Biz, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R15 GM065444 LB-03) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (KO) İntramural Araştırma Programı fon kabul etmek istiyorum. Bir NSF ödülü (DBI-0.923.402) LSM700 konfokal mikroskop alımı finanse edilmektedir. Biz genel yardım ve el yazması Dr. Andy Altın yararlı yorumlar da kabul etmek istiyorum. Kredi paylaşımı kaynakları, protokoller ve fikirler için tüm C. elegans toplum gider.

1. Nematodu kültürlerin <ol><li> Uygun C. edinin elegans Caenorhabditis Genetik Menkul Kıymetler Merkezi (CGC) veya bir meslektaşım süzün . </li><li> OP50 bakteriyel bir çim (3) numaralı seribaşı NGM agar plaklarına nematod büyütün. GFP suşları büyüme analizi için 25 ° C tavsiye edilir. </li><li> Mikroskopi deneyden önce gün numaralı seribaşı plaka üzerine en az 40 L4 larvaları almak ve 25 ° C gece tabak yerleştirin. Bu solucanlar, deneme için genç yetişkinler olacak. </li></ol> 2. Enjeksiyonlar Lizozomlar veya mitokondri gibi yapıları görüntülemek için arzu edilir ise, yetişkin görselleştirme önce floresan boya ile enjekte edilebilir. <ol><li> Kurutulmuş agaroz enjeksiyon pedleri hazırlayın. (Kaç gün önceden bir yapılabilir.) <ol><li> Suda erimiş% 2&#39;lik agaroz hazırlayın. Pasteur pipeti ile 22X54 mm coverglass üzerine 2 damla koymak. Damla üstüne çapraz başka bir coverglass yerleştirin. Ped çapı yaklaşık 1,5 cm kadar, uygun kalınlık elde etmek için, üst coverglass basın. 5-10 dakika bekletin. </li><li> Üst coverglass çıkarın. 1 saat süreyle 80 ° C fırında koyarak agaroz ped dehydrate veya bir gecede masa üstü oturmak için izin verir. </li></ol></li><li> Mitotracker veya Lysotracker çözüm hazırlayın. <ol><li> Yumurta Tampon floresan ajan sulandırınız. Biz genellikle Mitotracker veya Lysotracker 1:10 seyreltme kullanın. </li><li> 1.2 OD cam kapiller enjeksiyon iğnesi yapılır. Bir iğne bir iğne çektirmenin kullanarak çekin. </li><li> Sulandırılmış boya ile iğne geri doldurmak için çekilmiş bir Pastuer pipetlemeyin kullanın. </li><li> Kullanana kadar bir ışık, nemlendirilmiş odasında Yeri iğne. </li></ol></li><li> Ön-Enjeksiyon: mikroskop ve iğne ayarlama. <ol><li> Mount enjeksiyon iğnesi enjeksiyon aparat üzerine. Cihaz DIC görüntüleme yeteneği ile donatılmış bir Nikon TE200 inverted mikroskop sahneye monte Narishige doğrudan sürücü mikromanipülatör. </li><li> 1.2 mm ID tüp basınç regülatörü bağlı bir iğne takın. Sıkıştırılmış hava veya azot Ya harici bir basınç kaynağı olarak kullanılabilir. Regülatör 20-25 psi ayarlayın. </li><li> Enjeksiyon ped üzerine ağır mineral yağı (Parafın petrol) Yeri 2 damla. </li><li> Mikroskop üzerine enjeksiyon yastık yerleştirin ve yağın içine iğne düşük. Basınç uygulandığında iğne serbestçe emin sıvı akışı yapmak için kontrol edin. Enjeksiyon basıncı uygulayın ve iğne sıvı akana olmadığını gözlemleyin. Eğer yoksa, nazikçe iğnenin ucunu kırmak için ihtiyacınız olacak. Iğne ucu hafifçe kırık coverglass enjeksiyon pad üzerinde yerleştirilen küçük bir bit sürerek kırılmış olabilir. Iğne akan sonra, bir sonraki adıma hareket ettirin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon. <ol><li> Yaklaşık 1 saat önce izleme embriyolar, enjeksiyon pad üzerinde yağ damlası genç erişkin solucanlar aktarmak. Diseksiyon mikroskobu kullanarak bu transferi gerçekleştirin. Solucanlar transfer için bir sivri ucu ile bir platin tel solucan almak kullanın. </li><li> Pad üzerinde yatarken, böylece 10 solucanlar - 3 düzenleyin. Enjeksiyon için, daha kolay solucanlar birbirine paralel dizilmiş ve biraz daha az bir solucan uzunluk dışında iseniz Solucanlar enjeksiyon pad sonra hızlı bir şekilde çalışmak ve solucanlar kuruma helak önce enjeksiyon işlemi tamamlamak için önemlidir. </li><li> Enjeksiyon mikroskop mikroskop sahneye solucanlar coverglass yerleştirin. Distal gonad tüp orta kesiminde (rachis) içine odaklanın. Sonra aynı odak düzlemi içine iğne ucu taşımak için mikromanipülatör kullanın. Sahne yatay solucan iğne ile delinmiş olduğunu taşıyın. Iğne ucu rachis içinde bir kez basınç uygulayın ve gonad boya karışımı ile doldurmak için izin verir. Enjeksiyon pad üzerinde tüm solucanlar gonad hem silah enjekte edilir. </li><li> Enjeksiyondan sonra, solucanlar Yumurta Buffer, yaklaşık 0.5 ml sunmak için çekilmiş bir yeniden süspanse kullanın. Bu dehidratasyon ölüyor onları korumak ve onlara enjeksiyon prosedürü kurtarmak için izin verecek. </li><li> Solucanlar, bir ışık, nemlendirilmiş odasında oda sıcaklığında 1-2 saat kurtarmak için izin verin. </li></ol></li></ol> 3. Embriyolar incelemekte Agaroz pad <ol><li> Yumurta Tampon erimiş% 2 agaroz hazırlayın. </li><li> Tamamen yeniden süspanse edin, temiz bir mikroskop lamı üzerine 3 damla erimiş agaroz koydu. </li><li> Onları kapsayan bant etiketleme bir katman diğer iki slaytlar arasındaki yeri slayt. Bunlar agaroz pedi doğru kalınlıkta olmasını sağlayacaktır ayırıcılar olarak hizmet vermektedir. </li><li> Temiz ikinci bir mikroskop lamı dik aşağı agaroz damla üzerine yerleştirin. Üst slayt kılavuzu slaytlar bant dayanmaktadır kadar aşağı doğru bastırın. </li><li> Gözlem için embriyo monte etmek için hazır hemen önce, üst kızak kaldırın. </li></ol><ol><li> Varsa solucanlar enjekte edilmiş, sonraki iki adımı izleyin. Yoksa bunları atlayın. <ol><li> Bir gün önce hazırlanan plaka genç erişkin solucanlar seçin. Genç yetişkinler içinde embriyolar görmek gerekir. </li><li> Giremeyen bir NGM plaka üzerine 5-20 solucanlar seçin. Solucanlar onlara takılıp bakterilerin çoğu kaybedersiniz böylece solucanlar birkaç dakika için giremeyen plaka etrafında tarama için izin verin. </li></ol></li><li> Erişkin solucanlar genç embriyoların elde <ol><li> 18 mm 2 cam coverglass (1.5 coverglass kalınlığı tercih edilir) orta Yumurta Buffer 5-20 ul damla yerleştirin. </li><li> Yumurta Buffer düşüş içine giremeyen plaka veya enjeksiyon ped solucanlar taşıyın. </li><li> 26 gauge derialtı iğne ile açık solucanlar kesin. Vulva yakın solucan kesilerek açılır. Embriyolar solucanın dökülebilir göreceksiniz. </li></ol></li><li> Mount mikroskop lamı üzerine <ol><li> Agaroz pad ile hazırlanan ve embriyolar coverglass üzerine düşüktü mikroskop lamı tersine çevirin. </li><li> Uzun zaman atlamalı gerekiyorsa, coverglass kenarlarında kuruma önlemek için sızdırmazlık için vazelin kullanın. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskopi <ol><li> Uygun embriyoların bulunması. <ol><li> Mikroskop sahneye Yeri kaydırın. Embriyolar 10X lens ile tarayın. </li><li> Erken evre embriyolar bulmak için, anne mayoz tamamlama sürecinde olan embriyolar araştırın. Kısalma geçirmiş değil çünkü mayotik embriyolar daha sonra embriyolar ayırt edilebilir. (Embriyolar mayoz tamamladıktan sonra, ön sonunda hücre zarı ve yumurta kabuğu arasında önemli bir boşluğu bakın.) </li><li> Belirlediğiniz uygun bir şekilde, embriyogenezisin kayıt için daha yüksek bir büyütme lens taşımak, embriyo sahnelenecek. </li></ol></li><li> Görüntüleme <ol><li> Bu örnekte, biz mCherry ifade embriyolar hayal: H2B ve GFP: Ub etiketli proteinlerin. Biz Zeiss LSM700 geleneksel lazer tarama mikroskobu kullanıyor. </li><li> Görüntüler 63X 1.4NA objektif kullanılarak toplanır. 488 ve 555 lazerler minimal lazer gücü ve maksimum kazanç ile kullanılır. AZ yığını her 10-15 saniyede bir toplanır. Photobleaching ölçüde bağlı olarak 30-60 kez puan toplanır. Z yığını görüntüler son kez hızlandırılmış video için maksimum projeksiyon görüntü içine çökmüş. </li></ol></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 C İlk Mitoz Gübreleme elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Mikroenjeksiyon işlemi. Kilavuz Video 1 GFP Time-lapse video. Mayotik embriyo ubikuitin artı Lysotracker Mavi <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans.">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+WormBook.">Cell division WormBook.</a> , (2006).</li><li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans.">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li><li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li><li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation.">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li><li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporins+NPP-1,+NPP-3,+NPP-4,+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans.">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li><li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans.">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li><li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146.">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li><li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity,+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo.">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li><li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans.">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li><li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics.">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sperm ile füzyon sonra, zigot dinamik olayların bir dizi uğrar. Bu olaylar, hızla gelişen embriyonun içine görece statik bir hücre oosit dönüşümü. Birçok organizmalar, sitoplazmik düzenlenmeleri embriyonik kutupluluk kurulması ve yumurta aktivasyonu için kritik öneme sahiptir. C. elegans embriyo yumurta aktivasyonu ve embriyogenez bu erken olayları gözlemlemek için mükemmel bir fırsat sağlar. Embriyo döllenme sonrasında nispeten hızlı bir şekilde şeffaf ve erken gelişim olaylar meydana C. elegans araştırmacılar erken gelişim yer alan floresan etiketli proteinlerin ifade birçok yararlı transgenik suşları yarattı. RNAi veya mutantlar ile birlikte bu suşların çok hücreli bir organizmanın gelişimi (5, 6, 7, 8) altında yatan moleküler yollar diseksiyon için güçlü bir sistem sağlar. Bu video makalede, C. erken embriyogenez sırasında olayları kaydetmek için bu araçları ve teknikleri kullanarak pratik bir yaklaşım sunuyor elegans. Olgun C. elegans oosit mayoz I profaz tutuklandı ve yetişkin hermafrodit sperm kesesi döllenmiş. Döllenmeden sonra, oosit mayoz I ve II kalan ilerler. Bu aşamalar floresan etiketli histon H2B (5) kullanılarak görülebilir. Anne mayoz tamamlanması sırasında, sperm DNA (bkz. Şekil 1) yoğunlaşmış kalır. Mayoz tamamlanmasından sonra, anne ve babaya DNA decondensed ve iki pronuclei formu olur. Pronucleus anne baba pronucleus doğru göç ve embriyo merkezine yakın bir araya. Mitoz pronükleer toplantıdan sonra hızla söz konusudur. Tüm bu olaylar, bir saatten daha kısa bir süre içinde ortaya çıkar. Böylece, bu olaylar dizisi zaman atlamalı mikroskopi kolayca yapılabilir. Sahne bu tekniğin bazı tesis konfokal mikroskop erişmek için ek olarak nematod kültür gibi temel mikroskopi becerileri gerektirir. Burada sunulan örnek bir transgenik C. kullanır ubikuitin ve mCherry:: H2B iki floresan protein, GFP ifade elegans süzün. Konfokal lazer tarama mikroskobu, bu iki proteinin dinamik yerelleştirme gözlemlemek için kullanılır. Buna ek olarak, floresan etiketli Lysotracker enjeksiyon Döllenmeden sonra embriyo lizozomlar kaderi takip etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Mitokondri veya yerel kalsiyum konsantrasyonları (9) görselleştirilmesi için etiketli izci enjeksiyon yapılabilir. Teorik olarak, enjeksiyon protokolü embriyo floresan etiketli molekülünün herhangi bir türünü görüntülemek için kullanılabilir. Bu etiketli küçük moleküller, proteinler, lipidler, vb Bazı durumlarda içerebilir, aslında, solucanlar alımı kolayca mitotracker (10) gibi bazı boyalar etiketli izci enjekte etmek için gerekli olmayabilir. Ancak, iliklerine ve lysotracker enjeksiyon de denemiş ve embriyolarda görünüm için enjeksiyon ile daha iyi sonuç bulundu. Teknik Hususlar: Bu prosedür ile sunulan görüntülemede zorluk çok erken embriyolar mikroenjeksiyon tekniği yanı sıra teknik zorluklar içerir. Microinjections agaroz enjeksiyon ped kalınlığı ile ilgili olarak, başarılı enjeksiyon için kritik öneme sahiptir. Pedi çok kalın ise, solucanlar dessicate ve hızlı bir şekilde ölecektir. Pedi çok ince ise, solucanlar enjeksiyon işlemi sırasında ped sopa olmaz. Erken embriyolar sıcaklık ve tampon koşulları gibi çevre koşullarına duyarlı olabilir. Vahşi tip embriyolar sperm DNA ve mayoz II (4) tamamlanması bir kaç dakika içinde pronükleer göç decondensation başlatmak gerekir. 20 dakika içinde, ilk sitokinez başlamalıdır. Embriyolar çok yüksek lazer yoğunluğu maruz veya aşırı ısınmış olan ya da montaj sırasında ezilmiş, bu süreç kesintiye olabilir. Bu tür embriyoların gelişimi tutuklama. Bu durum ortaya çıkarsa, deney lazer güç azalması veya kalın bir agaroz pad ile tekrar edilmelidir. C. elegans embriyolar döllenmeden hemen sonra kadar yumurta kabuğu salgılamaya yoktur. Döllenme ve yumurta kabuğu salgılanmasını arasındaki kısa süre içinde, embriyoların anne (11) dışında üstesinden değildir. Bazı laboratuvarlar in utero görüntüleme embriyolar (5, 12) Bu sorun kaçınılması görüntüleme Uterus içinde döllenme sırasında veya hemen sonra meydana gelen olaylar yakalama yeteneği gibi bazı avantajlar sunmaktadır . Ancak, bu teknik derin doku görüntüleme sağlayan mikroskop sisteminin kullanımını gerektirir. Bu iki foton veya çoklu foton gibi sistemler, özellikle bu (13, 14) için uygundur. Geleneksel bir lazer tarama ya da disk konfokal mikroskop iplik, en iyi görüntü embriyolardan elde edilen ha kullanırkenve erişkin solucan, burada açıklandığı gibi kesilmiş. Görüntüleme Sistemi Hususlar: Tür kullanılır konfokal görüntüleme sistemi, kullanıcıların ihtiyaçlarına bağlıdır. Genel olarak, bir dilek, mümkün olan en yüksek çözünürlükte görüntüler elde etmek için lazer tarama sistemleri tavsiye edilir. Öte yandan, görüntü elde görece hızlı ve photobleaching / fototoksisite azalır gibi dönen disk sistemleri daha iyi görüntüleme son derece dinamik süreçler için uygundur. Özel görüntüleme parametreleri deneysel tasarım ve istihdam konfokal görüntüleme sistemi bağlı olarak değişecektir. Çok boyutlu görüntüleme, toplanan kanallar, odak düzlemleri ve zaman noktalarının sayısını dikkate almak gerekir. Photobleaching ve fototoksisite sınırlayıcı etkileri nedeniyle herhangi bir deneyde, sonlu bir sayıda görüntü elde edilebilir. Böylece elde edilecek kanal sayısını artırmak için seçerseniz, büyük olasılıkla, odak düzlemleri ve / veya zaman noktaları ve tersi sayısını azaltmak için ihtiyacınız olacak. Elde edilecek görüntülerin toplam sayısı yanı sıra kullanılan konfokal mikroskop hassasiyeti gibi görüntülü olmak fluorofor yoğunluğu etkisinde olacak. , Daha yoğun fluorophores ve daha hassas aletler gerektirmez ve daha kısa pozlama süreleri, böylece daha az photobleaching ve fototoksisite üretecek. Çok sayıda veya görüntüleme sistemleri mevcuttur. Biz kendi laboratuvarlarında kullanılan sistemler hakkında bilgi verecektir. Disk konfokal mikroskopi iplik görüntüleme solucan embriyolar için, biz Planı Apo amacı NA 60X/1.4 ile donatılmış Nikon TE2000U inverted mikroskop kullanıyoruz. Mikroskop Yokogawa CSU10 dönen disk ünitesi, bir Hamamatsu C9100-13 EM CCD kamera ve Spektral Uygulamalı Araştırma LMM5 lazer birleştirme modülü 405 çıkışı ile dört katı hal lazerleri içeren, 491, 561 ve 655 nm bağlıdır. Bu sistemi kullanarak bir ya da iki kanal, altı ila on iki odak uçaklar, ve 25 ila 50 timepoints arasında (30 ila 60 saniye aralıklarla) çekebilirsiniz. Tipik bir pozlama süresi 100 ila 200 milisaniye. Konfokal mikroskobi lazer tarama ile görüntüleme embriyolar için, 2 kanal ve dört katı hal lazerleri (405, 488, 555, ve 635 nm) ile donatılmış bir Zeiss LSM700 kullanın. Bu sistem, embriyo görüntüleme için kullanılan bir Plan-Apo 63X/1.4NA amacı ile bir Zeiss Axio Gözlemci inverted mikroskop eklenir. Sistem, aynı zamanda sınırlı bir görüntü işleme ve analiz sağlar görüntü alımı için Zeiss ZEN yazılımı kullanır. Iki fluorochromes görüntüleme, genellikle 1-5 odak düzlemleri (~ 0.5 mm dışında) toplamak ve bir Z yığını her 15 saniyede toplamak. Koleksiyonlar önemli photobleaching oluştu kadar devam etmektedir. Son kez hızlandırılmış video oluşturmak için, Z yığını görüntüler ZEN yazılımı maksimum projeksiyon aracı kullanılarak konsolide edilir. Videolar yazılım avi dosyaları olarak ihraç edilmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Kompozisyon </th></tr><tr><td> Yumurta Tampon </td><td></td><td></td><td> 5mM HEPES pH 7.2, 110mm NaCl, 4mm KCl 5mM Mg asetat, 5mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> Enjeksiyon Kılcal pipetleyin </td><td> Harvard Apparatus, Kent, İngiltere </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> İğne Çektirme </td><td> Kopf </td><td> Model 700C </td><td></td></tr><tr><td> Mikroenjektör Aparatı </td><td> TriTech Araştırma </td><td> MINJ-1 mikroenjeksiyon regülatörü </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans, erken gelişim süreçlerinin çalışmalarında sık sık bir model sistemi olarak kullanılmaktadır . Embriyolar, genetik kaynakları ve dönüşüm göreli kolaylığı şeffaflık C. yapmak niteliklerdir Erken embriyogenez için mükemmel bir model elegans. Lazer tabanlı konfokal mikroskopi ve floresan etiketli etiketleri, araştırmacılar, gelişmekte olan embriyonun özel hücre yapıları ve proteinlerin takip etmek izin verir. Örneğin, bir floresan etiketli boyalar kullanarak, lizozomlar ya da mitokondri gibi özel organelleri, takip edebilirsiniz. Bu boyalar yetişkin gonad mikroenjeksiyon sayesinde erken embriyo teslim edilebilir. Ayrıca, spesifik protein lokalizasyonu flüoresan protein etiketleri kullanılarak takip edilebilir. Örnekler Burada bir floresan lizozomal boya kullanımının yanı sıra floresan etiketli ve ubiquitin histon proteinler gösteren sunulmaktadır. Etiketli histon DNA görselleştirmek ve böylece hücre döngüsü aşamasında tanımlamak için kullanılır. GFP etiketli ubikuitin erken embriyo ubiquitinated veziküllerin dinamiklerini ortaya koymaktadır. Etiketli lizozomlar ve GFP Gözlemler: ubikuitin ubiquitinated veziküller ve lizozomlar arasında ko olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Lizozomal boya mikroenjeksiyon tekniği sunulmuştur. Transgenenic suşları üretme Teknikleri (1, 2) başka sunulmaktadır. Görüntüleme için, standart bir lazer tarama konfokal mikroskop ya da dönen bir disk konfokal mikroskop zaman atlamalı mikroskobu ile takip embriyolar yetişkin hermafrodit nematod kesip ve% 2 agaroz pabuçlarına monte edilmiş. Bu metodoloji, yüksek çözünürlüklü görünüm için erken embriyogenez sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir tekniktir<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.8K Görüntüleme.  University of Alabama in Huntsville. Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir tekniktir Caenorhabditis elegans.

Video: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Biyoloji

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...