Hibe desteği: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), Biophotonics Bilim ve Teknoloji (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Kalın) için NSF FİZ-0.120.999 Merkezi, Araştırma Norveç Konseyi, Leiv Eiriksson Seyahat Bursu 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung de Auburn Topluluk Kanser Vakfı Fonu&#39;nun desteğiyle kabul eder. RJ Kalın da J. McDonald bağış desteği kabul eder. Biz ADI cömert temini için Dr Jenny Wei-Jen Kung ve DesigneRx Dr Bor-wen Wu teşekkür ederim.

1. Bölüm 1: Hücre Kültürü ve Immuno-floresan Etiketleme <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / glutamin ihtiva eden RPMI (Mediatech, VA) ile 6-delikli plakalardaki yerleştirilen cam lamelleri (# 1.5 ve 170 mikron kalınlığında) ilgili RV1 CWR22 insan prostat tümörü hücrelerinin büyümesini. </li><li> Fosfat tamponlu salin (PBS) arginin deiminaz (ADI, 0.3 ug / ml) ile muamele etmek suretiyle seçilmiş örnekler Otofaji neden olur. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, lamel başına 100 ul; PBS ile seyreltilerek% 4 paraformaldehit (PFA, Fisher Scientific, NH) ile hücreleri saptamak. </li><li> 1 mi HBS / BSA ile 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika için HEPES (HBA) / BSA, lamel başına 100 ul,% 0.05 saponin (Sigma, MO) ile hücre geçirgenliği. </li><li> Önceki immüno-etiketleme, sadece HBS / BSA, lamel başına 100 ul,% 2.5 kazein (Sigma, MO) ile, oda sıcaklığında 1 saat boyunca blok örnekler. </li><li> % 2.5 kazein / HBS / BSA, coversl başına 100 ul seyreltilmiş primer antikorlar ile sabit hücreleri inkübe4 de ip, O / N ° C </li><li> 1 mi HBS / BSA ile 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> , Oda sıcaklığında, 1 saat boyunca,% 2.5 kazein / HBS / BSA, lamel başına 100 ul seyreltilmiş sekonder antikor ile sabit hücreler inkübe edin. </li><li> 1 mi HBS / BSA ile 3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> Slowfade Altın düzenli cam mikroskop slaytlar hazırlanmış lamelleri monte veya 4 içeren Altın antifade reaktif (Invitrogen, CA) &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) uzatır. </li><li> Oje ile Seal lamel kenarları. En iyi görüntüleme sonuçlar için, anti-solmaya medya için zaman (ideal O / N) iyice hücreleri girmesine izin verir. </li><li> Metanol ve / veya kloroform ile temiz lamel yüzey. </li><li> Immersiyon (kırılma indeksi 1.520 görüntüleme 37 ° C veya 1.516 oda sıcaklığında görüntüleme) 60X 1.42 NA objektif lens (Olympus, Japonya) için. Ekle </li><li> Pozisyon mikroskop sahnede slayt ve ilgi hücreleri ile odak kurmak. </li></ol> 2. Bölüm 2: Canlı Görüntüleme için hazırlanması Hücreleri <ol><li> CWR büyütün35 mm poli-D-lisin kaplamalı cam-alt kültür kaplarına (Mattek, MA) üzerinde,% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren RPMI kültür ortamı yeşil floresan protein birleştirilmiş hafif zincir 3 (LC3-GFP) ifade 22 RV1 hücreleri. Hücreler hızla yayılması kolaylaştırmak için yeterli yoğunlukta kaplama, ama o kadar çok hücreler büyümüş ve görüntüleme zaman clumped olduğunu. Olmalıdır </li><li> PBS ADI (0.3 mg / ml) ile seçilen hücre örnekleri davranın. </li><li> Görüntüleme önce yaklaşık 1 saat, Lysotracker ile kırmızı DND-99 (Invitrogen, CA) 20 ml RPMI 1.5 ul sulandırmak. % 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren. Seçilen örnekler için ADI içeren çözümler kullanın. ° C önce kültür çanak içine ekleyerek 37 tüm medya sıcak. </li><li> RPMI 37 ° C&#39;de 15-45 dakika boyunca Lysotracker Kırmızı DND-99 içeren hücrelerin inkübe </li><li> Görüntüleme önce yaklaşık 30 dakika, WeatherStation çevre muhafaza açmak ve 37 gelmesini sağlayınız ° C ve% 5 CO 2 (gösterilmeyen nem ileIED hava). </li><li> PBS ile hücreleri yıkayın ve standart RPMI sadece% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren medya değiştirin. Belirtilen örnekler ADI ekleyin. </li><li> Montaj 35 mm coverglass-alt kültür özel adaptörü (Hassas, Inc, WA Uygulamalı) yemekleri, ve mikroskop sahnede konumu. 60X 1.42 NA objektif lens üzerine immersiyon (kırılma indeksi 1.520) kullanın ve sahnede monte kültür çanak yerleştirin. </li></ol> 3. Bölüm 3: Dekonvolüsyon Mikroskopi ve Analiz Bu bölümdeki protokol DeltaVision Kişisel DV deconvolution mikroskop ve ilgili Softworx uygulama paketi (Uygulamalı Hassas, Inc, WA) kullanımını varsayar. <ol><li> Satın alma iş istasyonu ve cihaz kontrol dahil olmak üzere, mikroskop sistemi açın. Xenon ışık kaynağı mikroskop sahne ve dönüş başlatmak için Resolve3D uygulamasını açın. Isınmak ve istikrarlı koşullar ulaşmak için ışık kaynağı için 10 dakika izin verin. </li><li> Bir eklemedaldırma petrol damla 60X 1.42 NA objektif lens ve objektif lens üzerinde merkezi slayt örneği (aşağı kapak kayma yüz) üzerinde (37 canlı örnekler için kırılma indeksi 1.520 ° C veya oda sıcaklığında sabit örnekler için 1.516). </li><li> Daldırma yağ boncuk ters cam kapak ile temas edene kadar ya parlak alan veya Sokak aydınlatma ve kaba odağı ayarlamak düğmesini kullanarak, yavaşça objektif lens yükseltmek. (Bu noktadan sonra, hücre tabakası ince odak topuzu ayarlamak birkaç tur içinde odak noktası haline gelmelidir). Slaytlar üzerinde sabit örnekleri ile çalışırken, bu kabarcıkları ile herhangi alanlarda veya yakın hücreleri önlemek için tavsiye edilir. Cam alt çanak canlı örnekleri ile görüntülerken, cam lamel sınır dışında objektif lens hareket kaçının. </li><li> Autophagosomes EGFP sinyali (yeşil) tarafından tespit edilebilir. Lizozomlar Lysotracker Kırmızı (canlı örnek) ya da anti-LAMP1 floresan antikor (sabit örnek) ile tanımlanır. Hücre çekirdekleri DAPI st ile tanımlanır(sabit örnek) Aining. </li><li> Görüş istenen alanı seçin. İdeal olarak, hücreler tüm uygun kanalları iyi floresan sinyal göstermelidir, ve yeterince bağlı ve hücre içi içeriği görselleştirmek kolay böylece lamel yüzeyine yayılmış. Yan x, y ve z,-odak küçük ayarlamalar Acquire3D arabirimini kullanarak bilgisayar tarafından kontrol edilebilir. Görmek istenen alanı (daha fazla hücre binning 2x2 olarak ayarlanır alanında görülebilir) bağlı olarak, 1x1 veya 2x2 için binning ayarlayın. </li><li> Bir hücrenin midsection ile belirli bir görüntü için, maksimum piksel yoğunluğu 3.000 sayıları aşmayacak şekilde maruz kalma parametreleri (örneğin% iletim gücü ve maruz kalma süresi) ayarlayın. Genel olarak,% iletim 1 sn üzerinde olan k pozlama süresi artırmadan, mümkün olduğu kadar düşük ayarlanmalıdır. En yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için görüntülü her floresan renk ve görüş her bir ayrı alan için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> U ayarlayınsırasıyla, hücre numunesinin üst ve alt kısmına sadece biraz odaklama ile Z-yığının pper ve alt limitleri. Resimlerin sayısı Z-yığın verilen bu nedenle bu sınırları ile ve tabakalar (: 0.2 um bir varsayılan değer) arasındaki boşluğu ile belirlenecektir. </li><li> Görüntü alımı sırasında hareket eserler en aza indirmek için, sabit örnekler için &quot;sonra dalga boyu z-yığını&quot; ve &quot;z-yığını dalga boyu&quot; canlı örnekleri için için görüntü elde etme modunu ayarlamanızı öneririz. </li><li> Floresan görüntüleri Softworx (Uygulamalı Hassas, WA) kullanarak deconvolved ve daha sonra (Perkin Elmer, MA şimdi, Doğaçlama) Volocity kullanılarak analiz edilmektedir. </li></ol> 4. Bölüm 4: Süper çözünürlüklü, Yapısal-aydınlatma (OMX) Mikroskopi Bu bölümdeki protokol OMX Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskop kullanımı (Uygulamalı Hassas, WA) için de geçerlidir. <ol><li> Ana güç ve istenilen lazerler (410 nm, 488 nm, ve / veya 532 nm) açın. 20 mi bekleyinn lazerler için termal stabilize edilecek. </li><li> 60X 1.42 NA objektif lens üzerine daldırma yağ (oda sıcaklığında sabit numuneler için kırılma indeksi 1.516) ekleyin. Kabarcıklar yağ damlacığı görülür ise, amacı temiz ve tekrar yağ ekleyin. </li><li> Sahnede ve gerekirse örnek slayt yerleştirin, hücreler için 10 dakika lamel yerleşmek için izin. </li><li> Satın alma programı başlatılamıyor. Hücrenin keskin bir taslak görülebilir kadar Odağı ayarlamak için floresan aydınlatma kullanın. (Bakım gerçek görüntü elde etme kadar, floresan uyarma için hücrelerin maruziyeti en aza indirmek için her zaman alınmalıdır). </li><li> Bir spiral mozaik tarama ilgi hücreleri veya bölgeleri seçmek için örnek geniş alanlar önizleme elde edilebilir. Bu örnek tarama veya hedefleri bulurken kısa pozlama süreleri (1-10 msn) ve düşük uyarma gücü (0.1-1% iletim) kullanılması tavsiye edilir. </li><li> GFP-LC3 floresan tarafından autophagosomes belirleyin. Alexa Fluor 555 anti-LAMBASI tarafından lizozomlar tespit(Lizozom ilişkili membran proteini) ve DAPI (sabit örnekler) kullanarak hücre çekirdekleri. </li><li> Dalgaboyu, görüntü alanı (örneğin 512x512), yığın kalınlığı, maruz kalma süresi ve lazer iletim oranı dahil olmak üzere deneysel koşullar seçin. Süper karar görüntüler için, yapısal aydınlatma seçeneği etkin olduğundan emin olun. OMX deconvolution mikroskopi için, geleneksel aydınlatma seçeneği seçin. </li><li> En iyi sonucu elde etmek için yeniden, maksimum yoğunluğu sayısı satın alma sırasında 10,000 ila 15,000 olduğunu bu deneysel koşullar seçin. Photobleaching bir endişe ise, daha düşük bir pozlama (5.000 ve 10.000 arasında sayımı) de görüntüleme kullanılabilir. İdeal olarak, sayıları tüm toplama sırasında iki kat daha fazla azaltmak gerekir, ve dört kat daha fazla azalır kaçınılmalıdır. Eğer gerekli ise, sürekli yoğunluğu sayısı sağlamak için yığın kalınlığını azaltmak. Kamera çok fazla, 64.000 adet de doyururtensit Bu asla aşmamalıdır. Iyi örnekleri için,% 1 lazer şanzıman ile 10 olmak deneysel koşullar ~ 50 msn maruz kalma süresi bulundu. Tekrar tekrar görüntülenebilir parlak ve fotostabil örnekleri tercih edilir. İstikrarlı leke zaman atlamalı, süper çözülmesi görüntüler için gereklidir. </li><li> Gürültü, bir 95MHz okuma hızı (Orta hız seçeneği) ve 2 milisaniye veya daha fazla satın alma süresini azaltmak için tavsiye edilir. Artan eserler örnek satın alma sırasında hareket yeniden görüntülü, elde edilir. Bu etkiler nedeniyle, kısa pozlama olmayan yapışık veya hızlı hareket eden hücreler için tavsiye edilir. </li><li> Çok kanallı görüntüleme aynı anda veya sırayla yapılabilir. Sıralı modda verim daha az çapraz konuşma ve böylece tavsiye edilir. </li><li> Photobleaching azaltmak için, genellikle ilk uzun uyarma dalga boyları (daha sonra 532 nm, 488 nm ve 410 nm) ile görüntü tavsiye edilir. Bununla birlikte, Şekil 3 &#39;de gösterilen deney sonuçları için, bu sırasını tersine olduBu özel örnek fotostabilite nedeniyle d (yani 48 nm, 532 nm ve 410 nm). </li><li> Hücrelerin üst / alt odak dışında biraz kadar mikroskop sahne hareket ettirerek Z-yığın üst / alt limit ayarlayın. Yeniden yazılım varsayılan olarak bu değeri almak gibi her resim arasında istenen mesafe, süper çözünürlük görüntüleme için 0.125 mikron sabit tutulmalıdır. </li><li> Softworx (Uygulamalı Hassas, WA) kullanarak görüntü yığınlarının yeniden ve Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA) kullanılarak analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

LC3 karşı floresan problar ile işaretli hücrelerin doğrudan gözlem yaygın otofajik yanıt 6, nicel 3D aynı sistem (yaptığımız gibi) görüntüleme hücresel otofaji karmaşık süreci hakkında benzeri görülmemiş bir bilgi ve ayrıntı sağlayan onaylamak için standart bir yöntem olarak kabul edilirken . Özellikle, canlı hücrelerde autophagosomes yüzlerce (yoksa bin) otofaji indüksiyon 80 dakika içinde oluşur görüyoruz. Benzer şekilde, otofaji indüksiyon sırasında lizozomal bölm...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

Cerrahi iktidarsızlık ve inkontinans önemli bir risk taşır iken Prostat kanseri ABD&#39;de erkekler arasında malignite önde gelen biçimidir, geleneksel kemoterapötik yaklaşımların büyük ölçüde başarısız olmuştur. Hormon tedavisi erken bir aşamada etkilidir, ancak genellikle hormon dirençli tümörlerin nihai gelişimi ile başarısız olur. Biz tümör hücrelerinin belirli metabolik eksikliği hedefleyen tedavi gelişmekte ilgi var. Yakın zamanda bu prostat tümör hücrelerinin, özellikle amino asit arginin 1 sentezinde yer alan bir enzim (argininosükinat sintaz veya ASS) eksikliği göstermiştir. Bu durum dışsal arjinin bağımlı hale için tümör hücrelerinin neden olur, ve ücretsiz arjinin arjinin deiminaz (ADI) 1,10 ile bittiği zaman metabolik stres tabi. Gerçekten de, insan prostat kanseri hücrelerinde CWR22 RV1 etkili kaspaz-bağımsız apoptoz ve agresif autopha ile ADI tarafından öldürüldü olduğunu göstermiştirgy (veya macroautophagy) 1,2,3. Otofaji hücreleri 4,5 beslenme açlık sırasında lizozomal arıza istenmeyen proteinleri metabolize sağlayan bir evrimsel-korunmuş bir süreçtir. Bu yolun temel bileşenleri 6,7,8,9 iyi karakterize olmasına rağmen, moleküler mekanizmasının birçok açıdan hala belirsiz - özellikle, ADI tedavi sonrası prostat kanseri hücrelerinin ölümüne-yanıt olarak otofaji rolü nedir ? Bu soruya cevap verebilmek için, biz hücrelerinde otofajik cevap düzeyi ve kapsamı ölçmek için deneysel bir yöntem gerekli - ve doğru bu süreci takip edebilirsiniz bilinen bir moleküler işaretleri olduğu için, biz kullanarak, bir görüntüleme-temelli bir yaklaşım geliştirmek için seçti nicel 3D floresan mikroskobu 11,12. Autophagosomes ve lizozomlar için floresan problar ile özel etiketli CWR22Rv1 hücreleri kullanarak, 3D görüntü yığınlarının wi ya ile elde olduğunu göstermektedirdefield deconvolution mikroskobu (ve daha sonra, süper çözünürlük, yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu ile) açıkça otofaji indüksiyon erken aşamalarında yakalayabilir. Piyasada bulunan dijital görüntü analizi uygulamaları ile, kolayca autophagosome ve lizozom sayısı, boyutu, dağılımı ve herhangi bir görüntülü hücreden ko derecesi hakkında istatistiksel bilgi alabilirsiniz. Bu bilgiler tam olarak canlı hücrelerin içinde otofaji ilerleme izlemenize olanak sağlayan ve kanser kemoterapi otofaji rolüne devam eden soruşturma sağlar.

Şekil 1 &#39;de gösterilen görüntü dizisi Otofaji oluşumunun ilk 80 dakika boyunca CWR22 hücrelerinde meydana gelen fiziksel değişiklikleri gösterir. Bu ve diğer çalışmalar (gösterilmemiştir) sürekli olarak gözlenen: uzak hücre merkezine çekirdeğin (1) değiştirme; odak yapışma noktaları (2) azaltılması ve ortasına doğru autophagosomes ve lizozomlar (3) Genel translokasyon Celi. Buna ek olarak, biz de daha sonra noktalarında autophagosomes (yeşil) ve lizozomlar (kırmızı...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

quantitative-analysis-autophagy-using-advanced-3d-fluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K Görüntüleme.  University of California, Davis. Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Video: Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...