Biz Süm Min / + farenin genotiplemeye Ying Yu teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma INSERM fon ve Sağlık Ulusal Enstitüleri hibe (CA057621 ve AI053194) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm hayvan deneyleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), ucsf tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır. Tüm görüntüleme deneyleri hayatta olmayan prosedürler ve hayvanların görüntü elde sonunda hemen sonra ötenazi edildi. 1. Farelerin Üretimi Not: Apc genindeki bir mutasyon taşıyan Apc Min / + fareleri, kendiliğinden ince bağırsakta 50-100 adenomlar gelişir. <ol><li> Çapraz Apc Min miyeloid hücreleri tespit etmek için c-fms ihtiva promotör altında EGFP ifade c-fms ihtiva EGFP hattı ile ACTB-eCFP aktin destekçisi altında eCFP ifade hattı, ve bundan başka, birlikte / + fareler. ACTB-eCFP ve c-fms EGFP için heterozigot olan hayvanlar, floresans tespit etmek için kullanılır. </li><li> Görüntü net saptanabilir adenom için 3-4 aylık yaşta fareler kullanın. </li></ol> M 2. HazırlıkAmeliyattan Önce aterials NOT: mikroskop set-up detayları daha önce hiç 6,7 tarif var. <ol><li> Mikroskop <ol><li> Isıtma battaniye açın. 488 nm&#39;de uyarma ve katı hal 405 nm, 561 nm ve 640 nm lazer argon lazer açın. Mikroskop açın, dönen disk kontrol birimi, AOTF, lazer kontrol ünitesi ve kamera denetleyicisi. </li><li> LED kırmızıya döner mikroskop deklanşöre açın. Bilgisayar ve kamera yazılımı açın. </li></ol></li><li> Görüntüleme Platformu <ol><li> Sahne insert temiz olduğundan emin olun. Aksi takdirde, su ve sabun ve daha sonra kuru temiz. </li><li> İki lamelleri al ve insert onları korumak için laboratuvar bandı kullanın. Sahnede parçayı yerleştirin ve alkol mendil ile temizleyin. </li><li> Laboratuvar bant kullanarak, sahnenin sağ tarafına ısıtma battaniye takın. </li><li> Burun konisi üzerindeki kauçuk diyaframın bütünlüğünü doğrulamak ve Mutlaka eğer bunu değiştirmekY. Konumu ve gazlı bez ve laboratuar bant kullanarak hayvana izofluran anestezi teslimat için burun konisi düzeltmek. </li></ol></li><li> İsofluranın Anestezi Sistemi <ol><li> Izofluran tankı doldurun. </li><li> Vakum açın ve / dk 1.2 L ayarlayın. </li><li> Nebulizere damıtılmış su ekleyin ve izofluran sisteme nebulizatörü bağlayın. </li><li> Oksijen analizörü açın ve izofluran sisteme bağlayın. Oksijen deposu açın ve oksijen analizörü% 100 gösterir emin olun. 0,2 l / dk için O 2 akışını ayarlayın. </li><li> Azot tankına açın ve / dk 0.8 L akışını ayarlamak. Oksijen analizörü 21% gösterdiğinden emin olun. </li></ol></li><li> Cerrahi Alet ve Platform Hazırlanması <ol><li> Sabun ve su ile diseksiyon forseps ve makas temiz 2 çift. </li><li> Sıcak boncuk sterilizatör açmak ve 250 ° C ye izin verin. 30 sn için cerrahi aletleri sterilize. Onları soğumasını bekleyin. </li><li> Cerrahi bankta bir laboratuvar sağanak yerleştirin. </li><li> Cerrahi bir platform olarak bir Strafor kapağı kullanın. Laboratuar Batmışın bir parça ile örtün. Fareyi tıraş sonra değiştirmek için laboratuar Batmışın ikinci bir parça hazırlayın. </li><li> Kaplı Strafor kapağındaki anestezi hattı ile burun konisi yerleştirin ve bazı bant ile (değil laboratuar ıslatıcıya üzerine) Strafor kapağına takın ve yerinde tutmak için burun konisi her iki tarafında iki iğne kullanın. </li><li> Betadine, alkol mendil, steril gazlı bez, süper yapıştırıcı, mikroskop slaytlar, elektrikli tıraş makinesi, ve laboratuvar bant 4 adet birleştirin. </li></ol></li></ol> Enjeksiyonlar 3. hazırlanması <ol><li> Kapağın altında, bir insülin şırıngası hazırlanması (28 g x ½ cm) 2,000 kDa rodamin-dekstran (4 mg / ml 100 ul stok içine AF647 konjuge edilmiş Ly-6G (Gr1) antikoru (1 mg / ml), 7 ul ) retro-orbital enjeksiyon için. Bu hayvanlarda gelişen anemi kuyruk damarları difficu yapar bu yana retro-orbital enjeksiyon Süm Min / + farelerde tavsiye edilirlt deri yoluyla algılamak için. </li><li> Bağırsağın peristaltik hareketlerini azaltmak için görüntüleme önce 1 mg / kg deri altından (sc), 150 ul PBS içinde seyreltilmiş atropin enjeksiyonu ile bir ikinci insülin şırınga hazırlayın. </li></ol> Görüntüleme için Bağırsak 4. hazırlanması <ol><li> Indüksiyon odasına anestezi hattı açık ve cerrahi masa ve mikroskop çizgiler kapalı olduğunu doğrulayın. </li><li> Anestezi odasına hayvan aktarın. Anestezi odasına kapatın ve (% 21 O 2)% 4 izofluran açın. </li><li> Fare derinden ve yavaş yavaş (5-6 dakika sonra) nefes aldığında, onun kanadında cerrahi sahneye aktarmak ve Gr1 antikor çözüm ve / veya dekstran solüsyonu, retro-orbital enjekte. </li><li> Cerrahi platforma bağlı anestezi hattını açın. Anestezi odasına hattını kapatın ve anestezi koni onun burun sırtında fare koymak. </li><li> Izofluran azaltın% 4 den% 2.5 &#39;e konsantrasyonu. </li><li> Fare de onun Kapkaççı tutup kornea refleks testi ile anestezi doğrulayın. </li><li> Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik yağlama merhem ekleyin. </li><li> Laboratuvar bant ekleyerek cerrahi aşamasına fare bacaklarda sabitleyin. </li><li> Elektrikli tıraş makinesi ile ventral yüzeyi saç çıkarın. Ayrıca satın önce oksimetreden konumlandırmak için sol arka bacağındaki saç kaldırmak. Cerrahi aşamasından laboratuvar Sağanak çıkarın ve saç kontaminasyonu önlemek için temiz bir biri ile değiştirin. </li><li> Alkol mendil ve betadin ventral yüzeyi dezenfekte edin. </li><li> Fare bir böğrüne sc (3.2) atropin çözüm enjekte. </li><li> Deri yoluyla 1 cm ventral orta hat kesi ve kullanarak makas ile periton ve forseps bir çift olun. Dikkatle bağırsak 3-4 cm çekin ve görüntü bir veya birkaç tümörleri tespit. </li><li> Cam MICR almakOscope slayt pozisyonu ve üst kısmında bir tümör ile üzerine bağırsağın bir döngü. </li><li> Slayt takmak için bağırsak boyunca birkaç yerde bazı süper yapıştırıcı ekleyin. Tutkal kuruması için bir dakika bekleyin. Konfokal ile lokalizasyon kolaylaştırmak için tümöre işaret sürgü üzerinde bir çizgi çizmek için bir işaretçiye kullanın. </li></ol> 5. Konumlandırma Sahne üzerinde Fare ve Hazırlık Image Acquisition için <ol><li> Bacaklarda laboratuvar bandı çıkarın. </li><li> Mikroskop sahneye anestezi hattını açın ve cerrahi platforma birini kapatın. </li><li> Aşağı ventral yüzü ve burun konisi burnunun ile mikroskop aşamasında dikkatlice fare aktarın. Bazı laboratuvar bant ile anestezi hattını sabitleyin. </li><li> Yeniden konumlandırmak kapak astarlı pencerelerden birinin merkezinde bağırsak olması için fare ve / veya slayt. Yavaşça laboratuvar bant ile slayt aşağı bantlayın. </li><li> Farenin sol bacağa için oksimetre probu takınonun kalp ve solunum hızı ve oksijen satürasyonu düzeylerini izleyin. </li><li> Hipotermi önlemek için ısıtma battaniye ile fareyi örtün. </li><li> Görüntüleme için 1-1.5% 2,5 den% izofluran konsantrasyonu azaltır. </li></ol> ΜManager Yazılımı Kullanarak Görüntüleri 6. kazanılması <ol><li> Yapılandırma Ayarlar görüntü kalitesini iyileştirmek için 2.500 rpm CSUX hızını artırın. </li><li> 10X 0.5 NA veya 20X 0.75 NA Fluar objektif hedefi seçmek için Amaç açılır menüsünü kullanın. </li><li> Renk açılır menüden lazer 405 nm seçin. </li><li> Live tıklayın ve mikroskop ile odağı ayarlayın. </li><li> Otomatik olarak görüntüdeki aşırı piksel değerlerine dayanan Ekrandaki görüntünün maksimum ve minimum piksel yoğunlukları ayarlamak için Otomatik tıklayın. Ekran görüntüsünün piksel yoğunluğunun bir histogram Ana Pencere alt kısmında grafikte sunulmuştur. </li><li> Tarafından Piper Denetim Masası penceresinde kamera pozu ayarlayınsaatlerin sayısını (Bir saat 33.333 msn&#39;dir) değişiyor. </li><li> Sinyal düşük pozlama ile çok parlak ise, mikroskop kontrol birimini kullanarak lazer yoğunluğunu azaltmak. </li><li> 488 nm, 561 nm ve 640 nm lazer çizgileri için sinyal yoğunluğu kontrol edin. Lazerin kendi kontrol ünitesi (488 nm ve 561 nm) veya mikroskop kontrol ünitesi ile lazer yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Çoklu D Toplama penceresinde, Zaman noktaları kutusunu işaretleyin ve zaman noktalarının sayısını ve istenilen zaman aralığını yazın. </li><li> , Z-yığınlarının kutusunu işaretleyin &quot;göreli Z&quot; seçin ve mevcut konumda Z-start ve Z-uç göreli tanımlar. NOT: 10X veya 20X hedefi için ayrı sırasıyla 3 Z uçakları, 8 mm veya 4 mikron ile başlar. </li><li> Çeşitli yerlerde görüntüleme için birden çok pozisyonlar (XY) onay kutusunu, ardından Düzen pozisyon listesini tıklatın 4 ila 6 farklı pozisyonlar işaretleyin. </li><li> Kanallar kutusunu işaretleyin ve Yeni kanalları ekleyebilir ve lazer yazıcılarını açılır menü ve typ satırları seçin(33.333 msn adedi) her kanal için maruz e. </li><li> &quot;Çoklu D kazanım&quot; penceresinde Kaydet görüntüleri kontrol edin. </li><li> Bir klasörü seçin ve elde edilen tüm görüntüleri otomatik olarak verilen isim öneki ile bu klasöre kaydedilir. NOT: Her sürekli tedarik her zaman noktasında her renkte her Z dilim için ayrı tiff dosyaları olarak ayrı bir alt klasörde kaydedilir. </li><li> Çoklu D Toplama penceresinde Ayarları kaydet tıklayarak tüm ayarları kaydedin. </li><li> Edinimi başlatmak için Çok boyutlu Toplama penceresinde Al&#39;ı tıklatın. </li><li> Oksimetre probu kullanılmaz ya da durması halinde (darbe sabit veya tespit etmek zor değil olduğunda), Kapkaççı tutup kornea refleksi kontrol ederek anestezi verimi görüntüleme işlemi sırasında her 15 dakikada bir kontrol edin. Fare bu uyaranlara duyarlı ise, anestezi ayarlayın. </li><li> Aldıktan sonra, izofluran yoğunlaşan artırarak fare euthanize% 5 oranı. Hiçbir solunum hareketleri saptanabilir olduğu, sahneden fare kaldırmak ve servikal çıkık gerçekleştirin. </li></ol> Imaris Yazılımı Kullanarak Görüntüleri 7. Analiz <ol><li> Dönüşüm Dosyaları (Ek Şekil 1A) .ims için <ol><li> , Kamera yazılımı açın Dosya daha sonra Batch Converter tıklayın. </li><li> Tıklayın dosya ekleme ve ilk pozisyonun ilk dosyayı seçin. Her pozisyon için tekrarlayın. </li><li> Yüklenen her dosya için, Ayarlar üzerine tıklayın ve Z-yığınları için Zaman Kanallarının için, &quot;c&quot; ve &quot;z&quot; için ayarlar &quot;t&quot; bu sırayla görünür doğrulayın. </li><li> İstediğiniz klasöre kaydedin. İnsanlar ve dönüştürülmüş olarak yeni bir dosya oluşturun. </li><li> Tüm için Set tıklayın ve başlayın. </li></ol></li><li> Düzeltmeler (Ek Şekil 1B) <ol><li> Belirli Dönüştürülen klasörüne gidin ve ilk dosyasını açın. </li><li> Ekran Ayarı penceresinde, arka plan ayarlamakGerekirse her kanal için Min numarasını değiştirerek sinyal kesme. </li><li> Gerekirse, Çok sayıda (en alt Çok sayıda yüksek sinyalin yoğunluğu) değiştirerek, sinyal yoğunluğu ayarlayın. NOT: sinyal yoğunluğu / kontrast ayarlamaları güzel bir görselleştirme olması için bir hücre davranışı ya da bir bölmesinin vurgulamak etkinleştirin. Bu sonuç kendisi değişmez. </li><li> Düzen ve Görüntü Özellikleri tıklayın. </li><li> X, y, ve z değerlerini değiştirin (10X objektif, x ve y = 0,712, z = 8 mikron için, bir 20X objektif için: x ve y = 0.36, z = 4 mikron). </li><li> Zaman noktalarını ayarlamak için tüm eşit mesafede tıklayın. Başlangıç ​​tarihini ekleyin ve satın alma başlangıç ​​zamanı. Bitiş tarihini ekleyin ve iktisap (Ek Şekil 1C) zaman sonuna. </li><li> Film izlemek için Oynat düğmesine tıklayın. </li><li> Düzenle&#39;yi tıklatın ve bulanık görüntüleri silmek için zaman noktaları silin. </li><li> İki ayrı satın almalar Toge katılmak içinther bir film içine, ilk filmin son kez noktasına gidin ve Düzenle üzerine tıklayın&gt; ikinci bir dosya eklemek için zaman puan ekleyin. </li></ol></li><li> Bir film olarak kaydetme (Ek Şekil 1D) <ol><li> , Record tıklayın .mov uzantısı ve 0 bir sıkıştırma faktörü seçin. </li><li> Kaydet butonuna tıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+myeloid+cells+by+the+tumor+microenvironment:+Open+questions+on+the+dynamics+and+plasticity+of+different+tumor-associated+myeloid+cell+populations.">Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations.</a> Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).</li><li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).</li><li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088 (2013).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer.">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).</li><li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse.">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intestinal+neoplasia+caused+by+a+mutation+in+the+murine+homolog+of+the+APC+gene.">Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene.</a> Science. 256 (5057), 668-670 (1992).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mucosal+homeostasis+via+single-+and+multiphoton+intravital+fluorescence+microscopy.">Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy.</a> J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).</li><li>Haigis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation,+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon.">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li><li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo.">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li><li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression.">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li><li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+(Smad4)+and+Apc+genes.">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yazıda ayrıntılı protokol bağırsak serozal taraftan görüntülenmiş bir canlı hayvanda bir kaç saat için intestinal tümörlerde miyeloid hücre dinamikleri disk confocal görüntüleme eğirme için bir işlem açıklanmaktadır. Inflamasyonu önlemek için ve en iyi fizyolojik koşulları için, bağırsak görüntüleme, bozulmamış organ üzerinde yapılmalıdır. Işık epitel ulaşmadan önce bu tür düz kas olarak çeşitli doku katmanlarının geçmesi gerekir Ancak, ...

Tüm veriler hemen fibroblastlar, endotel hücreleri, bağışıklık ve enflamatuvar hücrelerde, hücre üstü matris ve çözünür faktörler dahil olmak üzere heterojen hücre popülasyonu, aşağıdakilerden oluşan tümör mikro, hemen hemen tüm katkıda başlatılması ve katı tümörlerin ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını ortaya koymaktadır kanser 1 özellikleridir. Nitekim, tümör ilerlemesi esnasında, malignite 2 elverişli bir mikro oluşturmak için gelişmeye dönüştürülmüş kanser hücreleri ve stromal hücreler arasında sürekli dinamik etkileşimler vardır. Tümör mikro infiltre hücreler arasında immün, miyeloid hücreleri, 3, en bol miktarda bulunmaktadır. (TAM) tümörle ilişkili makrofaj oluşan miyeloid türevi bastırıcı hücreleri (MDSCs), dendritik hücreler (DC) ve nötrofil (PMNler), miyeloid hücreler, kemik iliğinden kişi etüde dahil edilir ve kademeli olarak sitokinler, büyüme faktörleri ve proteazlar serbest, tümör infiltre teşvik edebilirtümör büyümesi ve 4 yayıldı. Kanser hücreleri ve miyeloid hücreleri arasındaki karışma karmaşık ama dinamiktir. Böylece onların etkileşimlerinin doğası anlayışı bu hücrelerin yerine bir anti-tümör immün yanıtı katılan kanser ilerlemesini teşvik neden belirlemede çok önemli olduğunu ve onu kontrol etmek için yeni hedefler bulmak için yardımcı olabilir. Intravital mikroskobu ile doğrudan gözlem canlı farelerde 5 dokuların içinde hücre dinamikleri hakkında bilgi sağlar. Dört renkli, çok-bölgeli, mikro mercekli döner disk konfokal sistemi meme tümörlerinin 6 olan stromal hücreler incelemek için dizayn edilmiştir. Bu yaklaşım uzun vadeli sürekli görüntülenmesine olanak sağlar ve bu hareket eserler en aza indirmek için, (a) hızlı görüntüleri edinme, (b) uzun süreli anestezi, (c) farklı hücre tiplerini takip dört renk satın alma, (d) floresan etiketleme gibi çeşitli avantajlar içermektedir Farklı tümör bileşenler ve farklı tümör mikroçevrelerde zeka (e) gözlemAynı fareyi hin fare değişkenliği 7-9 fare önlemek için. Bu teknoloji ile, farklı hücre davranışlar tümör oluşumunun progresif aşamalarını gösterir meme tümör virüsü (MMTV) promoterinin yükseltici sürüşlü polioma orta T onkojen (PyMT) modeli olarak bildirilmiştir. (Foxp3 EGFP transgen tarafından görüntülenmiştir Tregs) kan damarları yakınında tercihli göç düzenleyici T-lenfositler DH&#39;lerin (CD11c&#39;nin-DTR-EGFP), karsinom ilişkili fibroblastlar (FsP1 + / + -EGFP) ve miyeloid hücreleri (c-FMS ise -EGFP) tümör kitlesi içinde daha tümör çevresi daha yüksek hareketlilik gösterirler. Akut sistemik hipoksi durumda, hücreler farklı göç: Tregs 6 hareket etmeye devam miyeloid hücrelerinin aksine göç dur. Buna ek olarak, aynı fare modelinde, tümör aşaması ile bu doksorubisin duyarlılık değişiklikleri gösterilmiştir, ilaç dağıtım ilaç tepkisi ve doksorubisin ile ilgilidirTedavi tümörlere miyeloid hücrelerin CCR2 bağımlı işe yol açar. Böylece, canlı görüntüleme ayrıca yerinde ilaç yanıtları anlayışlar ve kemoterapi direncinin 10,11 biyolojisini kazanmak için kullanılabilir. Adenomatus poliposis koli (APC), gen mutasyonu genel olarak insan kolorektal adenomlar ve karsinomlar 12 ve 13 kolon kanseri için son derece yüksek bir risk faktörüdür ailevi adenomatoz polipoz (FAP), APC gen sonuç tek bir kopyasının mutasyon meydana gelir. Fare suşu Süm Min / + Süm geni kodon 850 bir kesme mutasyonu taşıyan ve kendiliğinden bütün ince bağırsağın 14-16 üzerindeki birden fazla bağırsak adenomu gelişir. Periton boşluğuna açma bağırsak erişim için gerekli olduğu bağırsak uzun süreli intravital görüntüleme, çünkü işlemin invaziflik zordur. Kısa vadeli canlı görüntüleme studies önceden sağlıklı bağırsak 17,18 yayınlanmıştır ancak, bağırsak tümörleri uzun vadeli doğrudan gözlem rapor edilmemiştir. Bir cerrahi prosedür, daha önce Resim göğüs tümörlerinde 6,10 kullanılan İntra vital mikroskopik döner disk sistemi kullanılarak tasarlanmış ve bağırsak serozal yüzeyi boyunca tümörlerin görselleştirmek için rafine edilmiştir. Bu makalede, bir protokol bir Apc asgari / + fareleri kullanarak küçük bağırsakta da ötesi tümörler içerisindeki miyeloid hücrelerinin hareketlerine de takip etmesini sağlar tarif edilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ApcMin/+ mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ACTB-ECFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:141px;">3773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cfms-EGFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">D7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:107px;">Butler Animal Health Supply</td>
			<td style="width:141px;">29450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxygen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X PBS</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Saline Buffer</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td>
			<td style="width:107px;">UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Use at 1mg/Kg mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">28G1/2 insulin syringe</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">329465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Remium cover glass</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-548-5M</td>
			<td>24x50-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-550-15</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Krazy glue</td>
			<td style="width:107px;">Office Max</td>
			<td align="right">7111555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Betadine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat blanket</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar Industries</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cotton tipped apllicators 6-inch</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">72310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anesthesia system</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:141px;">Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">stage insert</td>
			<td style="width:107px;">Applied Sientific Instrumentation</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse Ox oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:107px;">Starr Life Sciences</td>
			<td style="width:141px;">MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nebulizer</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:107px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mManager</td>
			<td style="width:107px;">Vale lab, UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ICCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:141px;">XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinning disk confocal sacan-head</td>
			<td style="width:107px;">Yokogawa Corporation</td>
			<td style="width:141px;">CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Myeloid hücreler tümörler içinde en bol bulunan bağışıklık hücreleri ve tümör gelişimini teşvik ettiği gösterilmiştir. Modern Intravital görüntüleme teknikleri organ içindeki canlı hücresel davranış gözlem imkanı ancak bağırsak gibi nedeniyle, organ ve tümör erişilebilirlik bazı kanser türlerinde zor olabilir. Bağırsak tümörlerinin doğrudan gözlenmesi, daha önce bildirilmemiştir. Burada tarif edilen bir cerrahi prosedür transgenik fareler flüoresan raportör ve enjekte edilebilir izleyiciler ya da antikorları kullanarak, canlı farelerde bağırsak tümörler içinde miyeloid hücre dinamikleri doğrudan gözlem sağlar. Bu amaç için, hızlı bir görüntü elde etme ve uzun süreli kesintisiz görüntüleme sağlayan bir dört renkli, çok-bölgeli, mikro mercekli döner disk konfokal mikroskop kullanılır olmuştur. Çaprazlanır ince bağırsakta çok adenom geliştirmek Apc Min / + fareleri miyeloid hücreleri görselleştirmek için, c-fms-EGFP fareler ve ACTB-eCFP fareler ilekriptaların bağırsak epitel hücreleri görselleştirmek için. , Kan damarları ve nötrofil ve serozal yüzeyi boyunca tümör görüntüleme için konumlandırılması için bir prosedür olarak, farklı tümör bileşenleri etiketlenmesi için prosedürler de tarif edilmiştir. Görüntülemenin birkaç saat derlenen Time-lapse film bağırsak mikroçevresinin in situ miyeloid hücre davranış analizini sağlar.

ACTB-eCFP;; Süm Min / + küçük bağırsakta dönen disk konfokal mikroskopi, tümöral olmayan ve tümoral dokuları kullanılarak c-fms-eCFP farenin seröz yüzeyden görülebilir. Görüntüleme sonra, kamera yazılımı analiz ve satın alma (Ek Şekil 1) ayarlamak için kullanılır. Floresan 2000 kDa dekstran-rodamin intravenöz (IV) enjeksiyonu ve bir Ly-6G 647 ile konjüge edilmiş antikor, sonra, kan damarları ve PMN idi (Şekil 1) tespi...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy at JoVE.com

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K Görüntüleme.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Video: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.