Yazarlar deneyi ile ilk yardım Amanda Struckhoff teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH 5RO1CA115706 bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Plaka hazırlanması Kollajen ile Kaplı <ol><li> 10 ug / Opti-MEM ortam içinde ml bir nihai yoğunluğa kolajeni ile seyreltilir. </li><li> Adım 1 den her oyuğa ilave edilerek 1.5 ml kolajeni ile Coat 6 oyuklu plakalar,. 4, bir gece boyunca inkübe ° C. </li><li> Ertesi gün, 1x Fosfat ile 2 kez Salin (PBS) Tamponlanmış plaka yıkayın ve PBS saklayın. </li></ol> 2. 6-iyi Plate Hücre Hazırlama ve Tohum Not: Hücre hareketi için en uygun koşulları sağlamak için sıcak bir ortam ve PBS kullanın <ol><li> Büyümeye MDA-MB-231 (invaziv meme kanseri hücre hattı) seyrek% 10 Fetal Bovine Serum (FBS) ile Dulbecco Modified Eagle Orta (DMEM) içinde. Bu örnekte, MDA-MB-231 kullanabilir; Bununla birlikte, bu yöntem, herhangi bir yapışkan kanserli olmayan kanser hücre çizgileri de uygulanabilir. </li><li> Sıcak 1x PBS ile iki kez hücre yıkayın ve tripsinizasyon ile toplamak. Su yapmak için bir mikroskop altında hücrelerin kontrol edinhücrelerinin doğru tripsin muamelesi vasıtasıyla ayrılmış olduğu yeniden. </li><li> % 10 FBS DMEM ekleyerek hücreleri toplayın, yavaşça 5 dakika 1000 g olarak hücreleri aşağı spin. % 10 FBS ile DMEM ortamı içinde yavaşça hücre pelletini. </li><li> Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme tarafından hücre pelletini kırın. Bu, mümkün olduğunca tek tek hücrelerin içine kümeleri yıkmak için önemlidir. </li><li> Hücreleri saymak ve% 10 FCS ile 50.000 hücre / ml DMEM ortam içinde bir son konsantrasyon elde etmek seyreltik. Her kuyunun içine 2 ml dağıtın. </li><li> Hızlandırılmış mikroskopi başlangıç ​​kadar, bir gece boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Göç için geniş bir alan sağlamak için, bir pipet kullanarak bir yara oluşturabilir, moloz (yara sonucu oluşan) çıkarın ve% 10 FBS DMEM eklemek için 1X PBS ile plaka yıkayın. Kayan hücrelerin mikroskop altında kontrol edin. Hücrelerinin büyük sayıda yüzer ise, yıkama işlemi tekrar edin. Şimdi, plakası üzerine ayarlanabilir hazırdırgörüntü alımı için mikroskop. </li></ol> 3. Mikroskop Kurulum ve Otomatik Resim Alma Otomatik görüntü alımı için mikroskop kontrol çeşitli görüntüleme yazılım paketleri vardır. Burada, Slidebook 5.0 görüntüleme yazılımı kullanın ve otomatik satın alma ve minimal fototoksisite hız önemdedir canlı hücre uygulamaları için mükemmel bir EM-Hamamatsu C9100 kamera, birleştiğinde bir mikroskop (Olympus IX81), üzerinde gerçekleştirilir. Sistem bir sahne üst çevresel kontrol odası (Neue Canlı Hücre) ve otomatik XY denetleyicisi (önce ProScan) içerir. Görüntüler tanımlanmış bir zaman aralığı ile parlak bir alan modunda 10X UPLANFL Ph1/0.30 amacı, ile elde edilir. Aşağıdaki protokol görüntü toplama açıklanmaktadır. <ol><li> Mikroskop, kamera ve canlı hücre görüntüleme cihazları açın. Mikroskopik sahne üzerinde plakası yerleştirin. Neue Canlı Hücre çevre tarafından Kapak plakasıBir CO2 kaynağı ve sıcaklık algılayıcı ile bağlanmıştır rının kontrol odası,. 37% 5 ° C ve CO 2 termostatı ayarlayın. </li><li> SlideBook yazılım tam otomatik objektif seçimi, dalgaboyu seçimi ve floresan ve parlak saha teknikleri arasında kolay geçiş sağlar. Odak farklı kontrol parametrelerini ayarlamak için, açık SlideBook yazılım&gt; tıklayarak, menü çubuğunda&gt; select odak denetimi gitmek&gt; <img alt="0 Düğme 1 Şekil" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> ve aşağıdaki parametreleri seçin: <ol><li> In &quot;Amaç kutusunda,&quot; penceresinden aşağı açılan seçim tarafından nesnel tanımlar. Bir faz objektif kullanıyor ve elle kondenser uygun faz halka seçmiş unutmayın. Otomatik bir kondansatör ile bir sistem kullanıyorsanız, bu otomatik olarak yazılım aracılığıyla ayarlanır. Ne amacı ne de taret kondenser otomatiktir Alternatif olarak, eğer bu kılavuzu her seçilmelidirly. </li><li> : &quot;Filtre Seti&quot; kutusunda <ol><li> Kullanılabilir filtreler (sistemimizde Kamera için &quot;Geniş açılı&quot;, gözmerceği için &quot;Live&quot;) görmek için açılan kutu aşağıya mercek veya kamera birine ışık yolu yönlendirmek için ayarları seçin. </li><li> Aydınlık aydınlatma için uygun filtre seçin (bizim set up, bu seçeneği aydınlık ışık yolu için açık bir pozisyonu temsil eden &quot;DIC&quot; etiketli). </li><li> Parlak bir alan deklanşör açmak için &quot;Aç Parlak&quot; tıklayarak ışık kaynağı seçin. </li></ol></li></ol></li><li> Göz kısmı altında örnek görmek için, taret parlak bir alan filtre (bizim sistemde konum &quot;6&quot;) seçin. Başlangıçta uygun alanları bulmak ve odak (adımlar 3.2.1 için 3.2.2.3) içine numune getirmek için oküler üzerinden örnek gördükten sonra. Görüntü yakalama (konum sistemimizde &quot;1&quot;) için kameraya ışık yolu değiştirmek için filtre taret taşıyın. </li><li> Otomatik sahne sağlar farklı XY koordinasyon seçimigörüntü alımı sırasında ilgi Birden fazla alanda yakalamak için tes. SlideBook yazılımında, odaklanma kontrolü gidin, göz parçası olsa farklı pozisyonlarda seçin, &quot;XY&quot; seçin, daha sonra görüntü yakalama (Şekil 1) Her yerde &quot;set point&quot; kilidi tıklayın. </li><li> İnce ayar ekranda görüntülenir kamera görüntüsü odak. Bu da daha ince artışlarla odaklama ayarını mikroskop ya da bilgisayar kontrolleri, üzerinde manuel kontroller kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> &quot;Focus Denetimleri&quot; penceresindeki denetimleri kullanarak, sahne z konumunu ayarlamak. En iyi sonuçlar için, plaka ile temas yakınında düz hücresel çıkıntılar odaklanın. </li><li> Odaklama için uygun bir aralık içinde olması poz süreleri ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın odaklama ile yardımcı olmak için. Birden XY pozisyonları seçilmişse, her pozisyon için odak ayarı: odak denetimi&gt; XY&gt; ziyaret noktası altında. Not: Bu emin, inci olmak için yapılıralanları doğru bir şekilde optimal bir anlık görüntü için odaklanmıştır. </li><li> Yakalama penceresini parametrelerini ayarlamak için yazılımı kullanın. SlideBook yılında seçerek yakalama açın <img alt="0 Düğme 2 Şekil" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> menü çubuğundan. Şekil 2&#39;ye bakınız. Daha sonra aşağıdaki parametreleri kontrol edin. <ol><li> Zaman atlamalı olarak tip&gt; Capture kontrol edin. </li><li> Geniş alanı: DIC (parlak alan görüntü için) Filtre setini kontrol edin. </li><li> &quot;Time lapse yakalama&quot; (bu hücre tipine bağlı olarak değişebilir) Çekilecek zaman noktaları sayısıdır. Süre deney için zaman toplam uzunluğudur. Zaman Birimleri [milisaniye (ms), saniye (s), dakika (m) ya da saat (h)] açılan menüden seçilebilir. </li><li> &quot;Aralık&quot; bir timepoint başında ve sonraki timepoint başlangıcı arasındaki gecikme oluyor. Bu değerlerin iki yazarken, üçüncü alana otomatik olarak hesaplanacaktır. </li><li> Çoklu XY yakalama: &quot;Çok seçin1&#39;den fazla XY pozisyonu için nokta listesi &quot;. </li><li> Dosyayı adlandırın. Verilen örnekte, &#39;bunu &#39;231 adında var. </li></ol></li><li> Nedeniyle birden fazla görüntü için bilgisayarın kapatılması beklenmedik önlemek için, dosyayı kaydetmek için &quot;kuyruk&quot; seçeneği kullanın. Bu isteğe bağlıdır, ancak şiddetle tavsiye edilmektedir. Bu amaçla, yakalama altında contro l&gt; seçin Gelişmiş&gt; Makara&gt; bellek Yakalama ve her zaman geçtikten sonra spool dosyasına kaydedin. Slayt kitap dosyası (Şekil 3) kaydedileceği konumu göz atın. Üretilen film daha sonra belirlenen yere alınabilir. Mikroskop kurulum adımlarla özetlenmiştir <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">dosyası 3.1</a> . </li></ol> 4. Göç Görüntü İşleme ve Analizi: Hız ve Deplasman hesaplanması Bu örnekte, görüntü işleme SlideBo yapılırok 5, 6 5.0 yazılımı. Görüntü işleme ve analiz için böyle ImageJ 7 gibi çeşitli programları vardır. <ol><li> Farklı zaman noktalarında farklı bölgesinin görüntü elde SlideBook dosyalarını. Menü çubuğunda göster&gt; Resim altında&gt; Al&gt; Slayt kitap biriktirme&gt; istediğiniz dosya (Şekil 4a) seçin. </li><li> Burada amaç tek tek hücrelerin hareketini izlemek için. Bu otomatik izleme veya tek tek izleme kullanılarak yapılabilir. Örneğin, biz manuel izleme kullanmış, bu kolaylaştırır yana otomatik takibi ile daha zor olan, kolayca eserler ortadan kaldırılması. </li><li> Bu izleme gerçekleştirmek sahip olduğu SlideBook dosyası, açma. Menüsü altında: Seçiniz Maske&gt; Parçacık Takip Protokolü&gt; Manuel Parçacık Takip Protokolü (Şekil 4b). Bir pencere başlangıç ​​ve bitiş noktaları (Şekil 4c) ile çıkacaktır. </li><li> BegiHer bir hücre (çekirdeği) merkezinde tıklamayı, tek tek hücrelerin hareketini izlemek üzere n. Yaklaşık 30 hücreleri bir deneyden analiz edilecektir, böylece her bir film ile yaklaşık 10 hücreleri ve en az üç farklı filmler takip farklı konumlarda seçilmelidir. Her bir deney üç kez tekrar edilmelidir. Tarafsız bir yaklaşımı sağlamak için, bu tür ön bazı hücreleri gibi farklı yerlerden hücreleri seçin, orta, köşeler vb &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın, bir kez izleme yapılır. </li><li> Rastgele göç menüsü altındaki verileri&gt; seçin maske&gt; parçacık izleme&gt; parçacık izleme protokolü analiz etmek için hız, hız veya yer değiştirme vb değişiklikleri ölçerek analiz edilebilir. (Şekil 5a): Aşağıda açıklandığı gibi takip parametreleri seçin: <ol><li> Ile takip edin - Eğer açılır listeden izlemek istediğiniz parametreyi seçin. Alan bu örnekte, kullandık, Merkez (Ob merkezinin koordinatlarıtabidir). </li><li> &quot;Izlemek ve devam&quot; tıklayın. Izleme tamamlandıktan sonra, bu otomatik olarak bir sonraki adım ilerleyecektir. </li></ol></li><li> Bu tür değiştirme ve ortalama hız (Şekil 5b bakınız) gibi her yolu için istenen istatistikleri, Seçiniz: <ol><li> Ortalama Hız - toplam mesafe bu mesafeyi için gereken süreyi bölünmüş seyahatler. </li><li> Hacmi - nesne tarafından katedilen toplam mesafe. </li><li> &quot;Hesapla ve Devam Et&quot; bir sonraki adıma geçmek istiyorsanız, ya da sadece bir sonraki adıma gitmeden istatistikleri görmek istiyorsanız &quot;Hesapla&quot; seçeneğini tıklayın. Bir dosya metin dosyası olarak kaydedilebilir oluşturulur ve daha sonra Excel ihraç edilebilir. </li></ol></li><li> Otomatik bir izleme protokolü kullanılarak nesneler izlemek için, ilk olarak, bir maske hazırlandı edilmelidir. <ol><li> &gt; Segment Görüntü&gt; bir segment penceresi görünür Maskesi seçin&gt; eşiği elde edilene kadar seçin, öyle ki EylülBaşkalarından bir nesne arating&gt; (Şekil 5c bakınız)&gt; ok geçerlidir tıklayın. Adım 4.5.1 aynıdır. </li><li> Daha küçük nesneleri kaldırın - Seçici belirli bir boyutu daha küçük nesneleri kaldırmak için bu kutuyu işaretleyin. Düzenleme alanında boyutu girin ve birim olarak mikron veya piksel olarak seçin. Bu kalıntı sık neden eşya çıkarmak için kullanılır. </li><li> Minimum hareket - bir yol belirlemek amacıyla izlenmesi gerekir zaman noktalarının asgari sayısını girin. </li><li> Maksimum Hareket - Eğer bir kez noktadan herhangi bir nesneden sonraki beklediğiniz maksimum hareket girin. </li><li> Verileri analiz etmek Adımlar (4.6.2 için adımları 4.5.2 bakınız) manuel izleme aynıdır. </li></ol></li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Rastgele bir geçiş analizi bir örnek olarak hız ve yerdeğiştirme (Şekil 6) cinsinden miktarı. Dosyayı t verdikten sonrao excel, veri bir kutu ve bıyıkları arsa kullanılarak çizilir. Test ve kontrol arasındaki toplam deplasman ve ortalama hız karşılaştırma İstatistiksel analizde Mann-Whitney testi kullanılarak yapılır. Test örneği, kontrol ile karşılaştırıldığında ortalama hızı bir artış gösterir. Test örneği, kontrol ile karşılaştırıldığında toplam hacmi bir artış gösterir. Kontrol ve test Movie: Kontrol MDA-MB-231 ve test MDA-MB-231 hücrelerinde gece kollajen üzerine ekildi. Zaman atlamalı video mikroskopi, mikroskop tarafından yapılan bir EM-Hamamatsu kamera birleştirilmiştir. Görüntüler rastgele göç sırasında 18 saat olmak üzere toplam 1 saat arayla alınır. Film 1, kontrol ve test örnekleri için rastgele göç Movie 2 bakınız. Mikroskop kurulum: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> Şekil 1. Resim için birden fazla puan ayarlama<html> yakalamak. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> Şekil 2. Çekim denetimi betimleyen Adımlar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> Şekil 3. Nasıl birden fazla görüntü kaydetmek için. &quot;dflinebreak&gt; Göç Görüntü işleme ve analizi. <img alt="Şekil 4a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> Şekil 4a. Veri analizi için görüntü almak için adımlar. <img alt="Şekil 4b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> Şekil 4b. Parçacık izleme protokolü kullanılarak veri analiz adımları. <img alt = &quot;Şekil 4c&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg&quot; /&gt; Şekil 4c. Paletli parçacıkların Pencere betimleyen yol uzunluğu. Veri analizi Adımlar. <img alt="Şekil 5a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> Şekil 5a. Parçacık izleme protokol parametreleri gösteren adımlar. <img alt="Şekil 5b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> Şekil 5b. Analiz edilecek yolu istatistikleri seçimi. <img alt="Şekil 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> Şekil 5c. Otomatik izleme protokolü için maske oluşturmak için Adımları. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> Şekil 6. Ortalama hız (Şekil6a) ve deplasman (Şekil 6b) bir bıyıkları arsa çizilir. Kontrol etmek karşılaştırmak gibi test örneği hız ve yer değiştirme bir artış göstermektedir. Filmler Film 1. Kontrolü hücrelerin Göç. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Film 2. Test hücrelerin Göç. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Kontrol MDA-MB-231 ve test MDA-MB-231 hücreler gece boyunca kolajen üzerinde seyrek ekilmiştir. Zaman atlamalı video mikroskopi, mikroskop tarafından yapılan bir EM-Hamamatsu kamera birleştirilmiştir. Görüntüler rastgele göç sırasında 18 saat boyunca 1 saat arayla alınır. Kontrol ve test için rastgele göç filmleri bakınız.

<ol>
	<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84, 359-369 (1996).</li><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li><li>Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+random+migration+of+human+platelets.">Modulation of the random migration of human platelets.</a> J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).</li><li>Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+speed+comparison+of+microscope+software+programs.">Acquisition speed comparison of microscope software programs.</a> Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).</li><li>Struckhoff, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+ROCK+in+tumor+cells+controls+CXCR4-driven+adhesion+events.">Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events.</a> J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).</li><li>Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+collagen+and+fibronectin+in+neural+crest+cell+adhesion+and+migration.">Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration.</a> Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).</li><li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention.">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).</li><li>Yu, Y. P., Luo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myopodin-mediated+suppression+of+prostate+cancer+cell+migration+involves+interaction+with+zyxin.">Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin.</a> Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).</li><li>Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+promotes+directional+cell+migration+by+regulating+Rac1+activity+via+its+activator+betaPIX.">Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX.</a> J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).</li><li>Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-Ras+controls+membrane+protrusion+and+cell+migration+through+the+spatial+regulation+of+Rac+and+Rho.">R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).</li><li>Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+signaling+through+the+calreticulin/LDL+receptor-related+protein+co-complex+stimulates+random+and+directed+cell+migration.">Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration.</a> J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).</li><li>Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1-induced+T+cell+migration+on+ICAM-1+involves+regulation+of+MLCK-mediated+attachment+and+ROCK-dependent+detachment.">LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment.</a> J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Gerçek zamanlı rastgele göç testi gibi hız ve yer değiştirme gibi hücre göçü parametrelerin doğru, duyarlı, analiz sağlar. Bu yöntem, nokta ölçüm değeri sonuna kadar sınırlı değildir, dolayısıyla daha nicel olduğunu. Bu yana, hücreler serumu ile normal bir DMEM ortam izlenir; serum boş ortam içinde uzun inkübasyon zararlı etkilerini azaltır. Bu, hücre göçü biçimlendirme ve böylece, bu yöntem, migrasyon farklı sübstrat etkisini araştırmak için kullanılan olabilir alt tabaka <s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> İkizler Bio-Ürünler </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-Mem </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajen </td><td> BD </td><td> 354231 </td><td></td></tr><tr><td> Canlı Hücre odası &amp; Otomatik XY kontrolörü ile Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> Olympus 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> Çevre kontrol odası </td><td> Neue </td><td> Neue Canlı Hücre Odası </td><td> Bizimki odasının üstü ile uygun optikler için özel inşa edilmiş dikdörtgen cam levha üst vardır. Dikdörtgen şeklindeki bizim deneysel bir çok kullanılan çok oyuklu plakalar barındırırts. </td></tr><tr><td> Otomatik XY </td><td> Önce </td><td> Önce ProScan </td><td> Bu kesin dönüş time lapse mikroskopi sırasında seçilen XY pozisyonu çarpma sağlar. </td></tr><tr><td> Kamera </td><td></td><td> Hamamatsu EM kamera C9100 </td><td></td></tr><tr><td> Yazılım </td><td> Genellikle, bu tür Olympus gibi mikroskop satıcı aracılığıyla satın </td><td> Slayt Kitabı 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of random migration of cells using time-lapse video microscopy

Hücre göçü embriyonik gelişme, doku onarımında, bağışıklık sistemi fonksiyonu, ve tümör invazyonu 1, 2 önemli dinamik bir süreçtir. Yönsel, geçiş sırasında hücreleri bir hücre dışı kemotaktik sinyaline yanıt olarak, ya da bazik motilitesi makine tarafından sağlanan intrinsik kuyrukları 3 yanıt olarak hızlı bir şekilde hareket eder. Bir hücre hücrelerin kendi yerel ortamında keşfetmek için izin, düşük içsel yönü sahip olduğunda Rastgele göç oluşur. Hücre göçü ilk tepkisi hücre, kompleks bir süreçtir polarizasyon uğrar ve göç 2 yönünde çıkıntılar uzanır. Böyle Boyden çemberinin göç deneyi olarak göç ölçmek için geleneksel yöntemleri bir bitiş noktası sonucu olarak göç ölçüm sağlayan in vitro, in kemotaksis ölçmek için kolay bir yöntemdir. Ancak, bu yaklaşım ne bireysel göç parametrelerin ölçümünü sağlar, ne de visua izin vermezhücre göçü sırasında uğradığını morfolojik değişikliklerin Harp öncesi devresi. Time lapse mikroskopi - Burada, bize video kullanarak gerçek zamanlı olarak göç hücreleri izlemeye olanak sağlayan bir yöntem sunuyoruz. Hücre göçü ve işgali kanseri işaretlerinden olduğu için, bu yöntem in vitro kanser hücre göçü ve işgali okuyor geçerli olacaktır. Trombositlerin Rastgele göç trombosit fonksiyonu 4 parametrelerinden biri olarak kabul edilmiştir, dolayısıyla bu metod aynı zamanda trombosit fonksiyonlarının incelenmesinde yararlı olabilir. Bu testte, hızlı, güvenilir, tekrar üretilebilir olma avantajına sahiptir, ve hücre sayısı optimizasyonu gerektirmez. Hücrelerin fizyolojik olarak uygun koşullar muhafaza etmek amacıyla, mikroskop CO 2 kaynağı ve sıcaklık termostat ile donatılmıştır. Hücre hareketi düzenli aralıklarla mikroskop takılan bir kamera ile fotoğraf çekerken tarafından izlenir. Hücre göçü ölçüm ortalama hız ve hesaplanabilirSlidebook yazılımı ile hesaplanır verage yer değiştirme,.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

quantitative-analysis-random-migration-cells-using-time-lapse-video

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Görüntüleme.  LSU School of Medicine. Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.

Video: Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Biyoloji

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Sox10 içinde Kraniyofasiyal Kalkınma Görselleştirme: kaede Transgenik Zebra balığı Hattı Time-lapse konfokal mikroskopi kullanılarak

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. Therefore, it is considered a living antibiotic. To apply B. bacteriovorus as a living antibiotic, it is first necessary to understand the major stages of its complex life cycle, particularly its proliferation inside prey. So far, it has been challenging to monitor successive stages of the predatory life cycle in real-time. Presented here is a comprehensive protocol for real-time imaging of the complete life cycle of B. bacteriovorus, especially during its growth inside the host. For this purpose, a system consisting of an agarose pad is used in combination with cell-imaging dishes, in which the predatory cells can move freely beneath the agarose pad while immobilized prey cells are able to form bdelloplasts. The application of a strain producing a fluorescently tagged &#946;-subunit of DNA polymerase III further allows chromosome replication to be monitored during the reproduction phase of the B. bacteriovorus life cycle.

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Presented here is a protocol that describes monitoring of the complete life cycle of predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy in combination with an agarose pad and cell-imaging dishes.

Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...