Biz teknik destek için J. Cappellani ve J. Qiu ederim. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (U01 CA141451), Starr Kanser Konsorsiyumu, Cure için Susan G. Komen, Meme Kanseri, ME Meme Kanseri Karşı Manhasset Kadın Koalisyonu Mücadele Long Island 2 Günü Yürüyüşü&#39;ne ve fon tarafından desteklenen Congressionally Yönetmen Meme Kanseri Araştırma Programı öncesi-doktora bursu, ESNESN ABD ayrıca Biyolojik Bilimler Watson Okulu Leslie C. Hızlı ve William Randolph Hearst Vakfı Bursu sahibidir. HAA Norveç Araştırma Konseyi (160698/V40 ve 151.882), ve Güneydoğu Bölgesel Sağlık Yetkililer (2.007.060) fonları tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek hiçbir çıkar çatışması var. Tüm hayvan deneyleri IACUC onaylanan protokoller çerçevesinde yapılmıştır.

In vivo sistemik tedavilere tümörlerin yanıtları mikroçevrede akut yanıt ve nüks 5 hem etkiler olarak, in vitro kanser hücrelerinin olanlara ölçüde farklı olabilir. Vivo kemoterapi yolaklardaki açıkladıktan sonra büyük engellerden biri kanser hücreleri ve onların mikroçevrede arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı. Özellikle, katı tümörlerin ve kanser gibi anti-kanser tedavisi sırasında ortaya çıkan hücre ölümü olarak stromal hücreler, bir bileşenin bozulması arasında bir denge gelişmiş olduğundan, doku organizasyon üzerinde dramatik etkileri de neden olabilir. Burada sağlanan intravital görüntüleme tekniği anti-kanser ilaçlar ile tedavi sırasında canlı, anestezi farelerin tümörleri içinde kanser hücre-stroma etkileşimlerinin doğrudan görselleştirme sağlar. Biz (17 bkz göreceli sınırlı penetrasyon derinliği vardır iplik Disk konfokal mikroskopi, kullanın </)&gt; sup, ancak ameliyat ve etiketleme teknikleri mikroskopi diğer türleri ile de kullanılabilir. Bu deneylerden elde Filmler floresans şiddetindeki değişiklikleri (örneğin hücre ölümü etiketli nüfusu veya indüksiyon infiltrasyonu nedeniyle), hücre hareketi, enjektabl dağılımı (vasküler sızıntı izlemek için örneğin), ve eş-dahil süreçleri izlemek için kullanılabilir floresan sinyalleri 5,12,17,20 lokalizasyonu. Biz rutin görüntü 6 saatten fazla fareler ve 18 saat boyunca da yapılan görüntüleme. Bu bu uzun süreler için sürekli anestezi altında fareler bakımını gerektirir. Uygun anestezi ile, bizim hayvanların% 90 üzerinde 6 saat ayakta, ve yaklaşık% 80 18 saatten fazla yaşayamaz. Uzun süreli anestezi nasıl gerçekleştirileceği ile ilgili ayrıntılar daha önce 19 yayınlanmıştır. Bizim tecrübelerimize göre, beş faktör kritiktir: u, hipotermi kaçınarak dehidratasyon kaçınarak, fizyolojik kan oksijen doygunluk seviyelerini muhafazaizofluran için nemlendirilmiş taşıyıcı gaz şarkı, ve ağrı belirti görünmüyor hangi anestezinin en düşük düzeyde hayvanları tutmak. Vücut ısısını korumak için, biz (38 ° C&#39;de) ısıtmalı battaniye altında fare tutmak. Dehidratasyon önlemek için, tüm görüntüleme işlemi boyunca salin ip küçük hacimleri enjekte. Fizyolojik kan oksijen doygunluğu seviyesini korumak için, taşıyıcı gaz (yerine yaygın olarak kullanılan% 100 fazla)% 21 oksijen ile başlar. Saat bir deneme içine - - Bu bize bir fare eğer inhale oksijen seviyelerini artırmak için sağlayan kan oksijen doygunluğu bir azalma gösterir. Bizim tecrübelerimize göre, bu zamana (% 30-40 gibi) de inhale oksijen düzeyini artırmanın hemen hemen her zaman ek görüntüleme saat için izin hayvan stabilize edecek. Anestezi optimal düzeyde 60-65/min ve 400-450/min nabız oranları nefes oranları% 1-1.5 izofluran ve sonuçları ile elde en fareler içindir. Bizim görüntüleme deneylerinde, öncelikle transgenik fare modeli kullanıns (MMTV-PyMT ve C3 [1]-Tag) hangi tümörlerin tek bir görüntüleme oturumu sırasında birden çok x, y pozisyonlarında paralel tümör progresyonu farklı aşamalarında birden fazla lezyon görüntüleme için izin multifokal vardır. Bu aşama bağımlı terapötik cevapları tespitine yönelik deneylere göre fare-to-fare varyasyon ilişkin kaygıların azaldığı ve görüntüleme için gerekli hayvan sayısını azaltır. Intravital görüntüleme sırasında yapılabilir tümör lezyonlarının patolojik evreleme az detaylı farklıdır, ve her ne kadar MMTV-PyMT modeli (ve diğer spontan kanser modelleri) daha, intravital görüntüleme sırasında fark edilebilir ilerici histopatolojik aşamalardan geçer histolojik kesitler 5,17. Kanser hücreleri genellikle ilerlemiş tümörler izole olarak tersine, transplantasyon modelleri, en geç evre tümörlerde yansıtma eğilimindedir. Böyle bir model, böylece tümör-stroma eğitim için daha uygundurlarfarklı aşamalarında arasındaki bu etkileşimler farklılıkları daha geç evre tümörlerde etkileşimleri. Biz nasıl tedavi ile indüklenen hücre ölümü sonrası meydana görüntü nükleer yapısal değişikliklere ilişkin örnekler göstereceğiz. Anti-kanser tedavisi yokluğunda, bu strateji etiketleme yerine durulaştırmada, in situ görüntü hücre bölünmesi için kullanılabilir, örneğin, hücre proliferasyonu ve uyuşukluk mikroçevrede tarafından nasıl etkilenir. Gelecekte, mitokondriyal bileşenlerin fluoresan etiketleme apoptotik hücre ölümü esnasında meydana gelen görüntü mitokondriyal değişiklikler mümkün kılabilir. Bu protokolde, biz de diğer microenvironmental bileşenleri de görüntülenebilir ve görüntülü olabilir nasıl tedavi sonrası görüntü kanser hücre-immün hücre etkileşimleri, ancak örnekler göstermiştir. Stromal bileşenleri için mevcut transgenik muhabiri çizgiler (örneğin., FSP1-EGFP 17, αSMA-TTT 21, COL1A1-EG fibroblastlar için olanlar dahilFP 21) ya da damar hücrelerinde (örn. TIE2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital görüntüleme in vivo aşağıdaki kemoterapi yönetiminde meydana gelen etkileşimlere ve süreçlerin gerçek zamanlı görüntüleme sağlar. Teknolojisi mevcut, biz terapötik yanıtı nasıl etkilediğini miyeloid hücreler anlaşılmasında önemli ilerleme kaydettik; tümör mikro çok karmaşık çünkü ancak, önemli gelişmeler halen çevre aracılı ilaç direnci yatan süreçlere mekanistik defterleri başlamak için ihtiyaç vardır. Hala gerekli en önemli gelişmeler biri belirli bir hücre popülasyonu daha iyi belirleyiciler tanımlanmasıdır. Iyi belirteçlerin önemi de meme tümör mikro, fibroblastlar ve bağışıklık hücrelerinin en önemli stromal hücre bileşenlerinin iki gösterilmiştir. α-düz kas aktin (αSMA) sık tanımlamak için kullanılırfibroblastlar, fakat protein aynı zamanda, vasküler düz kas hücreleri ve myoepitelyal hücreleri 24 ile ifade edilir. ΑSMA-GFP muhabiri fareler mevcut olmakla Böylece, belirli bir hücre tipi belirlemede intravital görüntüleme deneme sırasında aşağıdaki olmak zordur. Benzer şekilde, c-fms promotörü altında ifade edilen bu tür EGFP gibi tek bir floresan işaretleyici sık sık 12,17 bağışıklık hücrelerinin çoklu alt popülasyonlar tespit edecektir. Biri ideal belirli bir hücre tipi tanımlamak için tek bir belirteç kullanmak istiyorum rağmen Böylece, temel biyoloji karmaşıklığı Bu yaklaşımı kullanarak önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bu problemin bir çözüm kısmi daha fazla aynı flüoresan raportör salgılayan hücrelerin alt popülasyonlar ayırt etmek için enjekte edilebilir etiket kullanmaktır. Örneğin, floresan dekstranlar makrofajlar tarafından alınır ve c-fms-EGFP ve Fsp1-EGFP raportör transgenik fareler ile etiketlenir makrofaj subpopülasyonunun etiketlemek için kullanılabilirler <sup&gt; 17. Flüoresan millerine konjuge antikorlar da belirli altgrupları (c-FMS-EGFP muhabiri 17 etiketli miyeloid hücrelerin Gr1-pozitif nüfus gibi) tanımlamak için kullanılır olmuştur. Nasıl ya da neden tümörlerin hayvanların büyük kohort gerektiren farklı zaman noktalarında hasat dokularından elde edilen idare terapötik veya histolojik serisi cevap hakkında az mekanistik bilgi vermek kumpas ölçümü, tarafından oluşturulan tümör yanıtı eğrileri aksine, bizim teknik doğrudan, ölçülebilir bilgi sağlar hücre ölümü dinamikleri ve küçük gruplarda kanser hücreleri ile stromal hücrelerin etkileşimleri. Bu nedenle, burada rapor edilen prosedür kullanılarak bir avantajı, gerçek zamanlı olarak bir dokunulmamış tümör mikro bağlamında ilaç etkileşimleri ile ilgili bilgi sağlar dinamik olmasıdır. Bu bilgiler 5 terapötik cevapları sürücü yatan süreçleri önemli bakışlar yol açabilir &lt;/&gt; Sup.

Tümör büyüme 1 için uygun bir ortam sağlamaya yardımcı kanser hücreleri ve stromal bileşenlerin (hücresel ve hücresel olmayan her ikisi): Solid tümörler iki ana bölmeden oluşmaktadır. Bunlar stromal bileşenlerin meme 2-5 de dahil olmak üzere kanser birçok türleri, gelişimi, ilerlemesi ve yayılımında önemli rol oynamaktadır. Stromal ortam da terapötik cevapları 2,4,5 etkiler. Böylece kanser hücreleri sağlam mikroçevresinin kapsamında geleneksel ve yeni tedavilere yanıt belirleyen kanser biyolojisi hakkındaki bilgilerimizi geliştirerek ve güncel tedavi stratejileri geliştirmek için önemlidir. Ayrıca, kanser hücre-stroma etkileşim tedavi uygulamasını takiben nasıl değiştiğini tanımlayan tümör nüks biyolojisi anlamak için önemlidir. Organik tip eş-kültür sistemleri tümör-stroma etkileşimleri incelemek için yararlı olmuştur <s6&gt; kadar, ancak şu anda mevcut yöntemlerin başarılı bir bağışıklık hücrelerinin vasküler fonksiyon ve yerleştirme açısından özellikle in vitro tümör mikro bozulmamış, tekrarlamak edilemez olduğu aşikardır. Gerçekten de, in vitro olarak görülmektedir tedavileri, kanser hücresi yanıtlarını sık sık mikroçevrede 5 bozulmamış in vivo, gözlenen önemli ölçüde farklı. Böylece, terapötik yanıta tümör-stroma etkileşim ve bunların etkilerini incelemek için in vivo modeller daha iyi klinik mekanizmalar 7 yansıtıyor olabilir. In vivo anti-kanser tedaviye yanıtları okuyan birincil yolu tümör büyüklüğü ve işlenmiş hayvan veya hastalardan elde edilen dokuların histolojik değerlendirme ölçümleri yoluyla olmuştur. Ancak, son yirmi yılda mikroskopi ve floresan gazetecilere gelişmeler arası ve hücre içi süreçlerin görselleştirme sağlamıştırcanlı, anestezi altındaki hayvanlarda yüksek çözünürlüklü (intravital görüntüleme) 8. Bu intravital mikroskopi teknolojiler ve mekansal hücresel ve hücre altı çözünürlükte 8,9 tümör-stroma etkileşim vivo dinamiği diseksiyon için özellikle değerli olduğu kanıtlanmıştır. Intravital görüntüleme ile çözülememiştir oylandı Süreçleri anti-tümör T hücre sitotoksik 10,11, T hücreleri ve miyeloid hücreler 12 arasındaki etkileşimleri, terapötik tedavi 13, makrofaj-bağımlı kanser hücresi intravazasyon ve metastaz sonrası kollajen oluşumu ve organizasyon değişiklikleri dinamikleri 14 ve vasküler permeabilite 15. Intravital görüntüleme için üç önemli gereksinimleri vardır. Bunlar uygun hazırlama ve pozlama dokuların görüntüleme, ilgi doku bileşenlerinin floresan etiketleme ve eşleştirilmiş bir mikroskop kamera s dahilgörüntüleri 16 edinme yeteneğine istem. Bu gereksinimleri gidermek için kullanılan en yaygın stratejiler şunlardır: 1) heterotopik preparatları (örn., kulak veya göz orbita inokülasyonu), kalıcı görüntüleme pencereleri veya dışarıya preparatları (örn., dorsal deri flebi); 2) transgenik floresan gazetecilere ve.. floresan enjektabl doku parçaları etiketlemek için, ve 3) multiphoton veya konfokal mikroskopi sistemleri sırasıyla 9 fotoçoğaltıcı tüpler veya şarj bağlı cihaz (CCD) kameralar ile eşleştirilmiş. Biz floresan gazetecilere kodlayan transgenlerin ifade anestezi altındaki hayvanlarda görüntüleme için inguinal meme bezi göstermek için bir cerrahi hazırlanan flep modeli kullanın. Görüntüler dört lazer iplik diske konfokal mikroskop sistemi 17 ile eşleştirilmiş bir yoğunlaştıkça CCD (ICCD) kamera kullanarak 12 ila 40 saat arasında bir süre içinde alınır. Bu şekilde Görüntüleme bize vivo ilaç dağıtım, evre bağımlı ch gibi süreçleri incelemek için izin verdiemotherapeutic yanıtları, kemoterapiye bağlı hücre ölümü ve miyeloid hücre davranışlarını 5 türü. Bu anti-kanser terapisi ve meme kanseri fare modellerinde tümör-stroma etkileşimleri için kanser hücresi yanıtı intravital görüntüleme için bir protokol sağlar. Bu protokol, bir tek görüntü oturumda, 40 saate kadar olan süreler için transgenik ve transplantasyon modellerinde hem transjenik ve enjekte edilen floresan etiketler çok çeşitli kanser hücreleri, stromal iki bileşenin davranışı ve ölüm izlemek için kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT farelerde </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag fareler </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP farelerde </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP farelerde </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> -House Made in </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dekstran, Flöresein-konjuge </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> 1 x PBS içinde seyreltilmiş ve 1 mg / ml; dH 2 O (-20 ° C, 4 mg / ml, mağaza) içinde sulandırın </td></tr><tr><td> 10 kD Dekstran, Alexa Fluor 647-konjuge </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> 1 x PBS içinde seyreltilmiş ve 1 mg / ml; dH 2 O (-20 ° C, 4 mg / ml, mağaza) içinde sulandırın </td></tr><tr><td> Doksorubisin hidroklorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> 4 at dH 2 O ve mağaza sulandırın ° C; 1 x PBS içinde seyreltin </td></tr><tr><td> Isothesia (İzofluran) </td><td> Butler Hayvan Sağlığı Kaynağı </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidium iyodür </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; 1:15 seyreltilmiş 1 x PBS içinde </td></tr><tr><td> Azot </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oksijen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;Düzenli konik iğne </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Açık kaynak yazılım </td></tr><tr><td> Alkol çubukla </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> % 70 izopropil alkol bezlerden </td></tr><tr><td> Anestezi sistemi </td><td> Moleküler Görüntüleme Ürünleri, Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cam Kapak </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> 1 ½, 24x50 mm No;% 70 izopropanol mendil ile dezenfekte </td></tr><tr><td> Curity gazlı bez sünger (steril) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Cam mikroskop slaytlar </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Önceden temizlenmiş; önceden temizlenmiş değilse,% 70 izopropanol mendil ile dezenfekte </td></tr><tr><td> Sertleştirilmiş ince makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14090-11 </td><td> 2 çift; paslanmaz çelikten, keskin keskin uçları, düz uçlu, 26 mm kesme kenarı, 11 cm uzunluk </td></tr><tr><td> Isıtmalı battaniye </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıcak boncuk sterilizatör </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18000-45 </td><td> Kullanmadan önce yaklaşık 30 dakika açın;&gt; 200 aletleri sterilize ° C 30 sn </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer Ürünleri </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratuvar bant (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratuar bant (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Için KapakStrafor nakliye soğutucusu </td><td></td><td></td><td> Bu, cerrahi platform olarak kullanılacak </td></tr><tr><td> Mikro diseksiyon forseps </td><td> Roboz </td><td> SC-5153 </td><td> 1x2 dişler, hafif eğri, 0.8 mm uç genişliği, 4 &quot;uzunluğu </td></tr><tr><td> Mikro diseksiyon forseps </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Dişli, hafif eğri, 0.8 mm uç genişliği; 4 &quot;uzunluğu </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td></td><td></td><td> İplik disk konfokal, XYZ Piezo aşamada, epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Mikroskop sahnede insert </td><td> Uygulamalı Bilimsel Aletler </td><td></td><td> Özel iki dairesel görüntüleme portları ile, fabrikasyon </td></tr><tr><td> MouseOx oksimetre, yazılım ve sensörler </td><td> STARR Yaşam Bilimleri </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Süper Versi-Kuru laboratuar Soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Cerrahi platformu astar için dörtte halinde doğrayın </td></tr><tr><td> Nebulizatör </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Gazlar nemlendirmek için kullanılır; akciğer dokuları tahriş olmasını engeller </td></tr><tr><td> Slip-ucu tek tüberkülin şırınga (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo kanatlı infüzyon seti </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra ince iğne, 12&quot; boru </td></tr><tr><td> Betadine Sprey </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Tümör mikro tümör gelişimini, ilerlemesini metastazı, ve anti-kanser tedavileri için yanıt olarak önemli bir rol oynar. Üç boyutlu ko-kültür sistemleri sık sık ilaç etkileşimleri rolleri içeren tümör-stroma etkileşimleri açıklamak için kullanılır. Bununla birlikte, bozulmamış mikroçevresindeki in vivo olarak meydana gelen etkileşimlere bir çok in vitro tamamen ortamlarda bu da taklit edilemeyen. Böylece, gerçek zamanlı olarak bu süreçlerin doğrudan görselleştirme tedavilere tümör tepkilerinin anlaşılması ve kanser hücreleri ve bu yanıtları etkileyebilir stroma arasındaki etkileşimleri tespit edilmesinde önemli bir araç haline gelmiştir. Burada direkt olarak ilaç dağılımı, kanser hücresi yanıtlarını ve meme kanseri modelinde sistemik tedavi uygulanmasından sonra tümör-stroma etkileşimleri değişiklikleri gözlemlemek için, canlı farelerde anestezi dönen disk konfokal mikroskopi kullanılarak için bir yöntem sağlar. Biz labeli prosedürleri tarifng farklı tümör parçaları, terapötik cevapları gözlemlemek için hayvanların tedavisi ve 40 saat görüntüleme ve tümör dokuları sergilemek için cerrahi işlem. Bu protokol elde edilen sonuçlar ilaç infiltrasyon, kanser hücre ölümü ve stromal hücre göçü gibi süreçler görüntü analiz yazılımı kullanılarak değerlendirilebilir hangi time-lapse film vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem açıklanmaktadır<em&gt; In vivo</em&gt; Ve tek hücreli çözünürlükte.

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

live-imaging-drug-responses-tumor-microenvironment-mouse-models

Research

JoVE Journal

Medicine

24.6K Görüntüleme.  Watson School of Biological Sciences. Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem açıklanmaktadır In vivo Ve tek hücreli çözünürlükte.

Video: Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Tıp

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblastlar

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Fare Servikal lenf nodu Yüksek frekanslı Ultrasonik Görüntüleme

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...