Bu prosedürün amacı, bitki özlerini saf vardiya NMR ile analiz etmektir. Aşağıdaki protokol, farklı bitki matrislerinden, vanilya yapraklarından, patates yumrularından ve pelerin bektaşi üzümü meyvelerinden numune hazırlamanın temel yönlerini ve optimal saf kayma ruhu ve SAPPHIRE ruh spektrumlarını kaydetmek için ayrıntılı adım adım NMR prosedürünü içerir. Proton NMR ile metabolik profilleme, bu karışımdaki her bir metaboliti tanımlamak amacıyla karmaşık bir biyolojik karışımın NMR spektrumları içindeki sayısız sinyalde sinyalle sinyali analiz etme sanatıdır.
Amaç, bitki bilimlerindeki diğer önemli alanların yanı sıra kemotaksonomi, fenotipleme, organoleptik özellikler, köken adı, metabolik tepkiler ile ilişkili olabilecek biyobelirteçleri tasvir etmektir. Proton NMR, metabolik profillemede yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, dar bir ürün spektral aralığında sınırlı genişleyen çokluklara sahip çok sayıda sinyal, spektrumun analizini ve yorumlanmasını karmaşıklaştıran geniş bir örtüşmeye yol açar.
Tipik olarak, tek bir rezonans bir ila beş Hertz arasında değişen bir genişliğe sahiptir. Bununla birlikte, yüksek oranda bağlanmış bir sinyal, 25 ila 50 Hertz'den fazla yayılabilir ve bu da sinyal örtüşme olasılığını artırır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, burada üç farklı tesis senaryosunda gösterildiği gibi spektral çözünürlüğü duyurmak için modern saf kaydırmalı NMR yöntemini uyguluyoruz.
Numune hazırlama, bitki özü hazırlama birçok şekilde gerçekleştirilebilir ve prosedür matrise bağlı olacaktır. Cape bektaşi üzümü meyveleri önce bir meyve suyuna homojenize edildi. Vanilya yaprakları bozulmadan kullanıldı ve patatesler oksidasyondan korunarak dilimlendi.
Her durumda, malzeme liyofilize edildi, öğütüldü ve daha sonra ekstrakte edildi. Pelerin, bektaşi üzümü, meyveler ve patatesler için, sonikasyon ile desteklenen ekstraksiyon için su kullanıldı. Süpernatan santrifüjleme ile geri kazanıldı, herhangi bir sıvı liyofilizasyon veya hızlı vakum ile kurutuldu.
Kuru ekstrakt, oksalat tamponu içinde yeniden süspanse edildi, kuruyana kadar buharlaştırıldı ve TMSP içeren D2O içinde yeniden çözüldü. Vanilya durumunda, ekstraksiyon, TMSP ve döteryumlu metanol içeren döteryumlu fosfat tamponu kullanılarak doğrudan yapıldı. Süpernatant ayrıca santrifüjleme ile geri kazanıldı.
Tüm numuneler bir PTFE şırınga filtresinden süzüldü ve NMR tüpleri 0.6 mililitre filtrelenmiş çözelti ile dolduruldu. NMR metabolomiklerinde numune hazırlama çok önemlidir. Prosedür belki yüzlerce kez tekrarlanacağından, gözlemlenen varyansın numune hazırlamadan değil, incelenen bitkiler arasındaki gerçek farklılıklardan kaynaklandığını garanti etmek için tam olarak aynı şekilde hazırlanmalıdır.
Saf vardiya NMR. NMR spektrumu, FID sinyalinin Fourier dönüşümünden sonra elde edilir. FID sinyali, kimyasal kayma modülasyonu ve J kuplaj bölme modelinden sorumlu J kuplaj modülasyonu olmak üzere iki bileşende ayrıştırılabilir.
J kuplaj modülasyonu, aktif dönüşler etkilenmeden kalırken pasif dönüşleri seçici olarak tersine çeviren bir J kuplaj yeniden odaklama elemanı tarafından yeniden odaklanabilir. İki eşit gecikmeden sonra kimyasal J kaplini tamamen yeniden odaklanır. Bir anti-z-COSY deneyine dayanan psyche elemanı, onu NMR metabolomiği için uygun kılan özellikler olan en sağlam ve hassas geniş bant yeniden odaklama elemanlarından biridir.
Saf kayma deneyleri, kimyasal kayma kaydı sırasında J kuplaj evriminin yeniden odaklanmasına dayanır. Bu tipik olarak, J kaplin yeniden odaklama noktasını hareket ettirmek için gecikmeleri artırarak gerçekleştirilir. Kimyasal kayma J eşleşmesinden daha yüksek bir frekansta evrimleştikçe, homonükleer ayrıştırılmış bir deney interferogram tarzında kaydedilebilir.
İnterferogram edinimi, FID'nin, her zaman elde edilen yığının merkezi ile çakışan, J eşleşme evriminin yeniden odaklanma noktası ile küçük parçalar halinde kaydedilmesinden oluşur. Ayrıştırılmış FID, birbirini izleyen her öbeğin birleştirilmesiyle oluşturulur. NMR veri toplama kurulumu, numuneleri NMR spektrometresine aktarın.
Prob kafasını ayarlayın ve eşleştirin, numuneyi kilitleyin ve şimleyin. 90 derecelik sert darbeyi kalibre edin. Standart bir 1D proton NMR spektrumu çalıştırın.
Ruh deneyi. Bruker TopSpin kitaplığından sıfırlama psyche 1D nabız dizisini seçin. Spektrum genişliğini beş kilohertz olarak ayarlayın.
Gevşeme toparlanması en az bir veya iki saniye gecikir. Kukla 16'ya kadar tarar. Tarama sayısını 64 veya 128 ve blok başına karmaşık veri noktası sayısı, 64 veya 128, istenen cıvıltı darbe çevirme açısı uyarımını ayarlar.
Hassasiyet ve düşük yeniden birleştirme artefaktları arasında iyi bir şey, cıvıl cıvıl darbe bant genişliği için sabit 61 ila 20 derece, 10 kilohertz'i ayarlamaktır. Sabit darbe uzunluğunu önceden kalibre edilmiş ses seviyesine ve ruh şekli darbe uzunluğunu 30 milisaniyeye ayarlayın. Crp_psyche seçin.
Ruh elemanı için 20 şekil nabzı. Ruh elemanı sırasında uygulanan nabız alanı gradyanının gücü, proba bağlı olarak normal olarak gradyanın maksimum mukavemetinin %1 ila %4'ü arasında ayarlanır. RECT'i seçin.
Degrade şekil darbesi için 1. Saf kaydırma FID'sini yeniden oluşturmak için elde edilecek blok sayısını ayarlayın. Tipik olarak, blok başına 64 veya 128 karmaşık nokta içeren 16 veya 32 blok, yeterli dijital çözünürlük sağlayacak, spektrumu çalıştıracak ve verileri işleyecektir.
Bruker'in proc_reset AU programı ve ardından Fourier dönüşümü ile. Spektrumu sıfır doldurma ve sinüs çan apodizasyonu kullanarak dönüştürmenizi öneririz. Psyche sahte bir 2D interferogram deneyidir.
Saf bileşiğin analizinde tipik olarak beş ila 20 milisaniye arasında değişen her bloğun edinimi sırasında küçük J birleştirme evriminden gelen periyodik yan açıklık artefaktından elde edilen yazılımdır, bu artefaktlar normalde ana tepe noktasının %5'inden daha azını temsil ettikleri için ihmal edilebilir. Bununla birlikte, karmaşık karışımlarda, bazı metabolitlerin yan açıklık artefaktörü, metabolik analizin doğruluğunu tehlikeye atan daha az konsantre metabolitlerin sinyalinden daha büyük veya daha büyük olabilir. Bu artefaktlar, Morris Lab SAPPHIRE psyche deneyinde geliştirilen SAPPHIRE psyche adlı bir psyche deneyinin modifikasyonu kullanılarak verimli bir şekilde çıkarılabilir.
Ayrıştırılmış spektrumu elde etmek için, darbe dizisi, her bloğun ortasındaki J kuplajında küçük FID yeniden odaklama parçaları alır. Bununla birlikte, her blok sırasında küçük bir J eşleşme evrimi meydana gelir ve periyodik yan bant artefaktlarını oluşturur. SAPPHIRE psyche deneyi, bu periyodik artefaktların, J yeniden odaklama noktasındaki kayma ile elde edilen sistematik faz modülasyonu ile uzaklaştırıldığı düzenli ruh dizisinin bir modifikasyonudur.
Her faz modülasyonu eklendikten sonra, artık J kuplaj evrimi yüksek oranda bastırılır ve çok daha temiz bir saf kayma spektrumu elde edilir. SAPPHIRE psyche nabız dizisini seçin ve nabız dizisi parametrelerini ayarlayın. Bu sekans Bruker'in repertuarında yer almamaktadır, ancak sekans ve işleme programları Manchester NMR metodoloji grubu web sitesinden edinilebilir.
Standart parametreler aşağıdaki değerlere, beş kilohertz spektral genişlike, en az bir veya iki saniye gevşeme gecikmesine ayarlanmıştır. 16 sahte tarama, artış başına sekiz veya 16 tarama ve D2 14 milisaniyeye ayarlandı. Bu parametre, gevşeme T2'nin her J modülasyon artışında sabit kalmasını sağlar.
İstenen cıvıltıyı, darbe çevirme açısını, uyarma değerini ve darbe bant genişliğini ayarlayın. Sabit darbe uzunluğunu önceden kalibre edilmiş değere ve ruh şekli darbe uzunluğunu 30 milisaniyeye ayarlayın. Ruh elementi için PSYCHE_Saltire_10kHz_30m şekli nabzını seçin.
Ruh elemanı sırasında uygulanan nabız alanı gradyanının gücünü ayarlayın. Degrade şekli için RECT. 1'i seçin.
F2'de Sapphire J modülasyon artışlarının sayısını ayarlayın, normalde sekiz artış, yan bant artefaktlarının mükemmel bir şekilde bastırılmasını sağlar. Aşağıdaki ifadeleri kullanarak, seçilen F3 spektral penceresi değerinden hesaplanan F1 ve F2 spektral pencerelerini ayarlayın. SW1'in üzerinde bir olarak tanımlanan saf kaydırma bloğu süresi tipik olarak 20 ila 40 milisaniye arasında ayarlanır.
Saf kaydırma bloklarının sayısını ayarlayın. SAPPHIRE psyche'nin ilk bloğun ayrışma faz modülasyonunu telafi etmesi gerektiğinden, fazladan bir blok eklenmesi gerekir. Tipik olarak, 17 veya 33 blok yeterli dijital çözünürlük verir.
Verileri işleyin, pm_pshift ve pm_fidadd AU programlarında yürütün ve ardından Fourier dönüşümü yapın, spektrumu sıfır doldurma kullanarak dönüştürmenizi ve çan apodizasyonu atamanızı öneririz. Sonuçlar, SAPPHIRE psyche deneyleri, üç farklı bitki matrisinde gösterildiği gibi, birleştirilmiş rezonansları güzel keskin tekillere daraltarak spektrum çözünürlüğünü artırır. Vanilya yaprakları, Physalis Peruviana meyveleri ve SAPPHIRE Psyche kompleks çokluklarına sahip patates yumruları, örneğin, 40 Hertz'e kadar genişleyen neredeyse sürekli sinyaller üreten homositrik asidin yüksek oranda bağlanmış hidrojenleri üç keskin singlet'e çöktü.
Bölgedeki diğer sinyalleri maskeleyebilecek kalabalığı azaltmak. Elde edilen çözünürlük ayrıca, homositrik asidin lakton olduğu ve malik asit rezonanslarının ortaya çıktığı 2.6 ila 2.8 PPM arasındaki yüksek oranda örtüşen bölgenin net bir şekilde çözülmesini kolaylaştırdı. Örneğin, vanilyadaki temel biyobelirteçler, normal proton NMR'deki glukozitlerinkilerle örtüşen sinyaller, çözünürlükteki bu olağanüstü kazanç nedeniyle SAPPHIRE spektrumlarında daha iyi tanımlandı. Sonuç.
Saf vardiya, bitki metabolomikleri için mükemmel bir yeni araçtır. Spektrum çözünürlüğünü büyük ölçüde artırdı ve bu nedenle daha kolay bir metabolit tanımlamasına, daha ince bir korelasyon metrik analizine ve çok değişkenli analizin daha iyi yorumlanmasına izin verdi. Bu videoyu izledikten sonra, NMR analizi için farklı plan ekstraktının nasıl hazırlanacağını ve optimal saf kayma ruhu ve SAPPHIRE ruh spektrumunun nasıl kaydedileceğini iyi anlayacaksınız.
