Bu çalışma Sağlık R01 CA131990 (BFS ve RRM) National Institutes tarafından kısmen desteklenmiştir. Canlı hücre görüntüleme Karmanos Kanser Enstitüsü, Wayne State Üniversitesi Çocuk Sağlığı ve Gelişimi Ulusal Enstitüsü Perinatoloji Araştırma Şubesi tarafından NIH Merkezi hibe P30 CA22453 tarafından kısmen desteklenen Mikroskopi, Görüntüleme ve Sitometri Kaynakları Çekirdek yapıldı Wayne State Üniversitesi.

1. DQ-yüzeyler hazırlayın <ol><li> Izin DQ-substratlar 4 ° C&#39;de 50 ul hacimde ve deposuna, deiyonize su içinde DQ-substrat 1 mg / ml stok çözeltisi hazırlamak, açma şişeleri önce oda sıcaklığına kadar ısınması için bölünmeyi liyofilize </li></ol> Bu, ~ 50-5 dakika ve ısı ° C dispersiyon kolaylaştırmak için bir ultrasonik su banyosunda DQ-substrat çalkalamak için gerekli olabilir. <ol start="2"><li> 4, bir gece boyunca buz üzerinde çözünme RBM ° C; RBM her zaman buz üzerinde ele alınması gerekir. </li><li> 10X fosfat yapmak için tuzlu su (PBS), 80 g NaCl çözünmesi (1.37 M), 2 g KCl (0.027 M), 14,4 g 2 Na HPO 4 (1 M) ve 2.4 g KH 2 PO 4 (0.02 M) içerisinde tamponlu 800 ml saf su. 1.0 M HCl ile 7.4 PBS tampon çözeltinin pH ayarlayın. Hacmi 1 litre getir, filtrasyon ile sterilize edin. </li><li> Soğutulmuş kollajen I soğutulmuş 10X PBS 1 parçasına 8 ölçü: buz üzerinde kollajen I çözeltisi hazırlayın. PH ayarlamaKarışımın steril 0.1 M NaOH kullanılarak 7,2-7,6 için. PH şeritler ile pH kontrol edilir ve steril su ile 10 parça son ses seviyesini ayarlayın. </li><li> , Sırasıyla, 25 ug / ml, 2.4 mg / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon bir prechilled tüp içinde kollajen I çözelti içinde DQ-kollajen I seyreltilmesiyle kollajen I matris: DQ-kollajen I hazırlayın. </li><li> , Sırasıyla, 25 ug / ml ve 12-15 mg / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon bir prechilled tüp içinde RBM in DQ-kollajen IV (Cultrex ya Matrigel) seyreltilmesi ile sulandırılmış bazal membran (RBM) matris: DQ-kollajen IV hazırlayın. Kabarcıkları oluşmayacak şekilde nazik pipetleme kullanarak buz üzerinde karıştırın. </li></ol> 2. MAME cocultures hazırlayın Cocultures şematik bir diyagramını için Şekil 1 &#39;e bakın. <ol><li> Yeri 35 mm çaplı kültür kaplarına veya bir IbiTreat μ-Bulaşık 35 mm kullanan iki dikdörtgen plastik lamelleri (10 dakika ve hava-kuru% 70 alkol sterilize). Burada Tarifleri biz öğrencileri için kullandığınız, lamelleri ve μ-Yemekleri hem içindirdik bir mikroskop ölür. Inverted mikroskobu çalışmaları için, biz sadece μ-Yemekleri kullanın. </li><li> Kollajen I matris: DQ-kollajen I ile fibroblastların istenilen sayıda karıştırın. Kollajen I matris: Şekiller 2 ve 3 de gösterilen uzun süreli cocultures için, ortam 10 ul artı DQ-kollajen I, 60 ul içerisinde 500 fibroblastlar kullanabilir. </li><li> Dikkatli bir pipet, bir 100-ul micropipettor kullanılarak ve fibroblast 70 ul yayılır: DQ-kollajen I: kollajen I matris her lameller tüm yüzeyi üzerine ve katılaşmaya 30 dk için CO 2 olmadan nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C&#39;de bırakın. </li><li> Transferi 35 mm denge sağlaması için 10 dakika süreyle% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör için lamelleri içeren yemekler. </li><li> Inkübatör İzleme ve oda sıcaklığına gelene kadar başlık altında 35 mm yemekleri bırakın. </li><li> Katılaşmış DQ-kollajen I üstüne RBM matriks: gömülü fibroblastlar ile kollajen I matris DQ-kollajen IV 60 ul ekleyin. Pipet, caDQ-kollajen I: Ben kollajen matriks fibroblast tırmalama kaçınarak, eşit RBM matris: refully DQ-kollajen IV yayıldı. </li><li> Transferi 35 mm katılaşmaya 10 dakika süreyle% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör için lamelleri içeren yemekler. DQ-kollajen IV iken: RBM matris katılaşabilme olup, trypsinize ve epitel hücreleri saymak. </li><li> RBM matris: lamelleri üzerine bir epitelyal / tümör hücre süspansiyonu Yeri 50 ul DQ-IV kollajen ile kaplı. 37 ° C inkübatör içine lamelleri içeren Yeri 35 mm yemekler. RBM matriks: hücreler için 40 ila 60 dakika DQ-kollajen IV eklemek için izin ver. Şekiller 2 ve 3 de gösterilen uzun süreli cocultures için, 2500 epitel ya da tümör hücreleri kullanılır. </li><li> Her 35 mm çanak% 2 RBM içeren kültür ortamında 2 ml ekleyin. Herhangi bir ilaç tedavileri yaparak durumunda, ilaç bu zamanda ilave edilmelidir. </li><li> Görüntüleme önce zaman istenilen süre kadar inkübe edin. Uzun vadeli kültürleri, ortam, her 3-4 günde değiştirilmesi gerekir. Hücreler korunabilirnormal kültür ortamında. Meme hücre hatları MAME cocultures için, MEGM SingleQuots ile desteklenmiş Epitelyal Bazal Orta (MEBM-PRF) kullanın. </li></ol> 3. Konfokal mikroskopla canlı MAME cocultures ile 4D (3D + zaman) görüntüleme gerçekleştirin <ol><li> Resimli kanıt-prensibi çalışmalar için, MAME cocultures bizim yayınlanan prosedürü 1 &#39;e göre bir floresan hücre izleme boya ile işaretlendi. Görüntüleme önce,% 5 CO2 inkübatöründe ile 37 ° C PBS ile yıkama işleminden sonra, cocultures, bir 37 ° C inkübatöründe 45 dakika süreyle MEGM ortamı içinde 5 uM CellTracker Orange ile inkübe edildi PBS ile yıkanır ve 30 dakika süre ile inkübe önceden ısıtılmış MEGMmedium . </li><li> Görüntü MAME cocultures Zeiss LSM-510 META konfokal mikroskop düşük bir büyütme (10X, su daldırma lens) canlı. </li><li> Optik bölümlerde yapıların tüm derinliği boyunca aralıklarla yakalanır. Çalışmalarımız için, 10 optik kesitler yakalamakmikron aralıklarla. </li><li> 3D görüntüleri yeniden oluşturmak için optik bölümleri kullanın. Biz 3 boyutlu rekonstrüksiyon oluşturmak için Volocity yazılımı kullanın. </li><li> Hücre etkileşimleri ve çevresindeki matrisler ile etkileşimleri görüntülenebilmekte: yapılar, hücre böylece 3D rekonstrüksiyonlar filmleri olun. Biz QuikTime Player 7 ile film yaptı. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Geliştirdiğimiz bu MAME cocultures bir meme tümörü ve mikro oluşturan çeşitli hücresel bileşenlerin arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için uysal deneysel bir model vardır. Burada hücre özetlemek için MAME modellerin özelliğini göstermelidir: meme kanseri ilerlemesi sırasında ve canlı hücre görüntüleme hücre etkileşimleri zamanla bu etkileşimlerin takip etmek. Biz üzerinde, bir preinvaziv MCF10.DCIS insan meme hücre dizisi ve bir insan meme kanseri ile ilişkili fibroblast hattı, WS-12Ti arasındaki görüntü etkileşimleri yeteneğini göstermekkültürü fazla üç haftalık bir süre. Cocultures 3, 16 ve 23 gün sonra görüntülenmiştir. Cocultures tüm hacminin aracılığıyla optik bölümleri Şekil 2 içinde üç timepoints her biri için gösterilmiştir 3D ve temsili örnekler içinde yeniden edildi. Şekil 2 içinde kırmızı bir floresans MCF10.DCIS ve WS 12Ti hücreleri temsil eder. İki hücre tipleri arasında ve uzun vadeli cocultures için ayrımcılık için, bir kültür oluşturulması öncesinde floresan proteinleri ile bireysel hücre tipleri transferinde veya transdüksiyonu yapabilirsiniz. Farklı şekilde tanımlanması için flüoresan proteinleri ile etiketlenir MCF10.DCIS ve WS 12Ti hücre MAME kokültürü Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Birleşmeyle yüzeyler olarak, bu durumda DQ-kollajen içinde, MAME cocultures içine, biz bir invaziv fenotip geçiş ile ilişkili proteoliz zaman içinde değişiklikleri değerlendirmek ve ölçmek olabilir. Biz floresan parçalanma ürünleri ölçülmesi için yöntemlerin kurduk sonucuDQ-kolajen yıkımı 2,3 dan. Biz etiketleme ve hücre çekirdekleri sayarak başına hücre bazında MAME cocultures tüm 3D hacmi boyunca, yıkım ürünleri normalleştirmek. Ayrıca, hücre içi ve hücre bölmeleri bozulması lokalize ve daha önce 2 tarif ettiğim toplam, hücre içi ve hücre dışı yıkım ürünleri sayısal olarak. Şekiller 2 ve 3 in yeşil flüoresan iki DQ-kollajen yüzeyler arasında parçalanma ürünleri temsil eder. Bu zamanda, farklı şekilde-etiketli kollagenler bize tip I kollajen tip IV kollajen ve yıkımı bozulması ayırt olanak sağlayacak mevcut değildir. MAME cocultures içinde etkileşimler dinamiktir ve zaman içinde değiştirebilirsiniz. Temporal ve dinamik bilgi elde etmek için, aynı görüş alanında, hafta dakika bir süre boyunca sürekli hacminin tüm numune üzerinden alınan görüntülü ve optik bölümler olabilirBöylece 4-D veri toplama. Şekil 2, biz 23 gün içinde meydana oldukça dramatik değişiklikler gösterir: hücre sayısı değişiklikleri, hücre göçü ve hücre etkileşimleri, yapı birimleri, yapı şekilleri, küresellik gelen yapıların sapmalar, invaziv çıkıntılar ve proteoliz. Ayrıca, biz de bağlı MAME cocultures hacim genel bir değişikliği göstermek aşağılayıcı onların bu dönem boyunca hücre dışı matriks çevreleyen. Şekil 2A gösterildiği gibi üç gün, hacmi 110,000 mikron 3&#39;tür. Bunun aksine, 16 ve 23 gün sonra MAME cocultures hacmi olarak Şekil 2B ve C &#39;de gösterildiği sadece 46.250 um 3, olduğu <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig1.jpg" /> Şekil 1.. MAME cocultures. Şematik diyagramı Plastik coverslip DQ-I kollajen ve fibroblast (kırmızı) içeren, kollajen I ile kaplanmıştır. DQ-col içeren sulandırılmış bazal membran A 2. katman (RBM)lagen IV eklenir. Tümör hücreleri (kırmızı) üst kaplama ve kültür ortamına% 2 RBM overlaid (beyaz noktalar) medya her değişikliği ile olduğu edilir. Yeşil DQ-kollajen I ve IV floresan parçalanma ürünleri temsil eder. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig2.jpg" /> Şekil 2. MCF10.DCIS insan meme hücreleri ve WS-12Ti insan meme fibroblastların MAME cocultures. Fibroblastlar kollajen DQ-IV kollajen içeren RBM I / DQ-kollajen I ve overlaid gömüldü. DCIS hücreler daha sonra% 2 RBM içeren medya ile RBM ve overlaid üzerine ekildi. Cocultures hacminin düşürülmesi ile gösterildiği gibi burada gösterildiği kokültürü içinde 23 gün boyunca, hücre proliferasyonu, DQ-kollajen IV ve I (yeşil) ve kollajen matrislerin degradasyon yoktu. Hücreler görüntüleme (kırmızı) önce in situ CellTracker Orange ile etiketleyerek lokalizeydi. Aynı canlı cocultures c tarafından çekilen görüntüleri ile 23 gün boyunca gözlendikokültürü 3, 16 ve 23 gün sonra onfocal mikroskopi. , Optik dilim Volocity yazılım ile 3D olarak yeniden inşa edildi. Büyütme, 10X. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig3.jpg" /> Şekil 3. MAME 16 gün MCF10.DCIS insan meme hücreleri ve WS-12Ti insan meme fibroblastların cocultures olduğu sırasıyla ifade RFP (kırmızı) ve YFP (beyaz). Cocultures kurulmuş ve Şekil 2&#39;deki gibi analiz edildi. Burada gösterilen iki hücre tipleri, bununla birlikte, farklı şekilde birbirlerine ayırt edilebilir, böylece etiketli edilmiştir. Bu şekilde daha yüksek büyütmede görüntüler, Şekil 2 ile karşılaştırılması, DCIS hücreleri ve fibroblastlar yakınındaki alanda DQ-kollajen I yaygın proteolizin yüzeyinde DQ-kollajen IV proteoliz göstermektedir. Büyütme, 20X.

<ol>
	<li>Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+proteolysis:+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis.">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).</li><li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protease+activity+in+living+cells:+from+two+dimensions+to+four+dimensions.">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).</li><li>Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+hepatocyte+growth+factor+promotes+invasion+of+human+mammary+ductal+carcinoma+in+situ.">Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ.</a> Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+live-cell+imaging+demonstrates+that+beta1-integrin+promotes+type+IV+collagen+degradation+by+breast+and+prostate+cancer+cells.">Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells.</a> Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).</li><li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p21-activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer.">p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> Neoplasia. 10, 314-328 (2008).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantifying+the+dynamics+of+tumor+associated+proteolysis.">Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).</li><li>Cavallo-Medved, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+demonstrates+that+proteases+in+caveolae+of+endothelial+cells+degrade+extracellular+matrix.">Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix.</a> Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).</li><li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microvasculature+and+microenvironment:+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models.">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Gösterildiği gibi, MAME cocultures bir göğüs tümörü ve mikro oluşturan çeşitli hücresel bileşenlerin arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı canlı-hücre görüntüleme için kullanılabilir. Laboratuvarımızda devam eden çalışmalarda, biz proteolitik DCIS gelen invaziv duktal karsinom geçiş ile ilişkili yollar, yanı sıra kemokin / sitokin / büyüme faktörü yol olarak bu geçiş dahil proteolitik yolları ve diğer yollar arasındaki etkileşimleri belirlemek için MAME cocultures kullanm?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sulandırılmış bazal membran (Cultrex) </td><td> Trevigen </td><td> 3445-005-01 </td><td> Matrigel (BD Biosciences) ile karşılaştırılabilir </td></tr><tr><td> Kolajen I </td><td> Uyum Laboratuvarları </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> DQ-substratlar (Kollajen I, IV) </td><td> Invitrogen </td><td> DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 </td><td></td></tr><tr><td> 22-mm plastik lamelleri </td><td> Fisher Scientific Co </td><td> 12-547 </td><td> 10 dakika ve kullanılmadan önce hava-kuru% 70 etanol içinde bırakın, yarım kesilmiş. </td></tr><tr><td> Hücre kültürü ortamı </td><td> Lonza </td><td> MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 </td><td> Red-free Fenol </td></tr><tr><td> μ-Bulaşık ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity yazılım </td><td> Perkin-Elmer </td><td> Sürüm 5.5 </td><td> Görüntüleme yazılımının diğer markalar 3D rekonstrüksiyon ve film oluşturmak için kullanılabilir. </td></tr></tbody></table>

mame models for 4d live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression

Hücre etkileşimleri: Biz vadeli MAME (m ammary bir rchitecture ve m icroenvironment e ngineering) ve hücre gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için onları kullandığı, 3D kokültürü modeli geliştirdik. Genel hedefimiz invaziv fenotip onların ilerlemesini incelemek için preinvaziv meme lezyonlarının mimarisi recapitulate modelleri geliştirmektir. Özellikle, invaziv duktal karsinom için preinvaziv meme epitel hücrelerinin gelişimini arttırmak veya azaltmak suçlanmıştır tümör mikroçevresinin pre-malign meme epitel hücre çeşitleri ve diğer hücre türleri arasındaki etkileşimleri analiz modelleri geliştirilmiştir. Diğer hücre tipleri tarihe okudu myoepitelyal hücreler, fibroblastlar, makrofajlar ve kan ve lenfatik mikrovasküler endotel hücreleri vardır. Boyunca meme içinde hücresel etkileşimler recapitulate üzere tasarlanmıştır MAME modelleri, ek olarakkanser gelişimi, biz prostat kanserlerinin ilerlemesini için karşılaştırılabilir modeli geliştirdik. İşte biz, canlı hücre görüntüleme ve in situ meme duktal karsinom (DCIS) zamanla invaziv bir fenotipi hücreleri ve fibroblastların cocultures geçişini takip fonksiyonel bir proteolizin testinin kullanımı ile birlikte 3D cocultures kurma prosedürleri göstermek kültür yirmi üç gün boyunca bu durumda. MAME cocultures birden fazla katmandan oluşmaktadır. Fibroblastlar tip I kollajen alt katman gömülür. Bu on DCIS hücreleri tohumlanmış edildiği rekonstitüe bazal membran (RBM) bir tabaka yerleştirilir. % 2 RBM son bir üst tabakası dahil ve medya her değişikliği ile doldurulmaktadır. Invaziv bir fenotipi progresyonu ile ilişkili resmi proteoliz için, (DQ) boya-su verilmiş floresan matriks proteinleri (DQ-kollajen I rB orta tabaka ile karışık kollajen I ve DQ-kollajen IV tabakası ile karıştırılarak kullanılmasınıM) ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı kültürleri gözlemlemek. Optik bölümleri, yakalanan işlenmiş ve Volocity görselleştirme yazılımları ile 3D olarak yeniden inşa edilir. MAME cocultures 23 gün boyunca, DCIS hücreler çoğalır ve büyük istilacı yapıları birleşme. Fibroblastlar göç ve bu istilacı yapıları içine dahil olur. Kollajen of Fluorescent proteolitik fragmanları DCIS yapıların yüzeyi ile ilişki bulunur, intraselüler, ve aynı zamanda çevredeki matrisi içinde dağılmıştır. Hedef proteolitik, kemokin / sitokin ve kinaz yollar ya cocultures hücresel bileşiminde modifikasyonlar MAME modelleri yeni terapötik yaklaşımlar için klinik öncesi ekranlarını olarak kullanılabilir düşündüren, invaziv azaltabilir ilaçlar.

Watch this Scientific Journal Video about MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression at JoVE.com

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Biz onların mikroçevresindeki meme tümör hücreleri ve diğer hücreler arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için 3D kokültürü modeli geliştirdik bir invaziv fenotip darbe ilerlemesi. Bu modeller invaziv karıştığı parakrin kaynaklı proteolitik, kemokin / sitokin ve kinaz yolları hedefleyen ilaçlar için klinik öncesi ekranlar olarak hizmet verebilir.

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

mame-models-for-4d-live-cell-imaging-tumor-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

14.3K Görüntüleme.  Wayne State University. Biz onların mikroçevresindeki meme tümör hücreleri ve diğer hücreler arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için 3D kokültürü modeli geliştirdik bir invaziv fenotip darbe ilerlemesi. Bu modeller invaziv karıştığı parakrin kaynaklı proteolitik, kemokin / sitokin ve kinaz yolları hedefleyen ilaçlar için klinik öncesi ekranlar olarak hizmet verebilir.

Video: MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

İnsan Takip edilen-Lusiferaz Malign Periferik Sinir Kılıf Tümör Hücreleri Ortotopik Xenografting In vivo</emAday Terapötik Ajanlar> Test

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Tıp

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Fare Servikal lenf nodu Yüksek frekanslı Ultrasonik Görüntüleme

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Fare Lenfoma Modellerinde İzleme Tümör ilerleme ve Tedavi Etkileri Biyoparlaklık Tabanlı Tümör Niceleme Yöntemi

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...