Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği (PF-07-103-01-CSM), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM61275 ve P30 CA042014), Lösemi ve Lenfoma Derneği ve Huntsman Kanser Vakfı tarafından desteklenmiştir.

siRNA transfeksiyon ve hücre hazırlama <ol><li> 4-iyi LABTEK II odacıklı coverglass fibronektin (10μg/mL) kullanılacak her bir kuyunun 0.5mL ekleyerek hazırlayın. 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre ters transfeksiyon siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) kompleksleri hazırlayın. (100μL toplam) kullanılmak üzere odasına başına 24-iyi bir yemeğin iyi biri için önerilen miktarda kullanın. SiRNA transfeksiyon için benzer bir ürün / protokol ikame edilebilir. </li><li> Odacıklı coverglass kuyulardan fibronektin çıkarın. SiRNA / Lipofectamine RNAiMAX kompleksleri olacak her kuyuya 100μL ekleyin. </li><li> Kısım 20.000 histon H2B mCherry-ifade transfeksiyon karışımı içeren başına hücreleri (500μL). </li><li> Hücrelerin normal hücre kültür ortamı 1mL transfeksiyon karışımı değiştirmeden önce ~ 24 saat süreyle inkübe için izin verin. </li><li> Görüntü elde etme önce inkübe hücreler ilave bir 24 saat (48 saat sonrası transfeksiyon). </li></ol> Mikroskop kurulum ve görüntü alımı <ol start="7"><li> Görüntü elde etme kurulumu için üç ana bölümü vardır: 1) mikroskop sahnede oturuyor ve 37 sabit bir nemli ortamlarda muhafaza hücre inkübatör ° C ve% 5 CO 2; 2) otomatik bir sahne ile donatılmış bir inverted mikroskop, floresans ve aydınlık otomatik kepenkler ve otomatik filtre jantlar ve 3) bir yazılım aşamasında entegre ve kontrol paketi, panjurlar, ve filtre tekerlekler. Görüntüleme kurulumda, LABTEK II odacıklı coverglass kullanılabilir OKO Lab özelleştirilmiş bir hücre inkübatör kullanın. Sahne, panjurlar, ve filtre çarklarını Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilir İpucu: OKO Lab sahne top inkübatör sistemi farklı tabak, çanak, veya lamel boyutları çeşitli adaptörler içerir. </li><li> Inkübatör, önceden ısıtılmış ve dengelenir kuluçka kapak açma, adaptör odacıklı coverglass yerleştirerek ve modelleme kil ile yer tutan LABTEK II odacıklı coverglass Pozisyonu. Hücre kültürü orta kurumasına olacağını odacıklı coverglass kapağı bırakın. Kapağını kapatın ve yerinde inkübatör sıkıca tutulur sağlanması, mikroskop sahnede tüm inkübatör pozisyon. </li><li> Metamorph kullanarak, yazılım menü çubuğunda &quot;Apps / çok boyutlu Toplama&quot; seçerek deney kurdu. Bu, timelapse sıklığını ve uzunluğunu seçebileceğiniz bir pencere açılacaktır, her renk için, pozlama süresi (eğer birden fazla ayar yapıyor), sayısı ve konumu sahne pozisyonları ve z bölümlerin sayısı (eğer arzulanan). Veri dosyaları nereye kaydedeceğinizi seçin İpucu: Eğer Metamorph başka yazılımı kullanarak, işlevleri biraz farklı olabilir, ama genel bir kavram aynıdır . Micromanager, çoğu donanım kurulumları ile uyumlu bir açık kaynak ImageJ tabanlı satın alma yazılımı, mükemmel bir alternatif. </li><li> Bu protokolün amaçları için, biz iki dalga boylarında (aydınlık ve mCherry) 15 sahne pozisyonları İpucu az 8 saat boyunca her 15 dakikada bir görüntü kazanacaklardır: daha iyi bir zaman çözünürlük istenirse, daha sonra satın almalar arasındaki zaman aralığını kısaltabilir, ancak , sahne pozisyonları daha az kullanılır ve böylece daha az mitotik hücrelerin analiz için uygun olacaktır. Zaman aralıklarında filtre setleri arasında geçiş yapmak için filtre tekerleği için gerekli olan süre dikkate almak dikkate alındığında önemlidir. </li><li> Ilk hücreleri aydınlık aydınlatma kullanarak bir alanda odaklanarak her dalga boyu için en uygun pozlama süresi belirleyin. Yazılım, sadece aydınlık kanal (bu her ediniminden önce her aşamasında pozisyon için yazılım otofokus izin verecek) İpucu otofokus fonksiyonu ayarlayın: Biz petrol gerek kalmadan mükemmel çözünürlük vermek için 40x kuru faz-kontrast objektif . Diğer hedefler istenilen optik çözünürlüğe bağlı olarak kullanılıyor olabilir. </li><li> MCherry dalga boyuna geçin ve 50 milisaniye maruz kullanarak bir görüntü ek bileşenini. Maruz kalma süresi, iyi bir görüntü görmek için gerekli minimum ayarlayın. Sürekli hücre canlılığı sağlamak için ışığa maruz kalma miktarı sınırlamak için esastır. Genel bir kural olarak, bu en iyi aydınlatma gücünü artırarak yerine nötral yoğunluk filtresi (ikaz ışık akısı azaltmak için) ve daha uzun bir kamera maruz kalma süresi ile elde edilebilir. Kullanılmak üzere herhangi bir ek dalga boyları için bu yordamı yineleyin İpucu: Denemeniz için belli bir maruz kalma, uzun süreli hücre canlılığını belirlemek için, geçici olarak timepoint boşluk ayarlayarak istenilen timelapse üzerinde bir hücrenin hayatta resimlerin toplam sayısı önizleme. saniyeye kadar dakika (yani, 10 dakika 10 saniye olur). Hücreleri 100-200 maruz kalma (ya da hayattauygun sayıda), daha sonra pozlama. Aksi takdirde, uyarma ışık, maruz kalma süresi, ya da tam deneyi simüle etmek için resimlerin toplam sayısını azaltır. </li><li> Sonraki seçin ve uygun sayıda hücre popülasyonu yeterli örnekleme ulaşmak böylece bir sahne pozisyonları işareti. Metamorph pozisyonlar kaydetmek ve her elde etmek için orada dönecektir İpucu: Ben genellikle bol hücre görüntü var olan konumlarını bulmak için çok yoğun olduğu pek çok deneyin değil. Ayrıca, hücrelerin mitoz yoluyla ilerleyen çok sayıda gözlemleyerek iyi bir şans olacak, böylece yeterli pozisyonları seçmek için önemlidir. </li><li> Tüm timelapse, dalga boyu maruz kalma süresi ve sahne konum bilgisi kaydedildikten sonra, yazılımın uygun ekipman kontrolü olup olmadığını belirlemek için ekrandaki &quot;Önizleme&quot; butonunu seçin. </li><li> Gibiyse, satın alma başlamak için ekranda &quot;Acquire&quot; düğmesini seçin. Sonra arkanıza yaslanın ve işi yapmak için bilgisayar ve mikroskop izin İpucu: her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için en az bir tam tur satın alma yoluyla otomasyon dikkat edin. </li></ol> Görüntü işleme ve analiz <ol start="16"><li> Satın alma işlemi tamamlandıktan sonra, bir sonraki adım, görüntü veri aktarmak için kolay bir forma. Bu protokolün amaçları için, ben sonra ImageJ programı kullanarak görüntü montajı nasıl oluşturmak için, sinema Metamorph kullanarak nasıl oluşturmak için ilk olarak gösterecektir. Her iki formatı kantifikasyon amaçlar için faydalı olacaktır. </li><li> Verileri gözden geçirmek için ilk adımı. Bunu yapmak için, menü çubuğunda &quot;Apps / İnceleme çok boyutlu Data&quot; seçeneğini seçin. Dosyalarınızı konumu seçin, daha sonra &quot;Görünüm&quot; seçin. Bu görüntülerin yığınını tek tek her aşamasında pozisyonunu gözden geçirmek için izin verecektir. Istenilen sahne konumu seçin, daha sonra &quot;Görüntüler Load&quot;. Veri kare kare ilerlemek mümkün olacaktır. </li><li> Hücreleri mitoz (as hem de DNA ve hücresel morfoloji tarafından belirlenir) geçmesi, bu aşamada pozisyonlar için, sinema ve montajı Metamorph kullanarak yapmak veya ImageJ (NIH üzerinden ücretsiz kullanılabilir) gibi diğer programlar ile yapabilirsiniz. </li><li> Metamorph bir film yapmak için, &quot;Süreç / film kaydet&quot; seçeneğini menü çubuğu. Kullanmak üzere kare, hız ve film dosya türünü seçmek mümkün olacak. Daha sonra &quot;Kaydet Movie&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Bir montaj yapmak için, ben, ImageJ gibi diğer programlar kullanılabilir. Stk dosyası olarak resim yığını. </li><li> ImageJ dosyayı açın ve mitoz geçiyor bir hücre bulana kadar kare ilerlemek. Bitkisel ve hücre çevresindeki alan &quot;Resim / Duplicate&quot; seçeneğini seçin İpucu: tüm kareleri çoğaltmak için emin olun. </li><li> Bir montaj yapmak için, &quot;Görüntü / Bacalar / Montaj yapma&quot; seçin menü çubuğunda. Burada montaj boyutu ve şekli dahil etmek istediğiniz kareleri belirtmek ve çerçeveleri arasındaki sınırları isteyip istemediğiniz. Bu seçin ve &quot;Tamam&quot; tuşuna basın. İpucu:. Montaj tif dosyası olarak kaydedin ve ImageJ veya Adobe Photoshop ya da başka bir işlem yapmak daha kolay görüntü işleme için 8-bit formatına Metamorph tarafından kullanılan 16-bit formatında montaj dosyaları değiştirin . </li><li> Mitoz farklı aşamalarında zamanını hesaplamak için, kromozomların ekvator (zaman profaz / prometafaz), çerçeveler hizalanır kadar kromozom tefrikine başlayana kadar t = 0 (DNA yoğuşma veya hücre yuvarlama ilk işareti), kare sayısını belirlemek (metafaz zaman), ve çerçeveler hücreleri (anafaz / telofaz / sitokinez) düzleştirmek için başlayana kadar. Her mitoz aşamasında hesaplanan zaman her kare arasındaki zaman aralığını bağlıdır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> Şekil 1 tipik bir kontrol siRNA transfeksiyon deneyi histon H2B mCherry ifade HeLa hücre satırını kullanarak elde edilen sonuçları göstermektedir. Bu yöntem, mitotik zamanlama geç mitoz 1 zamanlaması nucleoporin Nup153 için beklenmedik bir rol açığa ölçmek için etkin olmuştur. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> .

<ol>
	<li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis.">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression.">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li><li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy.">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li><li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells.">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li><li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC/C(Cdc20)+in+interphase.">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li><li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation.">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li><li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina.">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li><li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy.">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li><li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization.">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li><li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling.">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li><li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells.">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li><li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities.">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li></ol>

Görüntüleme ve floresan protein teknolojisi son gelişmeler, canlı görüntüleme 2 hücresel analizi rutin bir özelliği haline gelmiştir. GFP, çeşitli (ve diğer renk çeşitleri 3) etiketli proteinlerin yaygın olarak kullanılabilir ya da inşa etmek nispeten kolay ve hücre bölünmesi işaretlerinden DNA / kromozom dinamikleri 4, 5, centrosome çoğaltılması 6, siklin B dinamikleri de dahil olmak üzere bir dizi izlemek için kullanılan olabilir 7, nükleer zarf arıza ve montajı 8, 9, mitotik iğsi oluşumu 10, ve 11 sitokinez çeşitli aşamalarında. Floresan etiketleri uyarma / emisyon spektrumları uyumlu Takip edilen proteinler, belirli olaylar arasında koordinasyon değerlendirilmelidir sağlayan tek başına veya birlikte olabilir. Büyük, mekansal ve / veya zamansal çözünürlük / istenirse, konfokal mikroskobu, lazer tarama, dönen disk, ya da rezonans tarama kullanılabilir olup olmadığını ve giderek artan çözünürlük ile gelişmiş mikroskopi seçenekleri listesi büyümeye devam ediyor. Memeli hücrelerinde mitoz Canlı görüntüleme de yüksek verimli RNAi ve küçük molekül ekranları 12-14 kullanım için adapte edilmiştir. Böylece, bu tekniği kullanarak ilk deneyler, nispeten basit olabilir iken, bu strateji üzerine inşa olanakları geniştir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13778-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>12-565-337</td>
<td>Additional chamber sizes are available</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F1141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage-top cell incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OKO Lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Automated inverted fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Software package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Metamorph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate software</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

time-lapse imaging of mitosis after sirna transfection

Genomik ve hücresel içeriği doğru miras sağlamak için hücresel organizasyonu ve mitoz sırasında oluşan kromozom dinamikleri değişiklikler sıkıca koordine edilmektedir. Hallmark mitoz kromozom hareketi gibi olaylar, GFP etiketli özel proteinleri ifade memeli hücre hatlarının zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanarak bireysel bir hücre bazında kolayca takip edilebilir. RNAi tabanlı tükenmesi ile birlikte, bu belirli bir protein düzeyi düşürüldü sonra kusurları meydana gelen mitoz aşamasında saptayarak (ler) için güçlü bir yöntem olabilir. Bu protokol, mitoz zamanlaması üzerinde potansiyel bir mitotik düzenleyici protein tüketen etkisini değerlendirmek için basit bir yöntem mevcut. Hücreler, siRNA transfekte bir sahne üstü kuluçka odasına yerleştirilen ve otomatik bir floresan mikroskop kullanarak görüntülü. Biz nasıl hareketsiz görüntü montajı ya da film ya da yapmak için görüntüyü dizileri işlemek için zaman atlamalı bir deney, yazılımı kurmak için nasıl kullanılacağını tanımlamak, ölçmek ve ifade eden bir hücre hattı kullanarak mitotik aşamaları zamanlama nasıl analiz mCherry histon H2B etiketli. Sonuç olarak, zaman atlamalı bir deney tasarımı için önemli noktalar tartışacağız. Bu strateji, diğer yaklaşımlar tamamlayıcı ve hücre döngüsü, ilaç tedavileri ile senkronize etmek için gerek kalmadan bir nüfus ve mitoz 2) analizi gibi hücre bakarken gözlenen olmayabilir kinetiği) hassasiyeti 1 avantajlar sunuyor. Gibi görüntüleme deneylerinden elde edilen görsel bilgi sadece mitoz alt aşamalarda değerlendirilebilir sağlar, ama aynı zamanda FACS hücre döngüsü analizi ortaya olmazdı beklenmedik içgörü sağlayabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Görüntüleme.  University of Utah. İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Video: Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Biyoloji

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...