Yazarlar protokolü geliştirirken yararlı yorumlar için Dr Barletta ve Dr Güçlerin laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz el yazması yararlı tartışmalar ve redaksiyon için Wendy Austin ederim. Bu yazıda anlatılan çalışma Nebraska-Lincoln Redoks Biyolojisi Merkezi (ebeveyn hibe # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI) University of Yukarıda listelenen her bir araştırmacı için tohum Pilot hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, araştırma malzemeleri ve bu yayına dahil NMR teknikleri standardize Bay Halouska en kısmi maaş desteği için ona R21 hibe (1R21AI087561-01A1) fon sağlamak için Dr Ofelia Chacon ederim.

1. Protokol Metni Bu protokol M. NMR metodolojisinin adaptasyonu vurgulamaktadır Tüberküloz (Sınıf III ajan). M. yaparken nedenle, Biyogüvenlik Seviyesi 3 (BSL3) uygulamaları takip edilmesi gereken bir yıllık sertifikalı laboratuvarda tüberküloz araştırma. Laboratuvar tarafından oluşturulan aerosoller Maruziyet bu mikroorganizmalar ile çalışan personel tarafından karşılaşılan en önemli tehlikedir. Aşağıdaki yordamlar Kurumumuzda yürütülen ve varyasyonları Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi&#39;nin önerilerine dayanarak mevcut olabilir. Ortak personel koruyucu ekipman, bir Tyvek elbise, kabarık kap, patik, N95 solunum, göz koruma, kollu ve nitril eldiven bir çift çifti oluşacaktır. M. içeren çalışın Açık M. tüberküloz kültürü ve / veya manipülasyon tüberküloz konteyner tipi A2 veya B2 biyolojik güvenlik kabininde yapılır. Plastik-kaplı emici kağıt w üzerine yerleştiriliryüzey akıcı iş. Bertaraf veya tesis kaldırılacak tüm malzemeler / gereçler iki biohazard torba yerleştirilir ve otoklavlanarak dekontamine edilmelidir. Çalışma yüzeyleri ve dolap (FastPrep-24 lizis homojenizatör, spektrofotometre, buz kovası, vb) içinde kullanılan ekipmanlar 1% Amphyl (tüberkülsit, bakterisid fungusid ve virüsidal ajanı) ile her çalışma oturumundan sonra dezenfekte edilmelidir. M. tüberküloz kültürleri gibi dondurucu, inkübatör, santrifüj, ve buzdolabı gibi biyolojik güvenlik kabini dışında bulunan büyük ekipman ulaşım için çifte altına alınmalıdır. Santrifüj kapalı güvenlik kapları ve O-ring vida üst tüpleri ile yapılır. BSL3 laboratuar dışında ileri analiz için, hücre içermeyen özler 15 dakika süreyle 95 ° C de öldü 0.2 um bir filtreden veya mikroorganizmalar ısı ile filtre edilir. 2 numuneler önce çevreleme kaldırılması için koloni oluşturan birim yokluğunda doğrulamak için kaplanır. <ol><li> 110 Polisorbat 80 (Tween 80 topaklanma önlemek için) içeren Middlebrook 7H9 ortamı ml tam çorbası (mA DC-TW) ya da bir 250 ml Erlenmeyer şişesi için uygun bir ortam. Aktarma C-metabolitler 13 kullanırken üç kat kültürlerinin rutin durum başına yetiştirilen ve on özdeş kültür 1D 1H NMR profilleme için yetiştirilir. Iki koşula (örneğin, ilaç ilavesi ile ve olmadan) çoğaltmak başına kültürünün çift hacmi büyüdü ve iki özdeş kültürlere ayrılabilir için. Bütün reaktif ve çözelti tarifleri protokolünün sonunda sağlanmaktadır. </li><li> M. 0.150 ml broth inoküle tüberküloz% 50 gliserol stoku (buz çözülmesini sağlar). Aşağıdaki 1. Not bakınız. </li><li> Kültürü 37 büyümesine izin ver ° C&#39;de yaklaşık 6 gün (OD 600 0.6-0.8) 100 rpm&#39;de sallayarak. Aşağıdaki Not 2&#39;ye bakınız. </li><li> Hiçbir antibiyotikler, alternatif eklemeler veya diğer tedaviler gerekiyorsa, kültürler hasat edilmeye hazırdır. Tedaviler kullanıldığında, devamdoğrudan 5. adıma. Kirlenme testleri, fenotipik analizi, PCR testleri: Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. Aşağıdaki Not 3&#39;e bakınız. Bu noktada, 6. Aşamaya geçin. </li><li> Sallantıyı matara çıkarın ve istenen tedavi (örn., ilaç ya da metaboliti ekleyin) gerçekleştirin. Sıra bir ek süre (örneğin, 6-18 saat) için çalkalayıcı ve inkübe geri şişelerde. Bu sürenin sonunda, diğer bir 1.0 ml bir örnek alır ve OD 600 belirler. Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. </li><li> 5 dakika buz üzerine yerleştirin kültürler. Bu adımdan sonra, geriye kalan bütün protokol boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın. Hasat 2,000 x g&#39;de ve 4 de santrifüj ile kültür ° C&#39;de bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 50 ml tüp içinde 15 dakika için. Her bir kültür 25 ml her biri (1 toplam dört tüp gerektirir00 ml 2B 1 için yeterli bir sinyal-gürültü elde etmek için gerekli olan H-13 C kültür başına 50 ml 1D 1 H NMR deneyleri için gerekli NMR deneyleri). </li><li> Yukarıda anlatılan parametrelere göre santrifüj buz-soğuk GKD 2 O (yaklaşık olarak 15 mi, ilk kez ve 10 ml ikinci kez) ile her bir hücre peleti iki kez yıkayın. İkinci yıkama için iplik önce aynı tüp içine 10 ml alikotları birleştirir. 1.0 ml GKD 2 O (hücre peleti hacim için ayarlamak için gereken) bir nihai hacim içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Yığınlaşma serbest tek bir hücre süspansiyonu bu aşamada arzu ediliyorsa, kısa bir süre için sonike edilmiş hücreler ve / veya bir 27 gauge iğneden üç kez geçirildi edilebilir. Alternatif olarak, hücre peleti -80 ° C de donduruldu ve daha ileri işleme kadar saklanabilir. İkinci durumda ise, dondurulmuş pelet yeniden süspanse edilmesi için önce buz üzerinde çözülmüş edilir. Yukarıda belirtildiği gibi 1.0 ml GKD 2 O değerindeki bir son hacim içinde, hücre topakları yeniden süspanse edin. </li><li> TransfeParçalama Matris B (0.1 mm silis küreler) ihtiva eden 2.0 ml bir vidalı kapak tüp için r, 1.0 ml hücre süspansiyonu. Biyogüvenlik kabini içindeki FastPrep-24 lizis homojenizatör yerleştirin. Tutma tüpün üstünde plaka konuştu güvence, numune tutucu içine örnekleri koyun. 6 metre / saniye hız ayarında homojenleştiricide 60 sn örnekleri işleyin. </li><li> 15.000 x g&#39;de ve 4, bir mikrosantrifüj içinde örnekleri döndürme ° C&#39;de pellet hücre artıkları ve sağlam hücreler 10 dakika için. </li><li> Steril bir tüp içine bir şırınga filtresi (0.2 mikron) ile süpernatant ve geçiş örnek çıkarın. MA DC agar üzerinde numune Plate 0.1 ml (% 10 veya örnek olarak örnek bir temsilcisi fraksiyonu) hiçbir canlı hücre olduğunu doğrulamak için. Araştırmacılar ayrıca, birden fazla filtrasyon adım yapmak ve / veya herhangi bir potansiyel biyogüvenlik endişeleri önlemek veya belirlemek amacıyla canlı-ölü boyama prosedürleri kullanarak özler canlı hücrelerin varlığını doğrulayabilir. Depolamak için bir madde, etanol-kuru buz banyosu içinde örnekleri Dondurarak-80 ° C de bir NMR tesiste liyofilize ve işlenebilir hazır oluncaya kadar. </li><li> 2 ay sonra, koloni oluşturan birimlerin yokluğu doğrulamak için plakaları kontrol edin. Hiçbir CFU en bulunursa, örnekleri BSL3 laboratuar dışına alınabilir. Diğer analizler normal olarak çoklu kullanıcı sunmaktadır ve herhangi bir özel önleme şartları altında çalışan bir standart NMR odası içinde gerçekleştirilir. </li><li> Kuruyana kadar Lyophilize numuneleri, daha sonra NMR tampon ve bir mikrosantrifüj tüpüne transfer 0.7 ml içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 13,000 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. 0.6 ml ve 5 mm NMR tüpü transfer çıkarın. Alternatif olarak, liyofilize örnekleri olmayan biyozararli düzenli örnekleri gibi harici tesisine gönderilecek olabilir. </li><li> NMR verileri hemen toplanır. Tüm önlemlere rağmen, aktif enzimler hala mevcut olabilir ve örnek uzun süre için genellikle istikrarlı değildir. Örnekler m ° C ila oda sıcaklığında ve 4 &#39;te dışında kaldığında NMR spektrum değişiklikler belirgin hale gelmektedirler1 hafta daha cevher. Ayrıca, NMR veri toplama örnekler rastgele her kategoride seçilen tedavi ve ilaç tedavi kültürler arasındaki izliyor. NMR spektrumları toplanmıştır önce belirli bir kategoriye daha uzun bir gecikme vardı çünkü bu gereksiz önyargı önler. Tüm işlem görmemiş örnekler için NMR spektrumu, ilaç tedavisi örnekleri birinci toplanmış ve daha sonra takip edildi eğer veri bir sapma meydana gelmektedir. Örnekler hemen NMR ile analiz edilmesi mümkün değilse, numuneler -80 ° C&#39;de 1 ml Eppendorf tüpleri saklanmalıdır </li><li> Örneğin, kilit, şim, ayar ve 90 ° darbe uzunluğu optimizasyonu gibi birkaç rutin adımları içeren bir BACS-120 numune değiştirici, cihaz kalibrasyonu, içine numune yerleştirdikten sonra sonuçların kalitesini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Tek bir numune 90 ° nabız süresini ayarlamak ve kalan numuneler için araç ayarlamak için kullanılır. Kilitleme shimming ve her örnek için NMR veri toplama otomatik istimal olduğunug ICONNMR ve gradshim. </li><li> A 1D 1H NMR spektrumu uyarma heykel kullanarak su bastırmalı Bruker zgesgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 32k veri 5482.5Hz bir süpürme genişliği ile puan, 128 taramalar ve 16 kukla taramaları toplam kullanılmaktadır. A 2D 1 H-13 C HSQC spektrum Bruker hsqcetgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 5000.0 Hz süpürme genişliği ile 2048 veri noktalarının toplam doğrudan 1 H boyut boyunca toplanan ve dolaylı 13 C boyut boyunca 18864,9 Hz süpürme genişliği ile 64 veri noktaları edilir. Spektrum gürültü sinyali iyi almak için 128 taramalar ve 16 kukla taramaları ile tahsil edilir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel prosedür bir akış şeması tasvir edilmiştir. NMR tamponu 50 mM potasyum fosfat, soluk sarı stok solüsyonu50 uM TMSP ile er: <ul><li> 2.17 g K 2 HPO 4 (potasyum fosfat dibazik) </li><li> 1.70 g KH 2 PO 4 (potasyum fosfat tekbazlı) </li><li> 7.86 mg Sodyum-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D,% 98)) </li><li> &quot;100%&quot; D 2 O 500 ml suda eritilir </li><li> Nihai çözüm pH 7.2 (düzeltilmemiş) olmalıdır </li></ul> MA DC-TW veya MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4.7 g Middlebrook 7H9 broth base </li><li> 900 ml GKD 2 O </li><li> 2 ml gliserol </li><li> 25 dakika boyunca kısımlar ve otoklav karıştırın. : Aşağıdaki çözümler dokunun ve eklemek için serin sıvı </li><li> 100 ml ADC MOADC hazırlanmasında mA DC veya 100 ml OADC hazırlanmasında </li><li> 2.5 ml% 20 Tween 80 (alternatif olarak, non-metabolik% 20 Tyloxapol 1 ml) </li><li> 10 ml% 1 sikloheksimid </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20 g D (+)-glikoz </li><li> 50 g BSA FraksiyonuV </li><li> 8.5 g NaCl </li><li> 800 ml GKD 2 O </li><li> Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C&#39;de depolayın </li></ul> Alternatif olarak, OADC (1L) hazırlamak için% 1 oranında oleik asit (aşağıda tarif 250 mL&#39;lik bir toplu hale getirir) artı 50 ml yukarıda listelenen tüm bileşenlerini ekleyin. Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. Şişe 4 ° C&#39;de alüminyum folyo ve mağaza sarılmış gerekmektedir <ul><li> 2.5 g Oleik Asit </li><li> 250 ml 0.2 M NaOH </li><li> 55 ısı ile Çözünme oleik asit (soğutma üzerine katılaşan) ° 10 dakika ve 60 dakika için karıştırma ile NaOH çözeltisi ve ısı ile eklemek için C&#39;dir. Alüminyum folyo ile sarılmış steril cam şişelerde saklayın. 4 at parafilm ve mağaza ile Seal şişeleri ° C. </li></ul> Tercih ederseniz, katalaz Zenginleştirme ile ticari BD BBL Middlebrook ADC veya OADC satın alabilirsiniz. % 1 Sikloheksimit (100ml) </strong&gt; <ul><li> 1 g sikloheksimid </li><li> 100 ml GKD 2 O </li></ul> Çözülür ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C&#39;de depolayın Dikkat: sikloheksimid son derece dikkatle ele kadar zehirli olduğunu. % 20 (v / v) Tween 80 (100ml) <ul><li> 20 ml Tween 80 </li><li> 80 ml ​​GKD 2 O </li></ul> % 20 w / v çözelti hazırlamak için, alternatif olarak, Tween 80 ve 20 g (yoğunluk 1.06 g / mL, yaklaşık 18.9 ml) tartın. 55 Isı çözümü ° C 30 dk erimesi ve tamamen karıştırmak için. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın. % 20 (v / v) Tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ml Tyloxapol </li><li> 80 ml ​​GKD 2 O </li></ul> % 20 w / v çözelti hazırlamak için; Alternatif olarak, Tyloxapol 20 g (yoğunluğu 1,1 g / mL, yaklaşık 18.2 ml) tartın. Di için 30 dakika için 55 ° C ısıya çözeltissolve ve tamamen karıştırın. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın. Not 1: M. Gliserol stokları tüberküloz aşağıdaki protokol kullanılarak hazırlanmıştır. M. Stoklama tüberküloz <ul><li> M. büyütün doygunluk 50 ml mA DC tüberküloz (OD 600 = 1.5 ila 2.0) 37 ° C sallayarak koşulları (100 rpm) altında. Suşu bağlı olarak, bu 7-14 gün sürer. </li><li> Pelet kültür için 15 dakika için 4 ° C&#39;de 2.000 x g&#39;da örnekleri Spin. Süpernatantı. </li><li> Steril% 50 gliserol 6 ml süspanse edin. </li><li> 4 Corning kriyojenik şişeleri ve etiket uygun içine tablet 1,5 ml. </li><li> -80 Etanol / kuru buz banyosu ve mağaza hemen flaş dondurma şişeleri ° C. </li></ul> Not 2: aşılamak suşu H37Rv (-80 ° 1,5 yaşında C stok) mA DC medya 70 mL &lt;bir OD 600 verir/ Bir Innova 40 Shaker sallayarak koşullar (100 rpm) altında 37 ° C&#39;de büyüme 5 gün sonra yaklaşık 0,6 alt&gt;. Not 3: kültür kontaminasyon test etmek için, araştırmacılar standart zengin ortam üzerine bir kültür kısım aşılamak ve gecelik inkübasyon sonrası büyüme yokluğu doğrulamak olabilir. Rutin, kültürleri koloni morfolojisi gözlemlemek ve faz-kontrast mikroskop ile incelenmesi mA DC agarda kaplanır. Açıklandığı gibi İsterseniz, kültürler PCR kullanılarak doğrulanabilir 6110 primerler IS. 3 2. Temsilcisi Sonuçlar Da hazırlanmış olan bir örnek, Şekil 2&#39;de tasvir edilen bir benzer bir NMR tayfı elde edilir. Bu spektrum, M. bir temsilidir; tüberküloz vahşi tip metabolik havuzu. Metabolitleri, doğrudan ya da dolaylı olarak, D-alanin yolu ile ilişkilidir. Ayrıca, zirve yoğunlukları büyüklüğü metabolit konsantrasyonları ile orantılıdır sunmakhücre özü. Bu nedenle tedavi kültürleri, ilaç tedavisi ve mutant suşlar arasındaki pik şiddetleri değişiklikleri metabolitleri ve metabolik yollar tedirginlikler gösterebilir. M. tüberküloz 1D 1 H NMR spektrası, bir üçlü-rezonans, Z-eksenine gradyanı kriyoprob ile donatılmış bir Bruker Avance 500 MHz spektrometre üzerinde elde edilmiştir. Spektrumu ca içerir. Bu amino asitler, nükleotid öncülleri ve glikolitik ve sitrik asit ara dahil olmak üzere 40-50 metabolitleri tanımlamak ve ölçmek mümkün olduğu 400 zirveleri. İkon Bruker yazılımı ile birlikte bir BACS-120, numune değiştirici NMR verileri toplama otomatikleştirmek için kullanılmıştır. 1D 1 H NMR spektrumları verimli (sonraki temel bileşenler analizi (PCA) veya dikey kısmi en küçük kareler diskriminant analizi eserler indükleyebilir temel koleksiyon için herhangi bir ihtiyacı ortadan kaldırarak, düz taban çözücü kaldırmak ve korumak için uyarma heykel 4 kullanılarak toplanmıştır OPLS- DA). A 1D 1 H-NMR spektrumu 5482,5 Hz ve 32K veri noktaları bir spektrum genişliği 25 ° C &#39;de toplanmıştır. 16 kukla taramaları ve 128 taramalar toplam spektrum elde etmek için kullanılmıştır. ACD Labs 1D NMR işlemci yazılım yarı-otomatik olarak her 1D 1 H NMR spektrumu işlemek için kullanıldı. Spektrumu Fourier, dönüştürülmüş aşamalı ve TMSP tepe (0.0 ppm) başvurulan idi. NMRpipe yazılım paketi, tek tek 2B 1 H-13C NMR spektrumları işlemek için kullanılan ve NMRDraw ile analiz edilmiştir. Bruker FID veri dosyasının ilk NMRpipe tarafından tanınabilir bir dosya biçimine dönüştürülür ve ardından spektrumu Fourier dönüştürüldü, faz düzeltilmiş ve sıfır doldurdu. 1D 1H NMR spektrumu ve 2D 1 H-13C NMR spektrumunda gözlenen NMR zirvelerinin 1 H ve sırasıyla 0.05 ve 0.50 ppm, 13 C kimyasal kayma toleranslar ve Madison Metabolomik Konsorsiyumu Veritabanı (MMCD kullanarak belirli metabolitlerin atanan ) <sup&gt; 5 BioMagResBank, 6 ve İnsan Metabolome Veritabanı. Özellikle 7, 1D ve 2D NMR spektrumları NMR kimyasal vardiya pik liste daha sonra İnsan Metabolome Veritabanı yüklenen nerede, elle pik toplanmış bulunmaktadır. İnsan Metabolome Veritabanı tarafından tanımlanan metabolitleri NMR rezonansı eşleşen ve metabolik ağa mensup sayısını maksimize hem esas NMR spektrumu atanır. Her bileşik veya metabolit genellikle birden CH çiftleri ve buna birden NMR rezonansı vardır. Bu nedenle deneysel NMR spektrum gözlenmiştir, bu NMR rezonansı ve daha çok, daha çok metaboliti bulunmaktadır. Benzer şekilde, aynı yol ile ilişkilendirmek birden metabolitleri tanımlamak doğru atamaları olasılığını artırır. Metabolitleri ve metabolik yolların varlığı Genlere ve genoma (KEGG) 8 Kyoto Ansiklopedisi ve MetaCyc veritabanları ile doğrulanır. 9 Mycobacterium smegmAtis M. için kullanışlı bir model sistemi tüberküloz ve diğer mikobakteriyel patojenler. M. başka yerde tanımlandığı gibi, örnek smegmatis&#39;in da sonication tarafından bozulmuş olabilir. 10. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> Şekil 2. Mycobacterium tuberculosis hücre ekstresi 1D 1H NMR spektrumu. Metabolitlerinin temsili ile ilişkili NMR zirvelerinin etiketlenir. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: AMP, adenozin mono fosfat, α-Kg, α-ketoglutarat, Glu, L-glutamat ve Ala, alanin.

<ol>
	<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).</li><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).</li><li>Clarridge, J. E., Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory.">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li><li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOGGY:+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques.">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li><li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database.">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li><li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioMagResBank.">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li><li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB:+the+Human+Metabolome+Database.">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li><li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment.">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li><li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway/genome+databases+to+160+genomes.">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li><li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria:+role+of+D-alanine+racemase.">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li><li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism:+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action.">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li><li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li><li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages:+Insights+into+the+Phagosomal+Environment.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li><li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions:+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another.">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li><li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions:+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids.">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li><li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice.">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li><li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity.">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li><li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+by+numbers:+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data.">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li><li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis.">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li><li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis.">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates.">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çalışmaların önemli bir kısmı M. Transkriptomik ve proteomik profilleri analiz var in vitro ve in vivo koşullarında çeşitli altında tüberküloz. 11-16 Sonuçta, gen ekspresyonu ve enzim aktivitesinde değişiklikler küçük molekül ağırlıklı moleküllerin konsantrasyonları değişikliklere yol açmaktadır. Bu bileşiklerin tam açıklaması metabolome oluşturmaktadır. Böylece, metabolik yolaklar uyuşturucu ve değişen büyüme koşullarına etkiler...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> ADC Zenginleştirme </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Numune Değiştirici </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NMR Bruker Avance </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Bovine Albumin Serum </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fraksiyon V </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Santrifüj Tüpleri </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml steril polipropilen </td></tr><tr><td> Kriyojenik Flakon </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2.0 ml steril polipropilen </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG Bilimsel </td><td> C-1189 </td><td> Zehirli </td></tr><tr><td> D (+) - Glikoz </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Ağır su </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Steril, düz taban, polikarbonat, 0.22 mikron PTFE membran havalandırmalı kapak </td></tr><tr><td> Flaş Freeze Flask </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Kurutucu dondur </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 L Benchtop </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Kuluçka makinesi </td><td> New Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Tezgahüstü çalkalayıcı </td></tr><tr><td> Parçalama Matris B </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Lizis Makinesi </td><td> MP Biomedicals </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Mikrofuge&#39;de 22R </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR tüpler </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> OADC Zenginleştirme </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Oleik Asit </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat dibazik </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Fosfat mono </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - mikrofuge&#39;de 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Mühürlü ve polipropilen </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Biyo-sertifikalı kapaklar ile </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge İzotop </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre Küvetleri </td><td> Hayat çizgisi </td><td> LS-2410 </td><td> 1.5 ml polistiren, 2 açık taraf </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Steril, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Şırınga Filtre </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0.2 um steril selüloz asetat </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium tuberculosis küresel ölçekte insan mortalitenin önemli bir nedenidir. Hem çok (MDR) ve yaygın-(XDR) ilaca dirençli suşların ortaya çıkması mevcut hastalık kontrol çabalarını rayından tehdit ediyor. Böylece, şu anda mevcut olanlardan daha etkili ilaçlar ve aşılar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. M. genom tüberküloz fazla 10 yıldır bilinen, fakat gen fonksiyonu ve zorunluluk bilgimizi önemli boşluklar bulunmaktadır olmuştur. Birçok çalışma bu yana gen ifadesinin küresel desenleri ile ilgili ilaçlar, oksidanlar ve büyüme koşullarının etkisini belirlemek amacıyla Transkriptomik ve proteomik düzeyde hem de gen ekspresyon analizi kullandık. Sonuçta, bu değişikliklerin nihai yanıtını birkaç bin küçük moleküler ağırlıklı kimyasal maddeler de dahil olmak üzere bakterinin metabolik kompozisyonu yansıtılır. Tedavi edilmeyen veya tr ya da yabani tip ve mutant suşlarının metabolik profilleri KarşılaştırılmasıBelirli bir ilaç ile eated, etkili bir hedef tespit edilmesini sağlar ve antitüberküloz aktivitesi olan yeni inhibitörlerinin gelişimine neden olabilir. Aynı şekilde, metabolome üzerinde iki ya da daha fazla koşulların etkileri de tespit edilebilir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) metabolik ara tanımlamak ve ölçmek için kullanılan güçlü bir teknolojidir. M. hazırlanması için bu protokol, prosedürler NMR metabolomik analiz için tüberküloz hücre ekstreleri tarif edilmektedir. Metabolitlerin korunması maksimize etmek için soğuk sıcaklıkları korurken hücre kültürleri uygun koşullar ve gerekli Biyogüvenlik Seviyesi 3 çevreleme, 1 hasat altında yetiştirilen ve mekanik lizis tabi tutulur. Hücre lizatları kurtarıldı, steril ve ultra-düşük ısılarda saklanan filtrelendi. Bu hücre özleri alikotlar canlı hücrelerinin yokluğu doğrulamak için koloni oluşturan birim için Middlebrook 7H9 agarda kaplanır. 37 inkübasyon iki ay ° C, eğer üzerine hiçbir vimümkün koloniler gözlenir, numune üretim prosesleri için tecrit tesisine kaldırılır. Özler, liyofilize edildi döteryumlanmış tampon içinde tekrar süspanse edilir ve daha sonra istatistiksel analize tabi tutulur spektroskopik verileri yakalamak, NMR aleti olarak enjekte edilir. Anlatılan prosedürler (1D) tek boyutlu 1 H NMR ve iki-boyutlu (2B) 1 H-13 C NMR analizi her ikisi için de uygulanabilir. Bu metodoloji kromatografik yöntemlere göre daha güvenilir küçük molekül ağırlığı metabolit tespiti ve hücre ekstresi metabolik kompozisyonlar daha güvenilir ve duyarlı kantitatif analizler sağlar. Işlem varyasyonları hücre parçalama aşamasını takiben de tarif paralel Proteomik analizleri için adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies at JoVE.com

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Ve metabolomik profili<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Broth kültürleri büyüme sonrasında belirlenir. Koşullar bu mikroorganizmanın metabolik profil üzerinde besin takviyeleri, oksidanlar ve anti-tüberküloz ilaçların etkilerini test etmek için değişik olabilir. Özütü hazırlanması için prosedür 1D her ikisi için de geçerlidir<sup&gt; 1</sup&gt; H ve 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR analizleri.

Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

sample-preparation-mycobacterium-tuberculosis-extracts-for-nuclear

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Immunology and Infection

Unit 1

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Principles of Nuclear Magnetic Resonance

SCIENTISTS IN ACTION

15.3K Görüntüleme.  University of Nebraska-Lincoln. Ve metabolomik profili Mycobacterium tuberculosis Broth kültürleri büyüme sonrasında belirlenir. Koşullar bu mikroorganizmanın metabolik profil üzerinde besin takviyeleri, oksidanlar ve anti-tüberküloz ilaçların etkilerini test etmek için değişik olabilir. Özütü hazırlanması için prosedür 1D her ikisi için de geçerlidir 1 H ve 2D 1 H- 13 C NMR analizleri.

Video: Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan&gt; Özel Transkript

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pure Shift Nuclear Magnetic Resonance: a New Tool for Plant Metabolomics

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not only provides quantitative data but also permits structural identification of the metabolites present in complex mixtures.
Metabolic profiling by 1H NMR has proven useful in the study of various types of plant scenarios, which include the evaluation of crop&#160;conditions, harvest and post- harvest treatments, metabolic phenotyping, metabolic pathways, gene regulation, identification of biomarkers, chemotaxonomy, quality control, denomination of origin, among others. However, signal overlapping of the large number of resonances with expanded J-coupling multiplicities complicates the spectra analysis and its interpretation, and represents a limitation for classical 1H NMR profiling.
In the last decade, novel NMR broadband homonuclear decoupling techniques through which multiplet signals collapse into single resonance lines - commonly called Pure Shift methods - have been developed to overcome the spectra resolution problem inherent to 1H NMR classical spectra.
Here a step-by-step protocol of the plant extract preparation and the procedure to record optimal Pure Shift PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE spectra in three different plant matrices - Vanilla plant&#160;leaves, potato tubers (S. tuberosum), and Cape gooseberries (P. peruviana) - is presented. The effect of the gain in resolution in metabolic identification, correlation analysis and multivariate analyses, as compared against classical spectra, is discussed.

<meta charset="utf8"></head><body>Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

This paper presents the use of PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE in the metabolic profiling of plants and includes detailed procedures for sample preparation and optimal Pure Shift NMR spectra recording. Examples through which the gain in resolution achieved by homonuclear decoupling allows a more comprehensive understanding of the system are discussed.

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not ...

Biyokimya

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Nörobilim

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each other at the biochemical level1. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of several technologies, including gas chromatography&#x2013;mass spectrometry (GC-MS), with considerable promise for such studies. Advantages of NMR are that it is suitable for untargeted analyses, provides structural information and spectra can be queried in quantitative and statistical manners against recently available databases of individual metabolite spectra2,3. In addition, NMR spectral data can be combined with data from other omics levels (e.g. transcriptomics, genomics) to provide a more comprehensive understanding of the physiological responses of taxa to each other and the environment4,5,6. However, NMR is less sensitive than other metabolomic techniques, making it difficult to apply to natural microbial systems where sample populations can be low-density and metabolite concentrations low compared to metabolites from well-defined and readily extractable sources such as whole tissues, biofluids or cell-cultures. Consequently, the few direct environmental metabolomic studies of microbes performed to date have been limited to culture-based or easily defined high-density ecosystems such as host-symbiont systems, constructed co-cultures or manipulations of the gut environment where stable isotope labeling can be additionally used to enhance NMR signals7,8,9,10,11,12. Methods that facilitate the concentration and collection of environmental metabolites at concentrations suitable for NMR are lacking. Since recent attention has been given to the environmental metabolomics of organisms within the aquatic environment, where much of the energy and material flow is mediated by the planktonic community13,14, we have developed a method for the concentration and extraction of whole-community metabolites from planktonic microbial systems by filtration. Commercially available hydrophilic poly-1,1-difluoroethene (PVDF) filters are specially treated to completely remove extractables, which can otherwise appear as contaminants in subsequent analyses. These treated filters are then used to filter environmental or experimental samples of interest. Filters containing the wet sample material are lyophilized and aqueous-soluble metabolites are extracted directly for conventional NMR spectroscopy using a standardized potassium phosphate extraction buffer2. Data derived from these methods can be analyzed statistically to identify meaningful patterns, or integrated with other omics levels for comprehensive understanding of community and ecosystem function.

A method for metabolite extraction from microbial planktonic communities is presented. Whole community sampling is achieved by filtration onto specially prepared filters. After lyophilization, aqueous-soluble metabolites are extracted. This approach allows for application of environmental metabolomics to trans-omics investigations of natural or experimental microbial communities.

Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Biyoloji

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well as other phenotypic characteristics. However, they all have in common the most relevant character of mycobacteria: its unique and highly hydrophobic cell wall. Mycobacteria species contain a membrane-covalent linked complex that includes arabinogalactan, peptidoglycan, and long-chains of mycolic acids with types that differ between mycobacteria species. Additionally, mycobacteria can also produce lipids that are located, non-covalently linked, on their cell surfaces, such as phthiocerol dimycocerosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), glycopeptidolipids (GPL), acyltrehaloses (AT), or phosphatidil-inositol mannosides (PIM), among others. Some of them are considered virulence factors in pathogenic mycobacteria, or critical antigenic lipids in host-mycobacteria interaction. For these reasons, there is a significant interest in the study of mycobacterial lipids due to their application in several fields, from understanding their role in the pathogenicity of mycobacteria infections, to a possible implication as immunomodulatory agents for the treatment of infectious diseases and other pathologies such as cancer. Here, a simple approach to extract and analyze the total lipid content and the mycolic acid composition of mycobacteria cells grown in a solid medium using mixtures of organic solvents is presented. Once the lipid extracts are obtained, thin-layer chromatography (TLC) is performed to monitor the extracted compounds. The example experiment is performed with four different mycobacteria: the environmental fast-growing Mycolicibacterium brumae and Mycolicibacterium fortuitum, the attenuated slow-growing Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), and the opportunistic pathogen fast-growing Mycobacterium abscessus, demonstrating that methods shown in the present protocol can be used to a wide range of mycobacteria.

A protocol is presented to extract the total lipid content of the cell wall of a wide range of mycobacteria. Moreover, extraction and analytical protocols of the different types of mycolic acids are shown. A thin-layer chromatographic protocol to monitor these mycobacterial compounds is also provided.

İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. Specifically, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs play a role in the host-pathogen interaction and response to environmental stress. Mtb EVs are also highly antigenic and show potential as vaccine components. The most common method for purifying Mtb EVs is density gradient ultracentrifugation. This process has several limitations, including low throughput, low yield, reliance on expensive equipment, technical challenges, and it can negatively impact the resulting preparation. Size exclusion chromatography (SEC) is a gentler alternative method that combats many of the limitations of ultracentrifugation. This protocol demonstrates that SEC is effective for Mtb EV enrichment and produces high-quality Mtb EV preparations of increased yield in a rapid and scalable manner. Additionally, a comparison to density gradient ultracentrifugation by quantification and qualification procedures demonstrates the benefits of SEC. While the evaluation of EV quantity (nanoparticle tracking analysis), phenotype (transmission electron microscopy), and content (Western blotting) is tailored to Mtb EVs, the workflow provided can be applied to other mycobacteria.

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

This protocol describes size exclusion chromatography, a facile and reproducible technique for enriching Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicles from culture supernatants.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, including metabolites, lipids, proteins, and nucleic acids, several groups have evaluated either the native or recombinant versions of bEVs for their protective potency as subunit vaccine candidates. Unlike native EVs, recombinant EVs are molecularly engineered to contain one or more immunogens of interest. Over the last decade, different groups have explored diverse approaches for generating recombinant bEVs. However, here, we report the design, construction, and enrichment of recombinant mycobacterial EVs (mEVs) in mycobacteria. Towards that, we use Mycobacterium smegmatis (Msm), an avirulent soil mycobacterium as the model system. We first describe the generation and enrichment of native EVs of Msm. Then, we describe the design and construction of recombinant mEVs that contain either mCherry, a red fluorescent reporter protein, or EsxA (Esat-6), a prominent immunogen of Mycobacterium tuberculosis. We achieve this by separately fusing mCherry and EsxA N-termini with the C-terminus of a small Msm protein Cfp-29. Cfp-29 is one of the few abundantly present proteins of MsmEVs. The protocol to generate and enrich recombinant mEVs from Msm remains identical to the generation and enrichment of native EVs of Msm.

This protocol details the enrichment of native mycobacterial extracellular vesicles (mEVs) from axenic cultures of Mycobacterium smegmatis (Msm) and how mCherry (a red fluorescent reporter)-containing recombinant MsmEVs can be designed and enriched. Lastly, it verifies the novel approach with the enrichment of MsmEVs containing the EsxA protein of Mycobacterium tuberculosis.

Numune Hazırlama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi