저자는 프로토콜을 개발하면서 도움이 의견 박사 Barletta 박사의 힘 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 도움이 토론 및 교정을 위해 웬디 오스틴 감사드립니다. 이 원고에 설명 된 작업은 네브라스카 - 링컨 산화 환원 생물학 센터 (부모 부여 # NCRR 2P20RR 017675, D. 베커, PI)의 대학에서 위에 나열된 각 조사자에 씨앗 파일럿 교부금의 지원을받는되었다. 또한, 우리는 연구 용품 및 본 출판물에 포함 된 NMR 기법을 표준화 씨 Halouska의 부분 급여 지원을위한 그녀의 R21 부여 (1R21AI087561-01A1)에서 자금을 제공하기 위해 박사 오필리아 Chacon 감사드립니다.

1. 프로토콜 텍스트 이 프로토콜은 M.에 NMR 방법론의 적응을 강조 결핵 (클래스 III 에이전트). M.을 실시 할 때 따라서 바이오 레벨 3 (BSL3) 관행 준수해야 매년 인증 실험실에서 결핵 연구. 실험실에서 생성 된 에어로졸에 노출이 미생물과 협력 요원에 의해 발생하는 가장 중요한 위험합니다. 다음 절차는 우리 기관에서 실시하고 있습니다 및 변형은 기관 바이오위원회의 권고에 따라있을 수 있습니다. 일반 직원은 보호 장비는 Tyvek 옷, bouffant 모자, 덧신, N95의 인공 호흡기, 눈 보호, 소매 및 니트릴 장갑의 두 쌍 구성됩니다. M. 관련된 작업 오픈 M.과 결핵 문화 및 / 또는 조작 결핵 용기는 타입 A2 또는 B2 생물학적 안전 캐비닛에 수행됩니다. 플라스틱으로 덮인 흡수 종이는 w에 위치표면을 orking. 폐기 또는 시설에서 제거 할 모든 자료 / 소모품은 두 개의 생물학적 가방에 배치하고 autoclaving하여 소독해야합니다. 작업 표면과 캐비닛 (FastPrep-24 용해 균질, 분광 광도계, 얼음 양동이 등)에서 활용 장비는 1 % Amphyl (tuberculocidal, bactericidal 살균제의, 그리고 virucidal 대리인) 각 작업 세션 후 소독을해야합니다. M.는 결핵 문화가 같은 냉동고, 인큐베이터, 원심 분리기, 그리고 냉장고와 같은 생물학적 안전 캐비닛의 외부에 위치한 큰 장비 운송을 위해 이중 억제 아래에 위치해야합니다. 원심 분리는 동봉 된 안전 컵 및 O-링 나사 톱 튜브 진행됩니다. BSL3 실험실 이외의 추가적인 분석을 위해, 세포가없는 추출물은 15 분 동안 95 ° C에서 살해 0.2 μm 필터 나 미생물 열을 통해 필터링됩니다.이 샘플은 사전 봉쇄로부터 제거에 집락 형성 단위의 부재를 확인하기 위해 도금입니다. <ol><li> 110 폴리 솔 베이트 80 (십대 초반 80 거리며 걷게을 방지하기 위해)를 포함하는 미들 7H9 전체 미디어 ML 국물 (MADC-TW) 또는 250 ML Erlenmeyer 플라스크에 적합한 매체입니다.을 전송 C-metabolites 13를 사용할 때 세중의 문화는 정기적으로 상태에 따라 재배, 10 동일한 문화는 1D 한 H NMR 프로파일에 대한 성장하고 있습니다. 두 조건 (예를 들어, 약물의 추가로 및 제외) 복제 당 문화의 두 볼륨이 성장하고 두 개의 동일한 문화로 분할 할 수 있습니다하십시오. 모든 시약 및 솔루션 조리법은 프로토콜의 끝 부분에 제공됩니다. </li><li> M.의 0.150 ML로 국물을 예방 결핵 50 % 글리세롤 주식 (얼음 해동 할 수 있습니다.) 아래 참고 1을 참조하십시오. </li><li> 문화가 37 성장하자 ° C 약 6 일 (OD 600 0.6-0.8) 100 rpm으로 흔들어. 아래의 2 내용을 참조하시기 바랍니다. </li><li> 더 항생제 대체 추가 또는 다른 치료가 필요 없으면, 문화는 수확 할 준비가 된 것입니다. 트리트먼트를 사용하는 경우, 계속바로 5 단계입니다. 오염 검사, phenotypic 분석, PCR 검사 : 각 플라스크에서 0.5 ML 샘플을 제거, 4에서 microcentrifuge 튜브 및 장소 ° 문화 적정 및 품질 관리에 대한 C로 전송할 수 있습니다. 아래 3 참고를 참조하십시오. 이 시점에서 6 단계로 진행합니다. </li><li> 셰이커에서 플라스크를 제거하고 원하는 치료 (예, 약물이나 신진 대사를 추가)을 수행합니다. 장소는 추가 기간 (예를 들어, 6-18 시간)에 대한 흔드는 및 배양에 다시 플라스크. 이 시간의 끝에서 또 다른 1.0 ML의 나누어지는을 가지고 OD 600 결정합니다. 각 플라스크에서 0.5 ML 샘플을 제거, 4에서 microcentrifuge 튜브 및 장소 ° 문화 적정 및 품질 관리에 대한 C로 전송할 수 있습니다. </li><li> 5 분을위한 얼음에 장소는 문화. 이 단계 후에는 전체 나머지 프로토콜에 걸쳐 얼음에 세포를 두십시오. 수확 2,000 XG와 4에서 원심 분리하여 문화 ° C benchtop의 원심 분리기를 사용하여 50 ML 튜브에 15 분을위한. 각 문화는 25 ML 각 (1 총없이 네 튜브가 필요합니다00 ML은 2D 1 충분한 신호 대 노이즈를 얻기 위해 필요합니다 H-13 C 문화 당 50 ML은 1D 한 H NMR 실험에 필요한 NMR 실험). </li><li> 위에서 설명한 원심 분리 매개 변수에 의해 얼음처럼 차가운 ddH 2 O (약 15 ML 처음으로 10 ML 두 번째)와 각 셀 펠렛 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척의 경우 회전하기 전에 같은 튜브에 10 ML의 aliquots 조화를 이루고 있습니다. 1.0 ML ddH 2 O (세포 펠렛 볼륨을 조정해야합니다)의 최종 볼륨에서 세포 펠렛을 Resuspend. 거리며 걷게 무료로 하나의 세포 현탁액이 단계에서 원하는 경우, 전지가 잠시 sonicated 및 / 또는 27 게이지 바늘을 통해 세 번 통과 할 수 있습니다. 또한, 세포 펠렛은 -80 ° C에서 냉동 및 추가 처리까지 저장할 수 있습니다. 후자의 경우, 냉동 펠릿은 resuspension하기 전에 얼음에 해동됩니다. 위의 언급 1.0 ML ddH 2 O의 최종 볼륨에서 셀 알약을 Resuspend. </li><li> TransfeLysing 매트릭스 B를 (0.1 mm의 실리카 분야) 포함 2.0 ML 스크류 캡 튜브에 R 1.0 ML 세포 현탁액. 바이오 캐비닛 내부의 FastPrep-24 용해 균질를 놓습니다. 유지는 튜브의 상단에 판을 말씀 확보, 샘플 홀더에 샘플을 놔. 6m / 초의 속도 설정에서 균질에서 60 초에 샘플을 처리합니다. </li><li> 15,000 XG과 4에서 microcentrifuge에서 샘플을 돌려 ° C 펠렛 세포 파편과 그대로 셀에 10 분을위한. </li><li> 멸균 튜브에 주사기 필터 (0.2 μm)를 통해 표면에 뜨는 및 패스 샘플을 제거합니다. MADC 한천의 샘플 플레이트 0.1 ML (또는 10% 예를 들어 같은 샘플의 대표 분율은) 더 실용적 세포가 있는지 확인합니다. 조사는 또한 하나 이상의 여과 단계를 수행 및 / 또는 잠재적 인 바이오 안전성 문제를 방지하거나 식별 할 수 있도록 실시간 죽은 착색 절차를 사용하여 추출물에서 가능한 세포의 존재를 확인할 수 있습니다. 저장하는 에탄올 드라이 아이스 욕조에서 샘플을 고정-80 ° C에서 사람들이 NMR 시설에서 동결 건조하여 처리 할 준비가 될 때까지. </li><li> 2개월 후, 식민지 형성 단위의 부재를 확인하기 위해 번호판을 확인합니다. 더 CFU의이 발견되면, 샘플은 BSL3 실험실에서 촬영 될 수 있습니다. 또한 분석은 일반적으로 다중 사용자를 제공하며, 특별한 억제 요구 사항에 따라 작동하는 표준 NMR 시설에서 수행됩니다. </li><li> 건조에 샘플을 Lyophilize 다음 NMR 버퍼와 microcentrifuge 튜브에 전송 0.7 ML에 resuspend. 13,000 X g에서 3 분을위한 원심 분리기. 0.6 ML와 5 밀리미터 NMR 튜브에 전송을 제거합니다. 또는 동결 건조 된 샘플은 비 biohazardous 정기적으로 샘플 같은 외부 시설에 우편으로 발송 될 수 있습니다. </li><li> NMR 데이터가 즉시 수집됩니다. 모든 예방 조치에도 불구하고, 활성 효소는 여전히 존재할 수 있으며 샘플은 오랜 기간 동안 일반적으로 안정되지 않습니다. 샘플 m에 대한 ° C 실온에서 또는 4에서 탈락 할 때 NMR 스펙트럼의 변화는 눈에 띄는 아르일주보다 광석. 또한, NMR 데이터 수집이 샘플을 무작위로 각 카테고리에서 선택 치료 및 약물 치료를 문화, 가끔 있습니다. NMR의 스펙트럼가 수집되기 전에 특정 범주가 더 이상 지연을 가지고 있기 때문에 불필요한 편견을 방지 할 수 있습니다. 모든 치료 샘플 NMR의 스펙트럼은 약물 치료를 샘플에서 첫번째 수집하고 원인이 된 경우 데이터에 편견이 발생합니다. 샘플은 즉시 NMR에 의해 분석 할 수없는 경우, 샘플은 -80 ° C.에서 1 ML Eppendorf 튜브에 보관해야합니다 </li><li> 이러한 잠금, 심, 조정하고, 90 ° 펄스 길이의 최적화와 같은 몇 가지 일상적인 단계를 포함 후퇴-120 샘플 체인저, 악기 보정,에 샘플을 삽입 한 후 검색 결과의 품질을 최대화하기 위해 필요합니다. 하나의 샘플은 90 ° 펄스 길이를 보정하고 나머지 샘플 악기를 조정하는 데 사용됩니다. , 잠금 shimming, 모든 샘플에 대한 NMR 데이터 수집이 자동으로 쓰겠다고합니다g ICONNMR 및 gradshim. </li><li> 1D 1 H NMR 스펙트럼은 여기 조각을 사용하여 물 억제와 함께 Bruker zgesgp 펄스 시퀀스를 사용하여 수집됩니다. 32K 데이터 5482.5Hz의 스윕 폭 포인트 128 스캔,​​ 16 더미 스캔의 총 사용됩니다. 2D 한 H-13 C HSQC 스펙트럼은 Bruker hsqcetgp 펄스 시퀀스를 사용하여 수집됩니다. 5000.0 Hz의 스윕 폭 2,048 데이터 포인트의 총 직접 한 H 치수 함께 수집하고, 간접 13 C 치수를 따라 18864.9 Hz의 스윕 폭 64 데이터 포인트입니다. 스펙트럼은 소음에 좋은 신호를 얻기 위해 128 스캔 및 16 더미 스캔으로 수집됩니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 절차의 흐름 다이어그램이 그려져 있습니다. NMR 버퍼 50 MM 칼륨 인산 버프의 주식 솔루션50 μM의 TMSP과 어 : <ul><li> 2.17 g K 2 HPO 4 (인산 칼륨 이염 기성) </li><li> 1.70 g KH 2 PO 4 (인산 칼륨 일 염기의) </li><li> 7.86 MG 나트륨-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98 %)) </li><li> &quot;100 %&quot;D 2 O 500 ML에 디졸브 </li><li> 최종 솔루션은 산도 7.2 (교정)에 있어야합니다 </li></ul> MADC-TW 또는 MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4.7 g 미들 7H9 국물베이스 </li><li> 900 ML ddH 2 O </li><li> 두 ML의 글리세롤 </li><li> 25 분의 구성 요소와 압력솥을 섞는다. 다음 솔루션을 터치하고 추가 할 수 차가운 액체 </li><li> 100 ML ADC MOADC를 준비 할 때 MADC 또는 100 ML의 OADC를 준비 할 때 </li><li> 2.5 ML 20% 십대 초반 80 (또는 비 metabolizable 20 % Tyloxapol 1 ML) </li><li> 10 ML 1 % cycloheximide </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20g D (+) - 포도당 </li><li> 50g BSA 비율V </li><li> 8.5 g NaCl </li><li> 800 ML ddH 2 O </li><li> 함께 용해 량 1 L로 조정하고 0.2 μm 필터로 소독. 4 ° C.에 저장 </li></ul> 또한, OADC (1L)를 준비하는 1 %의 올레 산 (아래의 제조법은 250 ML 배치하게)의 플러스 50 ML 위에 나열된 모든 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 함께 용해 량 1 L로 조정하고 0.2 μm 필터로 소독. 병은 4 ° C.에 알루미늄 호일과 가게에서 포장해야 <ul><li> 2.5 g의 올레 산 </li><li> 250 ML 0.2M NaOH </li><li> 55에서 가열하여 해동 올레 산 (냉장에 굳은) ° 10 분 및 60 분에 교반과 NaOH 용액 및 열 추가를위한 C. 알루미늄 호일에 싸서 아르 멸균 유리 병에 저장합니다. 4에 parafilm 및 매장과 인감 병 ° C. </li></ul> 선호 경우, 카탈라아제 강화와 상업 BD BBL 미들 ADC 또는 OADC을 구입할 수 있습니다. 1 % Cycloheximide (100ml) </STRONG&gt; <ul><li> 1g cycloheximide </li><li> 100 ML ddH 2 O </li></ul> 용해와 0.2 μm 필터로 소독. 4 ° C.에 저장 주의 : cycloheximide는 극단적 인 손질 때문에 독성이 있습니다. 20 % (V / V) 십대 초반 80 (100ml) <ul><li> 20 ML 십대 초반 80 </li><li> 80 ML ddH 2 O </li></ul> 20% w / V 솔루션을 준비하기 위해, 또는 십대 초반 80 20g (밀도 1.06 g / ML 약 18.9 ML)를 무게. 55 열 솔루션 ° C 30 분 분해하고, 완전히 혼합되도록. 0.2 μm 필터로 액체를 살균. 상온에서 최종 솔루션을 저장합니다. 20 % (V / V) Tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ML Tyloxapol </li><li> 80 ML ddH 2 O </li></ul> 20% w / V 솔루션을 준비하기 위해, 또는 Tyloxapol 20 G (밀도 1.1 g / ML 약 18.2 ML)를 무게. 디에 30 분에 55 ° C까지 열 솔루션ssolve, 그리고 완전히 섞는다. 0.2 μm 필터로 액체를 살균. 상온에서 최종 솔루션을 저장합니다. 참고 1 : M.의 글리세롤의 주식을 결핵은 다음 프로토콜을 사용하여 준비가되어 있습니다. M.의 스타킹 결핵 <ul><li> M. 성장 채도 50 ML MADC의 결핵 (OD 600 = 1.5-2.0) 37의 ° C 흔들어 조건 (100 RPM)에 따라. 변형에 따라이 7~14일 소요됩니다. </li><li> 펠렛 문화에 대한 15 분에 대해 4 ° C에서 2,000 XG에서 샘플을 봐. 표면에 뜨는 제거합니다. </li><li> 살균 50 % 글리세롤 6 ML에 Resuspend. </li><li> 4 코닝 극저온 용 시험관 및 레이블 적절에 나누어지는 1.5 ML. </li><li> -80에서 에탄올 / 드라이 아이스 욕조, 매장에서 바로 플래시 동결 튜브 ° C. </li></ul> 주 2 : Inoculating 부담 H37Rv (-80 °까지 1.5 세 C 주식) MADC 미디어의 70 ML에이 &lt;OD 600 산출/ Innova 40 쉐이커에 흔들어 조건 (100 RPM)에서 37 ° C에서 성장 5 일 후 약 0.6의 하위&gt;. 3 참고 : 문화 오염을 테스트하려면 조사는 표준 풍부한 중간에 문화 나누어지는의 예방 및 야간 부화 후 성장의 부재를 확인 수 있습니다. 일상적으로, 문화는 식민지의 형태를 관찰 및 위상 대비 현미경으로 검사 MADC 한천에 도금되어 있습니다. 설명에 따라 원하는 경우, 문화는 PCR을 사용하여 검증 할 수는 6,110 프리 머입니다. 3 2. 대표 결과 잘 준비가되어 샘플도 2에 도시 된 것과 유사한 NMR 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 이 스펙트럼은 M.의 표현입니다 결핵 야생 형 신진 대사 수영장을 보유하고 있습니다. 확인 metabolites는 직접 또는 간접적 D-알라닌 경로와 연결되어 있습니다. 또한, 피크 농도의 크기는 신진 대사 농도에 비례 제시세포 추출물 인치 따라서 치료 문화, 약물 치료, 그리고 돌연변이 변종 사이의 최대 농도의 변화는 metabolites과 신진 대사 경로에 섭동을 표시 할 수 있습니다. M. 결핵 1D 한 H NMR 스펙트럼은 트리플 공명, Z-축 기울기 저온 탐침이 장착 Bruker 이동이다 500 MHz의 분광계에서 수집되었다. 스펙트럼은 CA가 포함되어 있습니다. 이 아미노산, 뉴클레오티드 전구체, 그리고 glycolytic 및 시트르산 중간체를 포함한 40-50 metabolites를 식별하고 계량화 할 수 있었는지에서 400m 봉우리. Bruker 아이콘 소프트웨어와 후퇴-120 샘플 체인저는 NMR 데이터 수집을 자동화하는 데 사용되었다. 1D 1 H NMR 스펙트럼은 효율적으로 (후속 주요 구성 요소 분석 (PCA) 또는 직교 부분 최소 제곱 판별 분석에 유물을 유도 할 수 있습니다 기본 수집에 대한 필요성을 제거, 평면 기준을 용매 제거하고 유지하기 위해 여기 조각 4를 사용 수집 된 OPLS - DA). A 1D 일 H NMR 스펙트럼은 5482.5 Hz에서와 32K 데이터 포인트의 스펙트럼 폭을 25 ° C에서 수집됩니다. 16 더미 스캔 및 128 스캔의 총 스펙트럼을 얻기 위해 사용되었습니다. ACD 연구소 1D NMR 프로세서 소프트웨어는 반 자동으로 모든 1D 한 H NMR의 스펙트럼을 처리하는 데 사용되었습니다. 스펙트럼은 푸리에는 변형 단계적으로, 그리고 TMSP 정상 (0.0 ppm으로)에 참조했습니다. NMRpipe 소프트웨어 패키지는 개별적으로 2D 한 H-13 C NMR 스펙트럼을 처리하는 데 사용하고 NMRDraw으로 분석되었다. Bruker FID 데이터 파일이 처음 NMRpipe로 인식하는 파일 형식으로 변환 한 후 스펙트럼을 푸리에는 변형 된, 단계는 수정 및 제로가 가득 찼다. 1D 1 H NMR 스펙트럼 및 2D 한 H-13 C NMR 스펙트럼에서 관찰 NMR 피크는 1 H 각각 0.05과 0.50 ppm으로, 13 C 화학적 이동 허용 오차, 그리고 매디슨 Metabolomics 컨소시엄 데이터베이스 (MMCD를 사용하여 특정 metabolites에 할당 ) <suP&gt; 5 BioMagResBank, 6과 인간 Metabolome 데이터베이스. 특히 7, 1D 및 2D NMR의 스펙트럼은 NMR 화학 변화의 피크 목록 다음 인간 Metabolome 데이터베이스에 업로드하는 위치를 수동으로 피크 선택됩니다. 인간 Metabolome 데이터베이스에 의해 식별 metabolites는 NMR의 resonances 일치하고 신진 대사 네트워크에 속하는 수를 최대화 모두에 근거하여 NMR 스펙트럼에 할당됩니다. 각 화합물이나 대사는 일반적으로 여러 CH 쌍과 상응 여러 NMR의 resonances 있습니다. 따라서, 실험 NMR 스펙트럼에서 관찰 아르 이러한 NMR의 resonances의 더 많은, 더 많은 가능성이 대사가 존재합니다. 마찬가지로, 동일한 경로와 연관 여러 metabolites를 식별하는 것은 올바른 과제 확률이 높아집니다. metabolites과 신진 대사 경로의 존재는 유전자와 Genomes (KEGG) 8의 교토 백과 사전과 MetaCyc 데이터베이스 확인했습니다. 9 Mycobacterium smegm는atis는 M.에 유용한 모델 시스템입니다 결핵 및 기타 mycobacterial 병원체. M.의 다른 설명한 바와 같이, 샘플 smegmatis도 sonication에 의해 중단 될 수 있습니다. (10) <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> 그림 2. Mycobacterium의 결핵 세포 추출물의 1D 한 H NMR 스펙트럼. 대표 metabolites과 관련된 NMR 피크가 표시됩니다. 약어는 다음과 같습니다 AMP, 아데노신 모노 포스페이트, α-kg, α-ketoglutarate, GLU, Glutamate, 그리고 알라, 알라닌.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice.">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li><li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity.">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li><li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+by+numbers:+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data.">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li><li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis.">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li><li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis.">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates.">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

연구의 상당수는 M.의 transcriptomic 및 proteomic 프로필을 분석 한 체외 및 생체 조건에서의 다양한 미만의 결핵. 11-16 궁극적으로 유전자 발현 및 효소 활동의 변화는 작은 분자량 분자의 농도의 변화로 이어집니다. 이 화합물의 전체 설명은 metabolome을 구성합니다. 따라서, 신진 대사 경로에 마약과 다양한 성장 조건의 효과는 metabolomic 분석 다음 될 수 있습니다. 17,18</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> ADC 농축 </td><td> BD BBL 미들 </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> 절대 후퇴-120 샘플 체인저 </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bruker 이동이다 NMR </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz의 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP1600-100 </td><td> 분수 V </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> Allegra X-15R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> 원심 분리기 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 430291 </td><td> 50 ML 멸균 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> 극저온 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 430488 </td><td> 2.0 ML 멸균 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG 과학 </td><td> C-1189 </td><td> 유독 한 </td></tr><tr><td> D (+) - 포도당 </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> 중수소 산화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer 플라스크 </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> 살균, 평면 기지, 폴리 카보네이트, 0.22 μm PTFE 막 환기 캡 </td></tr><tr><td> 플래시 프리즈 플라스크 </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ML </td></tr><tr><td> 건조기를 고정 </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 L Benchtop </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> 뉴 브런 즈윅 </td><td> Innova 40 </td><td> Benchtop 흔드는 </td></tr><tr><td> Lysing 매트릭스 B </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> 용해 기계 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 에프astPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> Microfuge 22R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> 미들 7H9 국물 </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR 튜브 </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> OADC 강화 </td><td> BD BBL 미들 </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> 올레산 </td><td> 시그마 </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> 이염 기성 인산 칼륨 </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> 회 전자 - Microfuge 22R </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> F241.5P </td><td> 봉인 및 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> 회 전자 - Allegra X-15R</td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> SX4750 </td><td> 바이오 인증 표지가있는 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> 캠브리지 동위 원소 </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> 분광 광도계 큐벳 </td><td> 생명선 </td><td> LS-2410 </td><td> 1.5 ML의 폴리스티렌, 2 맑은 편 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 309585 </td><td> 살균, 3 ML Luer - 무사히 다녀 오게 </td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0.2 μm 멸균 셀룰로스 아세테이트 </td></tr><tr><td> 십대 초반 80 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium 결핵은 세계적 규모의 인간의 사망의 주요 원인입니다. 모두 다 (MDR)과 광범위하게 - (XDR) 약제 내성의 변종의 출현은 현재 질병 관리 노력을 탈선 위협하고 있습니다. 따라서, 현재보다 더 효과적인 의약품 및 백신을 개발하기 위해 긴급한 필요가있다. M.의 게놈 결핵은 10 년 이상 알려져 아직 유전자 기능과 본성에 대한 지식의 중요한 차이가 있습니다되었습니다. 많은 연구가 이후 유전자 발현의 글로벌 패턴에 마약, oxidants, 그리고 성장 조건의 효과를 결정하기 위해 transcriptomic 및 proteomic 수준 모두에서 유전자 발현 분석을 사용했습니다. 궁극적으로, 이러한 변경 사항의 최종 응답은 몇 천 작은 분자량의 화학 물질을 포함하여 세균의 대사 구성에 반영됩니다. 치료 또는 TR하거나, 야생 유형 및 돌연변이 변종의 대사 프로파일을 비교특정 약물과 함께 eated 효과적으로 목표 식별을 허용 할 수 및 안티 결절 활동으로 소설 억제제의 발전으로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, metabolome에 두 개 이상의 조건​​의 영향도 평가 할 수 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR)은 신진 대사 중간체를 식별하고 정량화하는 데 사용됩니다 강력한 기술입니다. M.의 준비를 위해이 프로토콜의, 절차 NMR metabolomic 분석을위한 결핵 세포 추출물이 설명되어 있습니다. metabolites의 보존을 최대화하기 위해 차가운 온도를 유지하면서 세포 문화는 적절한 조건 및 필요한 바이오 레벨 3 억제, 1 수확에서 성장하고, 기계 용해를 받게됩니다. 세포 lysates가 회복되며, 소독, 그리고 매우 낮은 온도에서 저장 필터링. 이러한 세포 추출물에서 Aliquots이 가능한 세포의 부재를 확인하기 위해 집락 형성 단위 미들 7H9 한천에 도금되어 있습니다. 37 번 부화 두 달 ° C, 경우에 따라 더 바이올라 없습니다수 식민지가 관찰되며, 샘플은 하류 처리를위한 밀폐 시설에서 제거됩니다. 추출물은 동결 건조 된 진정제를 맞았을 버퍼에 resuspended하고 통계 분석의 대상이되어 spectroscopic 데이터를 캡처, NMR 장비에 주입되어 있습니다. 설명되어있는 절차는 (1D) 한 차원 1 H NMR 및 2 차원 (2D) 1 H-13 C NMR 분석 모두에 적용 할 수 있습니다. 이 방법론은 크로마토 그래피 방법보다 더 신뢰할 수있는 작은 분자량 대사 식별 및 세포 추출물 신진 대사 작품보다 안정적이고 민감한 양적 분석을 제공합니다. 절차의 변화가 세포 용해 단계에 따라 설명이 병렬 proteomic 분석을 위해 적용 할 수 있습니다.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

의 metabolomic 프로필<em&gt; Mycobacterium 결핵</em&gt; 국물 문화의 성장 후 결정됩니다. 조건이 미생물의 대사 프로필에 영양 보조제, oxidants, 그리고 안티 - 결핵 요원의 효과를 테스트하기 위해 다양한 수 있습니다. 추출 준비를위한 절차 1D 모두 적용됩니다<sup&gt; 1</sup&gt; H 및 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR 분석.

의 샘플 준비<em&gt; Mycobacterium 결핵</em핵 자기 공명 Metabolomic의 연구&gt; 압축을 풉니 다

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

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15.2K 조회수.  University of Nebraska-Lincoln. 의 metabolomic 프로필 Mycobacterium 결핵 국물 문화의 성장 후 결정됩니다. 조건이 미생물의 대사 프로필에 영양 보조제, oxidants, 그리고 안티 - 결핵 요원의 효과를 테스트하기 위해 다양한 수 있습니다. 추출 준비를위한 절차 1D 모두 적용됩니다 1 H 및 2D 1 H- 13 C NMR 분석.