Yazarlar protokolü geliştirirken yararlı yorumlar için Dr Barletta ve Dr Güçlerin laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz el yazması yararlı tartışmalar ve redaksiyon için Wendy Austin ederim. Bu yazıda anlatılan çalışma Nebraska-Lincoln Redoks Biyolojisi Merkezi (ebeveyn hibe # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI) University of Yukarıda listelenen her bir araştırmacı için tohum Pilot hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, araştırma malzemeleri ve bu yayına dahil NMR teknikleri standardize Bay Halouska en kısmi maaş desteği için ona R21 hibe (1R21AI087561-01A1) fon sağlamak için Dr Ofelia Chacon ederim.

1. Protokol Metni Bu protokol M. NMR metodolojisinin adaptasyonu vurgulamaktadır Tüberküloz (Sınıf III ajan). M. yaparken nedenle, Biyogüvenlik Seviyesi 3 (BSL3) uygulamaları takip edilmesi gereken bir yıllık sertifikalı laboratuvarda tüberküloz araştırma. Laboratuvar tarafından oluşturulan aerosoller Maruziyet bu mikroorganizmalar ile çalışan personel tarafından karşılaşılan en önemli tehlikedir. Aşağıdaki yordamlar Kurumumuzda yürütülen ve varyasyonları Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi&#39;nin önerilerine dayanarak mevcut olabilir. Ortak personel koruyucu ekipman, bir Tyvek elbise, kabarık kap, patik, N95 solunum, göz koruma, kollu ve nitril eldiven bir çift çifti oluşacaktır. M. içeren çalışın Açık M. tüberküloz kültürü ve / veya manipülasyon tüberküloz konteyner tipi A2 veya B2 biyolojik güvenlik kabininde yapılır. Plastik-kaplı emici kağıt w üzerine yerleştiriliryüzey akıcı iş. Bertaraf veya tesis kaldırılacak tüm malzemeler / gereçler iki biohazard torba yerleştirilir ve otoklavlanarak dekontamine edilmelidir. Çalışma yüzeyleri ve dolap (FastPrep-24 lizis homojenizatör, spektrofotometre, buz kovası, vb) içinde kullanılan ekipmanlar 1% Amphyl (tüberkülsit, bakterisid fungusid ve virüsidal ajanı) ile her çalışma oturumundan sonra dezenfekte edilmelidir. M. tüberküloz kültürleri gibi dondurucu, inkübatör, santrifüj, ve buzdolabı gibi biyolojik güvenlik kabini dışında bulunan büyük ekipman ulaşım için çifte altına alınmalıdır. Santrifüj kapalı güvenlik kapları ve O-ring vida üst tüpleri ile yapılır. BSL3 laboratuar dışında ileri analiz için, hücre içermeyen özler 15 dakika süreyle 95 ° C de öldü 0.2 um bir filtreden veya mikroorganizmalar ısı ile filtre edilir. 2 numuneler önce çevreleme kaldırılması için koloni oluşturan birim yokluğunda doğrulamak için kaplanır. <ol><li> 110 Polisorbat 80 (Tween 80 topaklanma önlemek için) içeren Middlebrook 7H9 ortamı ml tam çorbası (mA DC-TW) ya da bir 250 ml Erlenmeyer şişesi için uygun bir ortam. Aktarma C-metabolitler 13 kullanırken üç kat kültürlerinin rutin durum başına yetiştirilen ve on özdeş kültür 1D 1H NMR profilleme için yetiştirilir. Iki koşula (örneğin, ilaç ilavesi ile ve olmadan) çoğaltmak başına kültürünün çift hacmi büyüdü ve iki özdeş kültürlere ayrılabilir için. Bütün reaktif ve çözelti tarifleri protokolünün sonunda sağlanmaktadır. </li><li> M. 0.150 ml broth inoküle tüberküloz% 50 gliserol stoku (buz çözülmesini sağlar). Aşağıdaki 1. Not bakınız. </li><li> Kültürü 37 büyümesine izin ver ° C&#39;de yaklaşık 6 gün (OD 600 0.6-0.8) 100 rpm&#39;de sallayarak. Aşağıdaki Not 2&#39;ye bakınız. </li><li> Hiçbir antibiyotikler, alternatif eklemeler veya diğer tedaviler gerekiyorsa, kültürler hasat edilmeye hazırdır. Tedaviler kullanıldığında, devamdoğrudan 5. adıma. Kirlenme testleri, fenotipik analizi, PCR testleri: Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. Aşağıdaki Not 3&#39;e bakınız. Bu noktada, 6. Aşamaya geçin. </li><li> Sallantıyı matara çıkarın ve istenen tedavi (örn., ilaç ya da metaboliti ekleyin) gerçekleştirin. Sıra bir ek süre (örneğin, 6-18 saat) için çalkalayıcı ve inkübe geri şişelerde. Bu sürenin sonunda, diğer bir 1.0 ml bir örnek alır ve OD 600 belirler. Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. </li><li> 5 dakika buz üzerine yerleştirin kültürler. Bu adımdan sonra, geriye kalan bütün protokol boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın. Hasat 2,000 x g&#39;de ve 4 de santrifüj ile kültür ° C&#39;de bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 50 ml tüp içinde 15 dakika için. Her bir kültür 25 ml her biri (1 toplam dört tüp gerektirir00 ml 2B 1 için yeterli bir sinyal-gürültü elde etmek için gerekli olan H-13 C kültür başına 50 ml 1D 1 H NMR deneyleri için gerekli NMR deneyleri). </li><li> Yukarıda anlatılan parametrelere göre santrifüj buz-soğuk GKD 2 O (yaklaşık olarak 15 mi, ilk kez ve 10 ml ikinci kez) ile her bir hücre peleti iki kez yıkayın. İkinci yıkama için iplik önce aynı tüp içine 10 ml alikotları birleştirir. 1.0 ml GKD 2 O (hücre peleti hacim için ayarlamak için gereken) bir nihai hacim içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Yığınlaşma serbest tek bir hücre süspansiyonu bu aşamada arzu ediliyorsa, kısa bir süre için sonike edilmiş hücreler ve / veya bir 27 gauge iğneden üç kez geçirildi edilebilir. Alternatif olarak, hücre peleti -80 ° C de donduruldu ve daha ileri işleme kadar saklanabilir. İkinci durumda ise, dondurulmuş pelet yeniden süspanse edilmesi için önce buz üzerinde çözülmüş edilir. Yukarıda belirtildiği gibi 1.0 ml GKD 2 O değerindeki bir son hacim içinde, hücre topakları yeniden süspanse edin. </li><li> TransfeParçalama Matris B (0.1 mm silis küreler) ihtiva eden 2.0 ml bir vidalı kapak tüp için r, 1.0 ml hücre süspansiyonu. Biyogüvenlik kabini içindeki FastPrep-24 lizis homojenizatör yerleştirin. Tutma tüpün üstünde plaka konuştu güvence, numune tutucu içine örnekleri koyun. 6 metre / saniye hız ayarında homojenleştiricide 60 sn örnekleri işleyin. </li><li> 15.000 x g&#39;de ve 4, bir mikrosantrifüj içinde örnekleri döndürme ° C&#39;de pellet hücre artıkları ve sağlam hücreler 10 dakika için. </li><li> Steril bir tüp içine bir şırınga filtresi (0.2 mikron) ile süpernatant ve geçiş örnek çıkarın. MA DC agar üzerinde numune Plate 0.1 ml (% 10 veya örnek olarak örnek bir temsilcisi fraksiyonu) hiçbir canlı hücre olduğunu doğrulamak için. Araştırmacılar ayrıca, birden fazla filtrasyon adım yapmak ve / veya herhangi bir potansiyel biyogüvenlik endişeleri önlemek veya belirlemek amacıyla canlı-ölü boyama prosedürleri kullanarak özler canlı hücrelerin varlığını doğrulayabilir. Depolamak için bir madde, etanol-kuru buz banyosu içinde örnekleri Dondurarak-80 ° C de bir NMR tesiste liyofilize ve işlenebilir hazır oluncaya kadar. </li><li> 2 ay sonra, koloni oluşturan birimlerin yokluğu doğrulamak için plakaları kontrol edin. Hiçbir CFU en bulunursa, örnekleri BSL3 laboratuar dışına alınabilir. Diğer analizler normal olarak çoklu kullanıcı sunmaktadır ve herhangi bir özel önleme şartları altında çalışan bir standart NMR odası içinde gerçekleştirilir. </li><li> Kuruyana kadar Lyophilize numuneleri, daha sonra NMR tampon ve bir mikrosantrifüj tüpüne transfer 0.7 ml içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 13,000 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. 0.6 ml ve 5 mm NMR tüpü transfer çıkarın. Alternatif olarak, liyofilize örnekleri olmayan biyozararli düzenli örnekleri gibi harici tesisine gönderilecek olabilir. </li><li> NMR verileri hemen toplanır. Tüm önlemlere rağmen, aktif enzimler hala mevcut olabilir ve örnek uzun süre için genellikle istikrarlı değildir. Örnekler m ° C ila oda sıcaklığında ve 4 &#39;te dışında kaldığında NMR spektrum değişiklikler belirgin hale gelmektedirler1 hafta daha cevher. Ayrıca, NMR veri toplama örnekler rastgele her kategoride seçilen tedavi ve ilaç tedavi kültürler arasındaki izliyor. NMR spektrumları toplanmıştır önce belirli bir kategoriye daha uzun bir gecikme vardı çünkü bu gereksiz önyargı önler. Tüm işlem görmemiş örnekler için NMR spektrumu, ilaç tedavisi örnekleri birinci toplanmış ve daha sonra takip edildi eğer veri bir sapma meydana gelmektedir. Örnekler hemen NMR ile analiz edilmesi mümkün değilse, numuneler -80 ° C&#39;de 1 ml Eppendorf tüpleri saklanmalıdır </li><li> Örneğin, kilit, şim, ayar ve 90 ° darbe uzunluğu optimizasyonu gibi birkaç rutin adımları içeren bir BACS-120 numune değiştirici, cihaz kalibrasyonu, içine numune yerleştirdikten sonra sonuçların kalitesini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Tek bir numune 90 ° nabız süresini ayarlamak ve kalan numuneler için araç ayarlamak için kullanılır. Kilitleme shimming ve her örnek için NMR veri toplama otomatik istimal olduğunug ICONNMR ve gradshim. </li><li> A 1D 1H NMR spektrumu uyarma heykel kullanarak su bastırmalı Bruker zgesgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 32k veri 5482.5Hz bir süpürme genişliği ile puan, 128 taramalar ve 16 kukla taramaları toplam kullanılmaktadır. A 2D 1 H-13 C HSQC spektrum Bruker hsqcetgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 5000.0 Hz süpürme genişliği ile 2048 veri noktalarının toplam doğrudan 1 H boyut boyunca toplanan ve dolaylı 13 C boyut boyunca 18864,9 Hz süpürme genişliği ile 64 veri noktaları edilir. Spektrum gürültü sinyali iyi almak için 128 taramalar ve 16 kukla taramaları ile tahsil edilir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel prosedür bir akış şeması tasvir edilmiştir. NMR tamponu 50 mM potasyum fosfat, soluk sarı stok solüsyonu50 uM TMSP ile er: <ul><li> 2.17 g K 2 HPO 4 (potasyum fosfat dibazik) </li><li> 1.70 g KH 2 PO 4 (potasyum fosfat tekbazlı) </li><li> 7.86 mg Sodyum-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D,% 98)) </li><li> &quot;100%&quot; D 2 O 500 ml suda eritilir </li><li> Nihai çözüm pH 7.2 (düzeltilmemiş) olmalıdır </li></ul> MA DC-TW veya MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4.7 g Middlebrook 7H9 broth base </li><li> 900 ml GKD 2 O </li><li> 2 ml gliserol </li><li> 25 dakika boyunca kısımlar ve otoklav karıştırın. : Aşağıdaki çözümler dokunun ve eklemek için serin sıvı </li><li> 100 ml ADC MOADC hazırlanmasında mA DC veya 100 ml OADC hazırlanmasında </li><li> 2.5 ml% 20 Tween 80 (alternatif olarak, non-metabolik% 20 Tyloxapol 1 ml) </li><li> 10 ml% 1 sikloheksimid </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20 g D (+)-glikoz </li><li> 50 g BSA FraksiyonuV </li><li> 8.5 g NaCl </li><li> 800 ml GKD 2 O </li><li> Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C&#39;de depolayın </li></ul> Alternatif olarak, OADC (1L) hazırlamak için% 1 oranında oleik asit (aşağıda tarif 250 mL&#39;lik bir toplu hale getirir) artı 50 ml yukarıda listelenen tüm bileşenlerini ekleyin. Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. Şişe 4 ° C&#39;de alüminyum folyo ve mağaza sarılmış gerekmektedir <ul><li> 2.5 g Oleik Asit </li><li> 250 ml 0.2 M NaOH </li><li> 55 ısı ile Çözünme oleik asit (soğutma üzerine katılaşan) ° 10 dakika ve 60 dakika için karıştırma ile NaOH çözeltisi ve ısı ile eklemek için C&#39;dir. Alüminyum folyo ile sarılmış steril cam şişelerde saklayın. 4 at parafilm ve mağaza ile Seal şişeleri ° C. </li></ul> Tercih ederseniz, katalaz Zenginleştirme ile ticari BD BBL Middlebrook ADC veya OADC satın alabilirsiniz. % 1 Sikloheksimit (100ml) </strong&gt; <ul><li> 1 g sikloheksimid </li><li> 100 ml GKD 2 O </li></ul> Çözülür ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C&#39;de depolayın Dikkat: sikloheksimid son derece dikkatle ele kadar zehirli olduğunu. % 20 (v / v) Tween 80 (100ml) <ul><li> 20 ml Tween 80 </li><li> 80 ml ​​GKD 2 O </li></ul> % 20 w / v çözelti hazırlamak için, alternatif olarak, Tween 80 ve 20 g (yoğunluk 1.06 g / mL, yaklaşık 18.9 ml) tartın. 55 Isı çözümü ° C 30 dk erimesi ve tamamen karıştırmak için. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın. % 20 (v / v) Tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ml Tyloxapol </li><li> 80 ml ​​GKD 2 O </li></ul> % 20 w / v çözelti hazırlamak için; Alternatif olarak, Tyloxapol 20 g (yoğunluğu 1,1 g / mL, yaklaşık 18.2 ml) tartın. Di için 30 dakika için 55 ° C ısıya çözeltissolve ve tamamen karıştırın. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın. Not 1: M. Gliserol stokları tüberküloz aşağıdaki protokol kullanılarak hazırlanmıştır. M. Stoklama tüberküloz <ul><li> M. büyütün doygunluk 50 ml mA DC tüberküloz (OD 600 = 1.5 ila 2.0) 37 ° C sallayarak koşulları (100 rpm) altında. Suşu bağlı olarak, bu 7-14 gün sürer. </li><li> Pelet kültür için 15 dakika için 4 ° C&#39;de 2.000 x g&#39;da örnekleri Spin. Süpernatantı. </li><li> Steril% 50 gliserol 6 ml süspanse edin. </li><li> 4 Corning kriyojenik şişeleri ve etiket uygun içine tablet 1,5 ml. </li><li> -80 Etanol / kuru buz banyosu ve mağaza hemen flaş dondurma şişeleri ° C. </li></ul> Not 2: aşılamak suşu H37Rv (-80 ° 1,5 yaşında C stok) mA DC medya 70 mL &lt;bir OD 600 verir/ Bir Innova 40 Shaker sallayarak koşullar (100 rpm) altında 37 ° C&#39;de büyüme 5 gün sonra yaklaşık 0,6 alt&gt;. Not 3: kültür kontaminasyon test etmek için, araştırmacılar standart zengin ortam üzerine bir kültür kısım aşılamak ve gecelik inkübasyon sonrası büyüme yokluğu doğrulamak olabilir. Rutin, kültürleri koloni morfolojisi gözlemlemek ve faz-kontrast mikroskop ile incelenmesi mA DC agarda kaplanır. Açıklandığı gibi İsterseniz, kültürler PCR kullanılarak doğrulanabilir 6110 primerler IS. 3 2. Temsilcisi Sonuçlar Da hazırlanmış olan bir örnek, Şekil 2&#39;de tasvir edilen bir benzer bir NMR tayfı elde edilir. Bu spektrum, M. bir temsilidir; tüberküloz vahşi tip metabolik havuzu. Metabolitleri, doğrudan ya da dolaylı olarak, D-alanin yolu ile ilişkilidir. Ayrıca, zirve yoğunlukları büyüklüğü metabolit konsantrasyonları ile orantılıdır sunmakhücre özü. Bu nedenle tedavi kültürleri, ilaç tedavisi ve mutant suşlar arasındaki pik şiddetleri değişiklikleri metabolitleri ve metabolik yollar tedirginlikler gösterebilir. M. tüberküloz 1D 1 H NMR spektrası, bir üçlü-rezonans, Z-eksenine gradyanı kriyoprob ile donatılmış bir Bruker Avance 500 MHz spektrometre üzerinde elde edilmiştir. Spektrumu ca içerir. Bu amino asitler, nükleotid öncülleri ve glikolitik ve sitrik asit ara dahil olmak üzere 40-50 metabolitleri tanımlamak ve ölçmek mümkün olduğu 400 zirveleri. İkon Bruker yazılımı ile birlikte bir BACS-120, numune değiştirici NMR verileri toplama otomatikleştirmek için kullanılmıştır. 1D 1 H NMR spektrumları verimli (sonraki temel bileşenler analizi (PCA) veya dikey kısmi en küçük kareler diskriminant analizi eserler indükleyebilir temel koleksiyon için herhangi bir ihtiyacı ortadan kaldırarak, düz taban çözücü kaldırmak ve korumak için uyarma heykel 4 kullanılarak toplanmıştır OPLS- DA). A 1D 1 H-NMR spektrumu 5482,5 Hz ve 32K veri noktaları bir spektrum genişliği 25 ° C &#39;de toplanmıştır. 16 kukla taramaları ve 128 taramalar toplam spektrum elde etmek için kullanılmıştır. ACD Labs 1D NMR işlemci yazılım yarı-otomatik olarak her 1D 1 H NMR spektrumu işlemek için kullanıldı. Spektrumu Fourier, dönüştürülmüş aşamalı ve TMSP tepe (0.0 ppm) başvurulan idi. NMRpipe yazılım paketi, tek tek 2B 1 H-13C NMR spektrumları işlemek için kullanılan ve NMRDraw ile analiz edilmiştir. Bruker FID veri dosyasının ilk NMRpipe tarafından tanınabilir bir dosya biçimine dönüştürülür ve ardından spektrumu Fourier dönüştürüldü, faz düzeltilmiş ve sıfır doldurdu. 1D 1H NMR spektrumu ve 2D 1 H-13C NMR spektrumunda gözlenen NMR zirvelerinin 1 H ve sırasıyla 0.05 ve 0.50 ppm, 13 C kimyasal kayma toleranslar ve Madison Metabolomik Konsorsiyumu Veritabanı (MMCD kullanarak belirli metabolitlerin atanan ) <sup&gt; 5 BioMagResBank, 6 ve İnsan Metabolome Veritabanı. Özellikle 7, 1D ve 2D NMR spektrumları NMR kimyasal vardiya pik liste daha sonra İnsan Metabolome Veritabanı yüklenen nerede, elle pik toplanmış bulunmaktadır. İnsan Metabolome Veritabanı tarafından tanımlanan metabolitleri NMR rezonansı eşleşen ve metabolik ağa mensup sayısını maksimize hem esas NMR spektrumu atanır. Her bileşik veya metabolit genellikle birden CH çiftleri ve buna birden NMR rezonansı vardır. Bu nedenle deneysel NMR spektrum gözlenmiştir, bu NMR rezonansı ve daha çok, daha çok metaboliti bulunmaktadır. Benzer şekilde, aynı yol ile ilişkilendirmek birden metabolitleri tanımlamak doğru atamaları olasılığını artırır. Metabolitleri ve metabolik yolların varlığı Genlere ve genoma (KEGG) 8 Kyoto Ansiklopedisi ve MetaCyc veritabanları ile doğrulanır. 9 Mycobacterium smegmAtis M. için kullanışlı bir model sistemi tüberküloz ve diğer mikobakteriyel patojenler. M. başka yerde tanımlandığı gibi, örnek smegmatis&#39;in da sonication tarafından bozulmuş olabilir. 10. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> Şekil 2. Mycobacterium tuberculosis hücre ekstresi 1D 1H NMR spektrumu. Metabolitlerinin temsili ile ilişkili NMR zirvelerinin etiketlenir. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: AMP, adenozin mono fosfat, α-Kg, α-ketoglutarat, Glu, L-glutamat ve Ala, alanin.

<ol>
	<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).</li><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).</li><li>Clarridge, J. E., Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory.">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li><li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOGGY:+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques.">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li><li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database.">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li><li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioMagResBank.">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li><li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB:+the+Human+Metabolome+Database.">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li><li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment.">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li><li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway/genome+databases+to+160+genomes.">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li><li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria:+role+of+D-alanine+racemase.">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li><li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism:+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action.">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li><li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li><li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages:+Insights+into+the+Phagosomal+Environment.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li><li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions:+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another.">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li><li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions:+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids.">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li><li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice.">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li><li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity.">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li><li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+by+numbers:+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data.">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li><li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis.">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li><li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis.">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates.">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çalışmaların önemli bir kısmı M. Transkriptomik ve proteomik profilleri analiz var in vitro ve in vivo koşullarında çeşitli altında tüberküloz. 11-16 Sonuçta, gen ekspresyonu ve enzim aktivitesinde değişiklikler küçük molekül ağırlıklı moleküllerin konsantrasyonları değişikliklere yol açmaktadır. Bu bileşiklerin tam açıklaması metabolome oluşturmaktadır. Böylece, metabolik yolaklar uyuşturucu ve değişen büyüme koşullarına etkiler...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> ADC Zenginleştirme </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Numune Değiştirici </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NMR Bruker Avance </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Bovine Albumin Serum </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fraksiyon V </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Santrifüj Tüpleri </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml steril polipropilen </td></tr><tr><td> Kriyojenik Flakon </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2.0 ml steril polipropilen </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG Bilimsel </td><td> C-1189 </td><td> Zehirli </td></tr><tr><td> D (+) - Glikoz </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Ağır su </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Steril, düz taban, polikarbonat, 0.22 mikron PTFE membran havalandırmalı kapak </td></tr><tr><td> Flaş Freeze Flask </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Kurutucu dondur </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 L Benchtop </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Kuluçka makinesi </td><td> New Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Tezgahüstü çalkalayıcı </td></tr><tr><td> Parçalama Matris B </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Lizis Makinesi </td><td> MP Biomedicals </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Mikrofuge&#39;de 22R </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR tüpler </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> OADC Zenginleştirme </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Oleik Asit </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat dibazik </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Fosfat mono </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - mikrofuge&#39;de 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Mühürlü ve polipropilen </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Biyo-sertifikalı kapaklar ile </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge İzotop </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre Küvetleri </td><td> Hayat çizgisi </td><td> LS-2410 </td><td> 1.5 ml polistiren, 2 açık taraf </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Steril, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Şırınga Filtre </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0.2 um steril selüloz asetat </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium tuberculosis küresel ölçekte insan mortalitenin önemli bir nedenidir. Hem çok (MDR) ve yaygın-(XDR) ilaca dirençli suşların ortaya çıkması mevcut hastalık kontrol çabalarını rayından tehdit ediyor. Böylece, şu anda mevcut olanlardan daha etkili ilaçlar ve aşılar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. M. genom tüberküloz fazla 10 yıldır bilinen, fakat gen fonksiyonu ve zorunluluk bilgimizi önemli boşluklar bulunmaktadır olmuştur. Birçok çalışma bu yana gen ifadesinin küresel desenleri ile ilgili ilaçlar, oksidanlar ve büyüme koşullarının etkisini belirlemek amacıyla Transkriptomik ve proteomik düzeyde hem de gen ekspresyon analizi kullandık. Sonuçta, bu değişikliklerin nihai yanıtını birkaç bin küçük moleküler ağırlıklı kimyasal maddeler de dahil olmak üzere bakterinin metabolik kompozisyonu yansıtılır. Tedavi edilmeyen veya tr ya da yabani tip ve mutant suşlarının metabolik profilleri KarşılaştırılmasıBelirli bir ilaç ile eated, etkili bir hedef tespit edilmesini sağlar ve antitüberküloz aktivitesi olan yeni inhibitörlerinin gelişimine neden olabilir. Aynı şekilde, metabolome üzerinde iki ya da daha fazla koşulların etkileri de tespit edilebilir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) metabolik ara tanımlamak ve ölçmek için kullanılan güçlü bir teknolojidir. M. hazırlanması için bu protokol, prosedürler NMR metabolomik analiz için tüberküloz hücre ekstreleri tarif edilmektedir. Metabolitlerin korunması maksimize etmek için soğuk sıcaklıkları korurken hücre kültürleri uygun koşullar ve gerekli Biyogüvenlik Seviyesi 3 çevreleme, 1 hasat altında yetiştirilen ve mekanik lizis tabi tutulur. Hücre lizatları kurtarıldı, steril ve ultra-düşük ısılarda saklanan filtrelendi. Bu hücre özleri alikotlar canlı hücrelerinin yokluğu doğrulamak için koloni oluşturan birim için Middlebrook 7H9 agarda kaplanır. 37 inkübasyon iki ay ° C, eğer üzerine hiçbir vimümkün koloniler gözlenir, numune üretim prosesleri için tecrit tesisine kaldırılır. Özler, liyofilize edildi döteryumlanmış tampon içinde tekrar süspanse edilir ve daha sonra istatistiksel analize tabi tutulur spektroskopik verileri yakalamak, NMR aleti olarak enjekte edilir. Anlatılan prosedürler (1D) tek boyutlu 1 H NMR ve iki-boyutlu (2B) 1 H-13 C NMR analizi her ikisi için de uygulanabilir. Bu metodoloji kromatografik yöntemlere göre daha güvenilir küçük molekül ağırlığı metabolit tespiti ve hücre ekstresi metabolik kompozisyonlar daha güvenilir ve duyarlı kantitatif analizler sağlar. Işlem varyasyonları hücre parçalama aşamasını takiben de tarif paralel Proteomik analizleri için adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies at JoVE.com

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Ve metabolomik profili<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Broth kültürleri büyüme sonrasında belirlenir. Koşullar bu mikroorganizmanın metabolik profil üzerinde besin takviyeleri, oksidanlar ve anti-tüberküloz ilaçların etkilerini test etmek için değişik olabilir. Özütü hazırlanması için prosedür 1D her ikisi için de geçerlidir<sup&gt; 1</sup&gt; H ve 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR analizleri.

Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

sample-preparation-mycobacterium-tuberculosis-extracts-for-nuclear

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Immunology and Infection

Unit 1

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Principles of Nuclear Magnetic Resonance

SCIENTISTS IN ACTION

15.3K Görüntüleme.  University of Nebraska-Lincoln. Ve metabolomik profili Mycobacterium tuberculosis Broth kültürleri büyüme sonrasında belirlenir. Koşullar bu mikroorganizmanın metabolik profil üzerinde besin takviyeleri, oksidanlar ve anti-tüberküloz ilaçların etkilerini test etmek için değişik olabilir. Özütü hazırlanması için prosedür 1D her ikisi için de geçerlidir 1 H ve 2D 1 H- 13 C NMR analizleri.

Video: Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Enfeksiyon

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...