlıklı donör örnek (en az 10 bireysel örnekleri) kesinleşmiş sürecinde ayarla ve kesim herhangi bir tespit arka plan sinyal mutasyon için yukarıda kurmak faiz. Ayrıca, bir pozitif veya negatif sonuç aramak için gerekli denetim Gen kopya sayısını kurmak. Bu denetim gen kesme bir iç kalite kontrol (QC) miktar ve işlenen her RNA örnek kalitesini değerlendirmek için işlev görür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. hücre hatları (isteğe bağlı) kullanarak RT-dPCR reaksiyon koşulları doğrulanması
<ol><li>Füzyon türevlerini algılama doğrulamak için piyasada bulunan hücre hatları ROS1 veya RET füzyon ifade kullanın mRNA ilgi. Şu adımları izleyin:<ol>
<li>Flaş donmuş hücrelerinde lizis guanidinium tabanlı dondurulmuş devlet doğrudan çözümden lunaparkçı. Hatta kısa homojenizasyon önce çözdürme RNA bozulması ve kaybına neden olabilir.</li>
		<li>RNA için tasarlanmış silis-membran spin sütunları kullanarak RNA yalıtmak.</li>
		<li>Bir yer standartları ve RNA özgü reaktifler kullanarak RNA örnekleri konsantrasyonu ölçmek.</li>
		<li>Yalıtılmış RNA içine bir arka plan vahşi tipi RNA plazma veya başka bir ticari kaynak oranında seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CDNA, dijital PCR ve veri analizi ve bir daha gözden geçirme, transkripsiyonu RNA ters gelen adımları gerçekleştirmek ve sonuçları üretimi tespiti istenen değişken onaylamak için bu protokol için listelenen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA:+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility.">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li><li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy.">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li><li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Molecular+AP+testing+in+sync+with+guidelines.">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li><li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer.">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li><li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer.">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA.">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li><li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer,+Multiclass,+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics.">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+exosome+cargo+from+plasma/bronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer.">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma.">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li><li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage.">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380 (2013).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li><li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+ALK-RET,+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer.">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li><li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS1+and+ALK+fusions+in+lung+cancer.">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li><li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer:+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion.">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li><li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma:+a+clinicopathological+and+molecular+analysis.">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li><li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COSMIC:+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution.">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li><li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer:+an+integrated+medicine+approach.">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li><li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer.">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+(AZD9291)+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li><li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma.">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li><li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial.">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+ctDNA+analysis+depicts+early-stage+lung+cancer+evolution.">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA,+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples.">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li></ol>

H.M., LJ, K.A. ve Gap çalışanları olan ve hisse tutun Biodesix, Inc H.M., LJ ve Gap Biodesix, küçük hücreli dışı genetik varyantların dolaşan algılama için bir tanı testi sistemi kapsayan tarafından yayımlandı bir patent başvurusu üzerine yardımcı mucitler vardır akciğer kanseri.

RET ve ROS1 düzenlemeler ~ %3 NSCLC nüfus18içinde sürücü mutasyonların oluşturan. Nadir olmasına rağmen bu genetik değişiklikler tespiti hayati önem taşımaktadır. NSCLC hastalar bu değişiklikleri ile özellikle onko-protein13sonuçlar anormal kinaz aktivitesi inhibe hedefli tedavi yararlanabilirler. Diğer klinik çalışmalarda19' RET karşı etkili olmak göstermiştir iken bazı böyle terapiler zaten ROS1 olumlu NSCLC, olarak kullanılmak üzere FDA tarafından onaylanır.
Dijital PCR teknoloji sıvı biyopsisi uygulamalar20için idealdir hassasiyet sağlar. Bu teknolojiyi kullanmak için önemli kabulü olmuştur boş hücre DNA NSCLC4,6,21,22,23 olan hastalarda tümör mutasyonların ölçüm için dolaşan ile . CfDNA ek olarak, biz tümör RNA (şekil 1A)10dolaşan NSCLC olan hastalarda en yaygın füzyon versiyonlarının sağlam ölçüm için tasarlanmış bir iletişim kuralı geliştirilmiştir.
Bizim oluşturulmuş protokol algılama aşağı %0,2 (Şekil 2) analitik sınırları için izin verir. RT-dPCR son derece özel ve hassas olmakla birlikte, deneyleri panelindeki seçilen ve algılama PCR tahlil için multiplexed bilinen füzyon türevleri sınırlı olmalıdır. Böylece, çoğaltılmış deneyleri dahil edilecek füzyon NSCLC hastalar nüfusu içinde uygun kapsama sağlamak için dikkatle seçilmelidir. Başarıyla RET ve ROS1 için aynı anda sekiz füzyon türevleri sonuç RET veya ROS1 loci düzenlemeler dan algılayan ve sırasıyla % 99 ve RET ve ROS1 olumlu nüfusun % 88'i kapak deneyleri tasarladık (şekil 1B-C )17.
Bu çalışmada açıklandığı gibi son test iş akışı sonuçların tutarlılığı sağlamak için toplu denetimler de içerir. Bu denetimler hem olumlu bir analitik standart, hem de birlikte herhangi bir kirlenme veya toplu (şekil 3) içinde meydana gelen PCR inhibisyon sağlamak iki negatif denetimleri bulunur. Sağlamlık testin emin olmak için bir çalışma (şekil 3D, H) 21 günlük süre içinde toplu denetimlerini kullanarak gerçekleştirildi. Bu veriler bu protokolde belirlenen RNA işlem tutarlılık göstermektedir.
İyi laboratuvar uygulamaları ve uygun RNA işleme sağlam ve doğru sonuçlar sağlamak önemli bileşenleridir. Laboratuvar alanı ve donanımları özel ekipman her kullanımdan sonra temizlik, sarf malzemeleri ve RNase free reaktifler kullanarak ve bir RNase inactivation sprey tüm bulaşıcı RNases azaltmaya yardımcı çalışma alanı uygulayarak RNA ile kullanmak için. Vicdani RNA örnekleri teknisyenleri, özel laboratuvar önlüğü, dahil olmak üzere tarafından işlenmesi sık eldiven değişiklikleri hızlı bir şekilde RNA çıkarma yordamı ile çalışma, ve buz üzerinde koruma örnekleri örnek bütünlüğünü korumak için son derece önemlidir vardır. RNA transkripsiyonu cDNA için ters edildikten sonra yıkımı için daha az eğilimli daha istikrarlı bir form örneğidir. RNA bütünlüğü destekleyen uygulamalar ek olarak, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir çapraz kontaminasyonu önlemek için ayrılmış alanlarda PCR bileşenleri ve örnekleri sağlanmalıdır. PCR ana karışımları hazırlanması ve hisse senedi PCR reaktifler PCR şablonlardan ayrı tutulmalıdır ve büyük güçlendirilmiş şablonu (post-PCR) ayırmak için reaktifler, RNA ve cDNA örnekleri de dahil olmak üzere tüm önceden güçlendirilmiş malzemelerden özen gösterilmelidir. Son olarak, uygun üretimi ve işleme emülsifiye PCR karışımları amplifikasyon önce damlacık bütünlüğü ve en iyi dPCR koşulları korumak açısından Merkezi. Bu gibi önlemler tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için bu iletişim kurallarını yürütülmesi sırasında kritik öneme sahiptir. Tüm veri sonuçları sürümünden önce eğitimli personel tarafından emin olmak için tüm QC ölçümleri karşılandığından emin incelenmesi gerekir. Suboptimal sonuçlar (şekil 4), söz konusu olduğunda toplu iş teknik personel ve laboratuvar müdürü tarafından gözden geçirilmesi ve yeniden işleme gerektirebilir.
RT-dPCR sonuçları erken örnek alındı ve örnek sonuçlarını bu çalışmada kullanılan ayarla test içinde % 95'i 24 saat olarak üretilen (n = 984) sipariş hekim 72 saatten az zaman giriş (şekil 5) rapor edilmiştir. Bu teslimi etrafında zaman Doktorlar çok sağlar bir süre içinde başlatılması uygun terapi sağlayan moleküler bilgi gerekli. Bu sonuçları daha önce bu geleneksel doku biyopsisi kullanılarak elde daha genellikle mevcuttur. NSCLC ve diğer kanserler için ek biyolojik benzer dolaşımdaki RNA tabanlı yaklaşımlar kullanarak geliştirilebilir ve aynı hızlı zaman-için-sonuçlarından yararlanacak. Örneğin, RT-dPCR kullanarak programlanmış ölüm Ligand 1 (PD-L1) mRNA transkript ölçümü hekimler immünoterapi seçenekleri hakkında bilgi. Ayrıca sıvı biyopsi yardımcı programı büyüyen bir ilgi ve dPCR için tedavi edici etkinliği izleme bulunmaktadır. Önceki dirilişi için belirli türevlerini test genomik kullanarak tümörü belirtileri doktorlar önce standart24görüntüleme gibi bakım önlemleri semptomatik hastalar tedavi rejimlerinin ayarlamak izin verebilir. Bu çalışmada bildirilen bir gibi protokoller onların invasiveness sigara, hassasiyet, hızlı teslimi etrafında zaman ve maliyet etkinliği nedeniyle izlemek için idealdir. Burada açıklanan tahlil sonuçları hızlı tedavi kararları kolaylaştırır ve doku tabanlı test4ile deneyimli bazı sınırlamalar kaçınmanızı sağlar örnek alınmasından itibaren en az yanlış algılama oranları, 72 saat içinde sağlar.
Bizim iletişim kuralı ve veri düşük bereket RNA çeşitleri yanı sıra klinik pratikte test kan tabanlı mutasyon olasılığını belirlemek için sağlam test sistemi göstermektedir. Bu para, ayrıca daha kapsamlı genom ve doku ve kan test Proteom bile daha geniş klinik bilgi sağlayabilir gibi hızlı hedeflenen sıvı biyopsi tarafından tanımlanan mutasyon işleme dönüştürülebilir bir sürücüsü var mı hastalar için yaklaşımlar tedavi planlama desteklemek için.

Kadar küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) yüzde 25 hasta yeterli doku tanı anda test için hazır olabilir. Doku kullanılabilir olduğu durumlarda bile bu yeterli miktar veya gerçekleştirmek için kalite moleküler testler1,2tavsiye edilebilir değil. Durumlarda moleküler profil oluşturma için biyopsi yeterli doku olduğu hastalar birkaç hafta veya daha uzun sonuçlarını beklemek veya tedavi moleküler sonuçları3,4olmadan başlamak zorunda kalabilirsiniz. Ancak, bu hastaların NSCLC ile tanısı için birden çok hedefli tedavi seçenekleri gelişiyle verilen bilgilendirici moleküler tanı kullanılabilir olması önemlidir. Dolaşımdaki boş hücre DNA'ın (cfDNA) sıvı biyopsi üzerinden test geleneksel doku4,5,6test zorlukların bir çözümdür. Dava cfDNA ve benzer bir dPCR tabanlı iş akışı hızlı sonuç oluşturmak için kullanarak NSCLC mutasyonların geçerli test seçenekleri içerir mutasyonlar ΔE746-A750 ve L858R, EGFR direnci mutasyon T790M duyarlılığı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) , KRAS Proto-Oncogene (KRAS) çeşitleri ve B-Raf Proto-Oncogene (BRAF) değişken V600E. Her ne kadar genel olarak alan tarafından kabul edilen değil, mesajcı RNA (mRNA) tümör elde edilen sıvı biyopsi izole dolaşan önemli klinik bilgiler7,8,9da sağlayabilir. Biz daha önce geliştirilen ve Echinoderm Mikrotubul Protein gibi ilişkili 4 Anaplastik lenfoma reseptör tirozin kinaz (EML4-ALK) füzyon varyantları kan plazması10çoğaltılmış algılama yöntemleri bildirdi. Bu çalışmada, ROS1 ve RET, sekiz füzyon türevleri her tahlil içinde kapsayan için üst düzey çoğaltılmış RNA hedefler dahil etmek için bu yöntemleri genişletilmiş. Amaç bu füzyon çeşitleri gelen hastaların daha önce NSCLC ile tanısı plazma tespiti için hızlı, hassas, belirli ve tekrarlanabilir bir teknik geliştirmekti.
Test işlemi içinde bir hekim ofisi RNA kan toplama tüpler11sabitleme kullanarak başlatılır. Bu tüpler RNase inhibitörleri hem de koruyucu bir hücre içerir. Gecede Merkezi Amerikan patologlar kap kolej akredite/klinik laboratuvar iyileştirme değişiklikler (CLIA) için sevk öncelikli olduğu-sertifikalı laboratuvar (klinik laboratuvar) yetkili personel tarafından işleme için. Klinik laboratuvar tarafından alınan sonra her adım işleme onaylanmış standart işletim yordamlar (SOP) altında yapılır. Tam kan plazma, daha sonra ya da RNA dolaşan yalıtmak için kullanılır kurtarmak için centrifuged kan ya da moieties, exosomes ve trombosit7,8,9gibi Kapsüllenen içinde serbest. Bu bölmeleri gelen RNA yalıtmak için sistem üzerinde birkaç çıkarma yöntemleri karşılaştırmalarına göre RNA kurtarma için seçili. İzole RNA transkripsiyonu cDNA için konsantre ve geriye doğru. Birkaç transkriptaz enzim ve gen özgü astar cDNA sentez yöntemi hedef transkript dönüşüm10ROS1 ve RET en üst düzeye çıkarmak için en iyileştirme sırasında değerlendirildi. Bu Tutanaklar, tümör kaynaklı füzyon türevleri gibi dolaşan düşük bereket için önemlidir. Son olarak, dPCR astar ve yoklama konsantrasyonları RET veya ROS1 füzyon türevleri ve denetim gene, glucuronidase-β (GUSB) çoğaltılmış tespiti için izin vermek için optimize edilmiştir. Biz o zaman son kilitli protokolü bu raporda açıklanan analitik doğrulama çalışmaları yapmadan önce en iyi koşulları her optimizasyon çalışmaları kombine. Bu iletişim kuralı ve bu sonuçlar nadir füzyon türevleri dolaşımda rutin tespiti için hızlı ve hassas bir iş akışı için temel sağlar.

a blood-based test for the detection of ros1 and ret fusion transcripts from circulating ribonucleic acid using digital polymerase chain reaction

Yalıtım ve tümör kaynaklı dolaşımdaki ribonükleik asit (cRNA) sıvı biyopsisi kan tabanlı için karakterizasyonu için yeni yöntemler geliştirdik. CRNA kandan kurtarılan sağlam tespiti bir kritik karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis için bir çözüm temsil eder. Test tam kan koleksiyonuna cRNA stabilize koruyucu madde içeren kan toplama tüpler ile başlar. Boş hücre, exosomal ve trombosit ilişkili RNA plazma izole bu test sistemi. CRNA Tamamlayıcı DNA (cDNA) transkripsiyonu ve dijital Polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) kullanılarak güçlendirilmiş ters. Örnekleri hem hedef biyomarker yanı sıra için bir denetim gen değerlendirilir. Test doğrulama algılama, doğruluk ve sağlamlık çalışmalar analitik örnekleri ile sınırı dahil. Tekrarlanarak bu çalışmalar sonucunda geliştirilen yöntem ROS1 için birden fazla füzyon türevlerini algılamak (C-Ros proto-oncogene 1; 8 türevleri) ve RET (transfection proto-oncogene sırasında; yeniden düzenlenmiş 8 türevleri). Böylece test sonuçlarını sürekli örnek alındığı 72 saat içinde oluşturulabilir örnek işleme iş akışı optimize edilmiştir.

Bu iletişim kuralı RNA füzyon türevleri NSCLC hastalar (şekil 1A) plazma içinde sürücü mutasyonlar ölçüm kullanılmak tespiti için geliştirilen bir test sistemi açıklanır. Füzyon mRNA ürünleri NSCLC popülasyonda en yaygın RET ve ROS1 düzenlemeler ifadeden13,14,15,16,17tespit. Çoğaltılmış PCR deneyleri sonra sekiz en yaygın transkript türevleri her hedef için NSCLC içinde tek bir tepki içinde algılamak için tasarlanmıştır. ROS1 odağı, en yaygın translokasyonlar dernekler 5' bölümleri CD74, SDC4, SLC34A2, EZR veya TPM3 genler (şekil 1B) oluşturur. En yaygın translokasyonlar, RET odağı yan yana ile KIF5B, kendisi için tahlil altı exon kavşaklar kapsar neden. Kapsamında ek RET ortakları ile CCDC6 ve TRIM33 (şekil 1C) içerir. Toplamda, yaklaşık % 88 deneyleri kapak ROS1 ve RET değişiklikler NSCLC hasta17' gerçekleşmesi için bilinen % 99'u.
Tahlil bileşenleri özgüllük ilk ROS1 veya RET tarafından füzyon transkriptleri deneyleri multiplexed için mRNA sıra içeren sekiz bireysel vitro RNA'lar kullanılarak değerlendirilmiştir. Her RNA türler çoğaltılmış sürüm oluşur bireysel her varyant tahlil karşı test edilmiştir. Bu deneyleri yok olan, böylece % 100 gösteren analitik özgüllük içinde tasarlanmış multiplexed deneyleri (veri gösterilmez). Algılama testi Protokolü'nün alt sınırı belirlemek için toplam RNA hücre satır tahlil dahil bir füzyon değişken ifade elde karışık bir arka plan % 5, % 1, % 0,2 ve %0,04 konsantrasyonlarda normal RNA'ın içine. Kadar az % 0,2 füzyon değişken (Şekil 2A-B) olarak tespit çoğaltılmış RET ve ROS1 varyant PCR deneyleri. Buna ek olarak, % 5'lik bir hazırlık kapalı-hedef hücre kültürünü türetilmiş RNA (EML4-ALK füzyon transkript ifade) çoğaltılmış ROS1 ve RET deneyleri ile daha fazla özgüllük (Şekil 2A-B) gösteren algılanmadı.
Hassas RT-dPCR süreci test her iki ROS1 için gerçekleştirilmiş ve e. analitik kontrol malzemesi ekimolar vitro RNA'ların oluşan üç konsantrasyonları (yüksek, orta ve düşük) ters transkripsiyon ve dPCR 3'te işlendi farklı durumlar aynı gün (iç-gün), üç gün üst üste (arası gün) ve iki işleç (arası işleç) içinde. Kesinlik testinin sonuçları hem faiz füzyon transkript yanı sıra bir denetim gen, bir iç QC ölçüsünü (şekil 2C-D) bulunan GUSB, doğru algılama gösterdi.
GUSB iç kontrol ek olarak, klinik örneklerin her toplu iş iş bir grup toplu iş denetimi çalıştırıldı. Olumlu bir denetim analitik içinde in vitro bir karışımı her RT-dPCR in test füzyon versiyonlarının temsil RNA, hem de analitik vitro RNA GUSB için geliştirilmiştir. Bu RNA normal insan plazma RNA ayıklama sırasında lysate içine arttı ve Protokolü boyunca klinik örneklerin yanında işlendi. Ters transkriptaz (Hayır RT) kontrol RNA ayıklama iş akışı içinde bulaşıcı malzeme yokluğu onaylamak ve astar özgüllük RNA için göstermek için bir negatif kontrol yapıldı. Hayır RT denetim pozitif kontrol olarak aynı malzeme kullanılarak oluşturulan ancak cDNA sentezi tepki içinde enzim içermez. RNA kontrol (NRK) Tutanaklar ters transkripsiyon reaksiyon bileşenleri kirletici yokluğu onaylamak için negatif bir denetimdir. Bu denetim cDNA sentez adımda iş akışı içine tanıtıldı ve su tepki yerine bir RNA şablon olarak eklendi. Hayır RT ve NRK denetimleri doğru sonuçları teslim edilecek ise her iki kanal negatif olması gerekir. Tablo 1 ters transkripsiyon reaksiyon bileşenleri her denetim için listeler. Bu denetimlerin her birinin için 2D araziler örnekleri için ROS1 gösterilir (şekil 3 A-C) ve RET (şekil 3 E-G) multiplex deneyleri. Füzyon türevleri floresein amidite (FAM) sonda kullanarak tespit edildi ve denetim gene, GUSB, 5'-hexachloro-floresein-CE phosphoramidite (ONALTILIK) sonda kullanarak algılandı iken y ekseni gösterilir ve x ekseni üzerinde. Bu toplu işlem denetimleri tahlil sağlamlık belirlemek için 21 gün boyunca değerlendirildi. Füzyon olumlu damlacıkları ve GUSB kontrol gen damlacıkları ROS1 ve RET için çalışma (şekil 3D, H) boyunca yürütülen tüm 21 ishal tespit edildi. Tüm negatif denetimleri (Hayır RT ve NRC) tüm 21 gün (veri gösterilmez) arasında negatif sonuç vermedi.
Sorun giderme yeteneği klinik laboratuvar ortamında çalıştırmak için herhangi bir test Protokolü önemli bir bileşenidir. Burada, gerçek dünya örnekleri RT-dPCR iletişim kuralını kullanarak alt-optimal sonuçlarının sağlamak. Ters transkriptaz kontrol (şekil 4A) önemini gösteren bir örnek 2D çizim ilkidir. Bu örnekte, mutant olumlu damlacıkları olmasına rağmen cDNA dönüştürme nedeniyle enzim eksikliğine bağlı mevcuttu. Bu sonucu hedef kapalı genomik DNA yükseltecek dPCR astar nedeniyle büyük olasılıkla oldu. Bu durumda, tasarım bir intron kapsayan testin genomik DNA amplifikasyon engeller. Alternatif olarak, bir RNase free Dnaz enzim bulaşıcı DNA ortadan kaldırmak için kullanılabilir ancak bazı RNA bozulması enzim ile kuluçka sırasında oluşabilir gibi bu nadir hedefleri, tespiti için tavsiye edilmez. Sonraki örnek 2D arsa bir NRK her iki kanal (şekil 4B) pozitif damlacıkları ile oldu. Bu Kirlilik RT-dPCR kurulum aşamasında belirtti. Bu durumda, sınamada kullanılan herhangi bir potansiyel kirlenmiş reaktifler atmak, iyice tüm ekipman arındırılmasına ve taze reaksiyon bileşenleri ile yeniden test için önerilir. Bir sprey 45 ° hattı (şekil 4C) boyunca damlacıkları olarak sunulan üçüncü örnek 2D arsa. Bu kez kesme ve damlacıkları coalescing kaynaklanır. Damlacıkları zarar eğilimli olduğunu dikkatli damlacık termal Bisiklete binme önce işleme, çok önemlidir. Biz otomatik damlacık üretimi, kullanımı tavsiye ne zaman elde edilebilir. El ile aktarma damlacıkları oluşturursa, önerilen wide-geçişli ipuçları seçin ve dikkatli pipetting tekniği kullanırım emin olun. Yavaş aspirasyon ve dağıtım, her yer alan ile 5-6 saniye içinde damlacık transferi gerektirir ve pipet ucu açılış damlacık kartuş dokunmatik değil veya iyi esastır. Dağıtımı, pipet ucu sıvı seviyede tutmak ve damlacıkları kullanılmış (görünümü için gösteri video) gibi yavaşça kaldırın. Son 2D çizim örnek pozitif ve negatif damlacık nüfus (şekil 4 d) arasında bir ayrım eksikliği gösterir. Bunun birkaç nedeni olabilir. Lizis arabellekleri ve son derece bozulmuş DNA, aşırı kullanılan deterjanlar gibi güçlü ÇSYİ inhibitörleri ayrılık kaybına neden olabilir. Bu durumda, bir temizlik adım cDNA sentezi ve dPCR (gibi bu protokol içinde adım 5 açıklanmıştır) arasında eklemeyi düşünün. Son olarak, ayrılık eksikliği da alt-optimal amplifikasyon koşulları nedeniyle olabilir ve PCR adım duruma getirilmesi de durulmalıdır.
Şekil 5 temsil 984 gerçek dünya hasta içinde veri teslimi etrafında zaman örnek ve hızlı doğasını bu test iş akışı gösterilmektedir. Sonuçlar için tedavi eden hekim gibi erken 48 saat içinde (vakaların % 79) örnek alındığı ve vakaların % 95 72 saat içinde rapor edilmiştir. Sonuç olarak, kullanımı RNA kan toplama tüpler, kan ve RT-dPCR bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralıyla uygun iç ve toplu denetimleri, göre en iyi duruma getirilmiş RNA ayıklama yordamlarından dolaşan stabilize hızlı test sistemi için sağlayabilir füzyon RNA çeşitleri NSCLC içinde ilgili doğru algılanması.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> Resim 1 : Kan örnek işleme adımları Fusion varyant NSCLC içinde deneyleri en yaygın RET ve özel ROS1 türevleri kullanarak algılama için bakış. (A)örnek test tam kan çizilir ve bir BCT numune toplama kiti klinik laboratuvar içinde sevk başlatılır. RNA dolaşan trombosit zenginleştirilmiş plazma içinde birden fazla kaynaktan ters ile belirli astar gen transkripsiyonu ve dPCR kullanmak için saf kurtarılır. Örnekleri damlacık nesil (emülsiyon), oluşan ticari olarak kullanılabilir bir sistem kullanarak işlenir amplifikasyon ve damlacık devam ediyor. Veri ticari olarak mevcut yazılımı kullanılarak analiz edilir. Test sonuçlarını sonra belgelenen ve geri testi isteyen hekim bildirdi. İşleminin sonucu serbest bırakmak için örnek alınmasından itibaren 72 saatlik bir zaman çerçevesi içinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. (B) ROS1 ve (C) RET için sekiz türevleri içinde çoğaltılmış deneyleri kaplıdır. Biodesix Web sitesi izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> Resim 2 : Analitik doğrulama. Hücre-hatları(a)ifade SDC4-ROS1 füzyon ve (B) CCDC6-RET füzyon toplam insan vahşi tipi RNA (WT RNA) bir arka planda seyreltilmiş. Her füzyon türevi, algılama sınırı % 0,2 değişik frekansta her varyant tahlil için ön tanımlı ölçütleri kullanarak kurulmuştur. Tüm örnekleri bu eşiğin en az 21 denetim gen kopyalarını da içeriyordu. % 5 EML4-ALK (ALK) standart bir arka planda vahşi tipi RNA'ın negatif bir sonuç tarafından doğrulandı tahlil özgüllük göstermek için test edildi. Analitik çoğaltılmış RNA standartları yüksek, orta ölçüldü ve (C) ROS1 ve (D) e. kesinlik düşük konsantrasyonlarda üç ishal aynı gün (iç-gün), üç ishal üç gün üst üste (arası gün) ve ile üzerinden değerlendirilir iki bağımsız işleç (arası işleç). Kopya sayısı ve standart sapmalar araçlarının gösterilir. Biodesix Web sitesi izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> Şekil 3 : Toplu işlem denetim örnekleri ve sağlamlık veri. Multiplexed ROS1 tahlil dPCR 2D arsa(a)olumlu denetim için (B) Hayır ters transkriptaz kontrol ve (C) RNA şablon kontrol sonuçları. (D) denetimleri (hafta sonları ve tatil günleri hariç) 21 gün üst üste üzerinde işletilmiştir. ROS1 kontrol edildi 141 + / 439 olumlu için standart sapmalar +/-kopya numarası demek. Hiçbir ters transkriptaz ve hiçbir şablon kontrolleri de her gün çalıştırılan ve bunlar tüm negatif (veri gösterilmez). RET multiplexed tahlil dPCR 2D Arsa (E) olumlu denetim için (F) hiçbir ters transkriptaz denetim ve (G) RNA şablon kontrol sonuçları. (H) denetimleri (hafta sonları ve tatil günleri hariç) 21 gün üst üste üzerinde işletilmiştir. RET kontrol edildi 586 182 +/-olumlu için standart sapmalar +/-kopya demek. Değil hiçbir ters transkriptaz ve ayrıca her gün çalıştırılan ve Hepsi negatifti hiçbir şablon denetimler gösterilmiştir. Biodesix Web sitesi izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> Şekil 4 : RT-dPCR sorun giderme. 2D kesme ve damlacıkları ve (D sergiler (A) hiçbir ters transkriptaz kontrolü (B) kirlilik yok RNA denetiminde (C) içinde kirlenme olduğunda temsil eden alt-optimal dPCR sonuç elde Arsalar ) kötü PCR koşul ve PCR inhibisyon optimize edilmiştir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> Şekil 5 : Gerçekleştirme süresi (TAT). TAT (saat cinsinden) bir RNA değişken isteyen testler için derlenmiş (n = 984). Veri dışlar haftasonları, tatiller ve örnekleri için düzenlenen > Laboratuvar Test istek formları üzerinde eksik klinik bilgi nedeniyle 24 h. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> Tablo 1: Ters transkripsiyon reaktifler için hazırlanması süreci denetimleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 dPCR supermix sondalar için x (no 2'-deoxyuridine 5'-trifosfat)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x varyant hedef astar/probları ayarla (450 nmol/L astar, 250 nmol/L FAM sonda)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denetim hedef astar/sonda küme x 20 (450 nmol/L astar, 250 nmol/L HEX sonda)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>nükleaz ücretsiz su</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Ana karışımı için hazırlanması dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım Bisiklete binme</td>
			<td>Sıcaklık</td>
			<td>Zaman</td>
			<td># Döngüleri</td>
			<td>Rampa oranı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzim harekete geçirmek</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denatürasyon</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tavlama/uzantısı</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 dk.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzim devre dışı bırakma</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(İsteğe bağlı) tutun</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>sonsuz</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Termal bisiklet koşullarını.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

a-blood-based-test-for-detection-ros1-ret-fusion-transcripts-from

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Görüntüleme.  Biodesix. Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

Video: A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the outcome of this deadly disease. MicroRNAs (miRNAs) are tissue specific, small, non-coding RNAs regulating gene expression, which may act as extracellular messengers of biological signals derived from the cross-talk between the tumor and its surrounding microenvironment. They could thus represent ideal candidates for early detection of lung cancer. In this work, a methodological workflow for the prospective validation of a circulating miRNA test using custom made microfluidic cards and quantitative Real-Time PCR in plasma samples of volunteers enrolled in a lung cancer screening trial is proposed. In addition, since the release of hemolysis-related miRNAs and more general technical issues may affect the analysis, the quality control steps included in the standard operating procedures are also presented. The protocol is reproducible and gives reliable quantitative results; however, when using large clinical series, both pre-analytical and analytical features should be cautiously evaluated.

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

Here, we present the detailed protocol adopted in the BioMILD screening trial to perform the circulating microRNA signature classifier test for early lung cancer detection.

MikroRNA tabanlı sıvı biyopsi: Plazma miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC) akciğer kanseri süzmek için bir deneyim

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Kanser Araştırmaları

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Tıp

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biyomühendislik

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Biyoloji

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 water-in-oil droplets, and the PCR occurs in the individual droplets. The dd-PCR has several advantages over conventional real-time qPCR, including increased accuracy in detecting low-abundance targets, omitting reference genes for quantification, eliminating technical replicates for samples, and showing high resilience to inhibitors in the samples. Recently, dd-PCR has become one of the most popular methods for accurately quantifying target DNA or RNA for gene expression analysis and diagnostics. Circular RNAs (circRNAs) are a large family of recently discovered covalently closed RNA molecules lacking 5' and 3' ends. They have been shown to regulate gene expression by acting as sponges for RNA-binding proteins and microRNAs. Furthermore, circRNAs are secreted into body fluids, and their resistance to exonucleases makes them serve as biomarkers for disease diagnosis. This article aims to show how to perform divergent primer design, RNA extraction, cDNA synthesis, and dd-PCR analysis to accurately quantify specific circular RNA (circRNA) levels in cells. In conclusion, we demonstrate the precise quantification of circRNAs using dd-PCR.

This protocol describes the detailed method of digital droplet PCR (dd-PCR) for precise quantification of circular RNA (circRNA) levels in cells using divergent primers.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...