Biz kimin üstün teknik destek, entelektüel girdi ve manevi destek öncesinde bu çalışmalarda hareket etkili olmuştur Alice Gaughan ve Jiao-Jing Wang borçluyuz. Bu çalışmalar GAH için NIH hibe AI036532 tarafından desteklenmiştir.

1. Öldürücü Işınlama <ol><li> Kullanılacak ışınlayıcılar ile uyumlu bir microisolator kafes içine 10 alıcı fareler kadar yerleştirin. </li><li> Toplam doz (BALB.B alıcılar için toplam doz = 9 cGy) toplanmasıyla 2 eşit dozda ışın tedavisi. İkinci ışınlama birinci sonra 3 saat olmalıdır. Enjeksiyon nihai ışınlama sonrası 4-6 saat arasında meydana gelmelidir. Cs 137 kaynak veya RS2, 000, ışınlayıcı birinde saçmak fareler. </li><li> Nakli saatine kadar asitlendirilmiş su ile microisolator kafesteki ikinci radyasyon dozu, mağaza fareler ardından. </li></ol> 2. Splenocyte Preparasyon <ol><li> Kurumsal kurallarına göre bir donör fare Euthanize. 125x10 6 splenositlerin - Her donör genellikle 75x10 6 verir. 12x10 6 CD8 T hücreleri - CD8 arıtma kitleri kullanılarak her bir fare genellikle 6x10 6 verir. </li><li> Ilk doğrudan doğruya orta hat dikey bir 2 cm&#39;lik kesi 2 cm yaparak dalak çıkarıngöğüs kafesi altında. Kürk, deri ve viseral zarından kesin. </li><li> Dalak çıkarın ve% 5 FBS 1640 RPMI ile bir Petri kabındaki 40 ul örgü ekran dalak koyarak tek hücre süspansiyonu oluşturmak. Tüm dalak örgü ekran geçirilir kadar dalak parçalayın için bir şırınga pistonu kullanın. </li><li> Her WT ve L2G85.B6 donör için bu işlemi tekrarlayın. 1-50 ml konik bir tüp içinde tüm WT tek hücre süspansiyonları toplayın ve ayrı bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde tüm L2G85.B6 tek hücre süspansiyonları toplamak. </li><li> 4. 10 dakika için 1200 rpm&#39;de santrifüje hücreleri ° C % 5 FBS ve sayım hücreleri 1640 RPMI süspanse pelet. </li></ol> 3. Kemik İliği Hazırlık <ol><li> Bir donör fare tek bir arka bacak arasından cilt çıkarın. </li><li> Dikkatlice femur ve tibia / fibula mümkün olduğunca çok kas dokusu gibi kesip. </li><li> Kalça eklemi uzakta femur keserek arka bacak kaldırın. Sadece tibia / fibula kesiştiği aşağıda arka pençe kesip. Tüm kemik keser sağlam makas kullanılarak yapılmalıdır. </li><li> Dikkatlice kalan kas dokusu çıkarın. Fibula-nispeten daha az kemik iliği fibula bulunan ve çabaya değmez kesiniz. </li><li> İkinci arka bacak ile soğuk 1.640 RPMI% 5 FBS ve tekrarlama sürecinde arka ekstremite yerleştirin. 40x10 6 kemik iliği hücreleri - Her fare 20x10 6 arasında boyun eğmek zorundadır. </li></ol> 4. Kemik İliği Kaldırma <ol><li> Soğuk ortamı (~ 1 ml), az miktarda büyük olan Petri kabındaki ortam ve bir yerden bir arka uzuv çıkarın. </li><li> Diz eklemi kesip. Tibia içine bir şırınga (hacim&gt; 5 ml), insert subkutan iğne kullanma ve tüm kırmızı malzeme tibianın iç kaldırılana kadar şırınga basın. Femur işlemi tekrarlayın. Kemik iliği yoksun kalan kemikleri atın. İkinci arka bacak ile tekrarlayın. </li><li> Büyük Petri kabı ve kullanım şırınga pistonu ve ul 40 içine kemik iliği içeren pipetleme medya tarafından tek bir hücre süspansiyonu oluşturunekran kafes. Pipet tek hücre 50 ml konik tüp içine süspansiyon ve buz üzerinde tutmak. </li></ol> 5. CD3 tükenmesi Kemik iliğinden CD3 + hücreler tüketmek için çeşitli yollar vardır. Bizim laboratuar Miltenyi Biotec (- 130-093-021 CD3-biotin) tarafından yapılan bir kit kullanır. Üreticinin protokolü takip kemik iliğinden CD3 + hücreler İncelten. Miltenyi kitleri için tampon bundan MACS Tampon (2 mM EDTA, PBS, pH 7.2 &#39;de% 0.5 BSA) olarak adlandırılır. <ol><li> 4. 10 dakika ° C ve sayım hücreleri için 1200 rpm&#39;de dalak ve kemik iliği hücreleri santrifüj hücreleri yıkayın. </li><li> TÜM Süpernatantı. Süspanse kemik iliği MACS tamponu içerisinde 10 milyon kemik iliği hücreleri başına 100 ul hücre. </li><li> Kullanarak CD3 tükenmesi ile devam &#39;protokolü üretmektedir. </li><li> Steril PBS CD3 tüketilmiş kemik iliği hücreleri 3 kere yıkayın. Kont CD3 kemik iliği hücreleri tükenmiş ve 10 7 hücre enjekte etmek uygun bir ses seviyesinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> L2G85.B6 farelerde CD8 T hücreleri arındırmak için çeşitli yollar vardır. Ayrıca, WT splenocyte vericilerden CD8 T hücreleri tüketmek için çeşitli yolları vardır. Bizim laboratuar Miltenyi Biotec (- 130-049-401, CD8 arıtma - 130-095-236 CD8 tükenmesi) dan kitleri kullanır. <ol><li> 10 7 hücre başına 90 ul MACS Tamponunda WT pelletini tekrar. &#39;Protokolü (- 130-049-401 CD8 tükenmesi) üretmektedir göre CD8 T hücre tükenmesi ile devam edin. </li><li> 10 7 hücre başına 40 ul MACS Tamponunda L2G85.B6 pelletini tekrar. &#39;Protokolü (- 130-095-236 CD8 saflaştırma) üretmektedir göre CD8 T hücre saflaştırma ile devam edin. </li><li> Her hücre popülasyonu sayın ve steril PBS ile her nüfusu 3 kere yıkayın. 18x10 6 WT (CD8 tüketilmiş) dalak ve 2x10 6 CD8 T hücreleri arıtılmış L2G85.B6 enjekte etmek uygun miktarda her nüfus süspanse edin. </li></ol>7. Enjeksiyon Hazırlık <ol><li> Bir mikrosantrifüj tüp CD8 T hücreleri arıtılmış 10 7 CD3 tükenmiş kemik iliği hücreleri, 18x10 6 WT (CD8 tüketilmiş) dalak ve 2x10 6 L2G85.B6 birleştirin. 300 ul steril PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayınız. </li><li> Alıcı farelerin kuyruk ven içine hücre hazırlama enjekte. Enjeksiyonlar 28 gauge iğne kullanılarak yapılmalıdır. </li><li> Asitlendirilmiş su ile microisolator kafeste Mağaza fareler. Puan farelerin günlük Cooke ve arkadaşları 1 tarafından geliştirilen skorlama GVHH skorlama sistemi kullanılarak. </li></ol> 8. Bioluminescent Görüntüleme <ol><li> Altı gün transplantasyon sonrası, 4 mg D-luciferase ile alıcı farelere enjekte. Luciferase için 5 dk lusiferaz ile reaksiyona izin verin. </li><li> Küçük binning ile 5 dakika biyolüminesans kamera ve görüntü alıcıların izofluran odasında fare uyuştur. Mümkün olduğunca çok sayıda olaylar olarak toplarken, bu yüksek çözünürlüklü bir görüntü oluşturacaktır. </li><li> Oturma kullanarak verileri analizImage yazılımı. Pseudo-color görüntü ölçeği en iyi sonuçları elde etmek için değiştirilebilir. Bununla birlikte, aynı ölçekli deneyler ile aynı olmaları şarttır. </li><li> Ilgi Bölgeler ilgi her bölgeden yayılan varlık akı (foton / sn) hesaplanarak belirlenebilir Yaşayan Image yazılımı ve ışık emittans kullanılarak oluşturulabilir. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar Yaklaşık 7-10 gün transplantasyon sonrası, fareler GVHH klinik belirtileri gösteren başlar. Fare tımar eksikliği scruffy nedeniyle görünür. Alıcılar da 7-10 gün transplantasyon sonrası arasındaki kilo kaybetmeye başlayacaktır. Alıcı fareler Faaliyet ve duruş yaklaşık günde 12-14 transplantasyon sonrası kadar nispeten normal kalır. Kümülatif GVHH puanları sürekli ilk 2-3 hafta sonrası transplantasyon (Şekil 1A) aracılığıyla artacaktır. Hastalık ders fareler arasında oldukça değişken olmakla birlikte, alıcıların eşit 30-40 d GVHD yenik gerekirays transplantasyon sonrası (Şekil 1B). Şekil 2. 6 gün transplantasyon sonrası görüntülendi alıcı fareler gösterir. Pseudo-renkli ölçek dalak ve bağırsak yayılan varlık yüksek ışık yoğunluğu ile vücut boyunca ışık emittans değişen gösterir. Gut ve CD8 T hücre birikimi önceki bulguları 6 ile tutarlıdır. Alıcı fareler daha sonraki bir zaman noktasında görüntülü ya da ex vivo görüntüleme için ötenazi ile microisolator kafesine geri yerleştirilebilir. <table border="1"><tbody><tr><td> Kriterleri </td><td> Sınıf 0 </td><td> Grade 1 </td><td> Grade 2 </td></tr><tr><td> Kilo kaybı (wkly.) </td><td> &lt;% 10 </td><td> &gt;% 10 - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> Duruş </td><td> Normal </td><td> Kalanı sadece hunching </td><td> Çeşitli hunching; bozar MOVEMEnt </td></tr><tr><td> Etkinlik </td><td> Normal </td><td> Aktivitesinde azalma Hafif ve orta şiddette </td><td> Uyarılmış sürece Kırtasiye </td></tr><tr><td> Kürk doku </td><td> Normal </td><td> Dağıtmıştı Hafif ve orta şiddette </td><td> Şiddetli dağıtmıştı / yoksul tımar </td></tr><tr><td> Cilt dokusu </td><td> Normal </td><td> Pençeleri / kuyruk Ölçekleme </td><td> Soyulmuş deri belirgin alanlar </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Cooke ve ark 1996 1 Bu skorlama sistemi geliştirilmiştir. Fare sol kriterleri her günlük atılır gerekmektedir. Her fare her bir kriter için 0-2 arasında bir puan verilir ve toplam puan tüm bireysel puanları toplamı olur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> Şekil 1. Lethally ışınlanmış BALB.B 10 7 kemik ile transplante edildiKemik iliği hücreleri tek başına veya L2G85.B6 CD8 T hücreleri arıtılmış 18x10 6 CD8 T hücre tükenmiş WT dalak ve 2x10 6 ile. A) kemik iliği alıcılarının klinik skoru veriler tek başına veya CD8 T hücre ile WT splenositlerin tükenmiş ve L2G85.B6 CD8 T hücreleri saflaştırılmış. B) kemik iliği alıcıları tek başına ya da Survival veri CD8 T hücre WT splenositlerin tükenmiş ve L2G85.B6 CD8 T hücreleri saflaştırılmış. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> Şekil 2. Lethally ışınlanmış BALB.B fareler 10 7 kemik iliği hücreleri tek başına veya L2G85.B6 CD8 T hücreleri arıtılmış 18x10 6 CD8 T hücre tükenmiş WT dalak ve 2x10 6 ile birlikte transplante edildi. Alıcılar, intraperitoneal enjeksiyon ile 4 mg D-lusiferin ile enjekte edildi ve küçük binning 5 dakika için Xenogen IVIS kullanılarak görüntülendi. Psmor düşük yoğunluklu temsil eder ve kırmızı ilgi yüksek yoğunluklu bölgeler tüm fare ve toplam akı (foton / sn) etrafında çizildi ölçüldü temsil eder eudo renkli görüntüler gösterilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> Şekil 3. Lethally ışınlanmış BALB.B fareler 10 7 kemik iliği hücreleri tek başına veya L2G85.B6 CD8 T hücreleri arıtılmış 18x10 6 CD8 T hücre tükenmiş WT dalak ve 2x10 6 ile birlikte transplante edildi. Alıcılar, intraperitoneal enjeksiyon ile 4 mg D-lusiferin ile enjekte edildi ve küçük binning 5 dakika için Xenogen IVIS kullanılarak görüntülendi. Mor düşük yoğunluklu temsil eder ve kırmızı yüksek yoğunluk temsil ettiği sözde renkli görüntüler gösterilir. Alıcılar A) günde 4, B) Günlük 6, ve C) 8 gün sonrası transfer görüntülendi.

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan farelerde GVHD uyarılacak protokolü murin GVHH klinik açıdan uygun bir modeli temsil eder. Başlangıçta Berger ve arkadaşları tarafından kurulmuştur. 1994 yılında, BALB.B gerginlik kombinasyon içine C57BL / 6 bağımlı CD4, en sık görülen klinik senaryo 3 çok benzer CD8 T etkileyiciler 2, aracılık GVHH mortalite ile, MHC-eşleştirilmiş olduğunu. Tek başına CD8 T hücre nakli bu modelde GVHD neden olmadığı bilinmektedir, ancak hastalığı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 uM Hücre Süzgeç </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-Biotin </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Biotin microbeads </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a microbeads </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-049-401 </td><td> Dalak CD8 T hücreleri tüketmek için kullanılır. </td></tr><tr><td> CD8a Arıtma Antikor Kokteyl </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-095-236 </td><td> Arındırmak için kullanılırDalak CD8 T hücreleri. </td></tr><tr><td> D-lusiferin </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

Graft-versus-host hastalığı (GVHH) hematolojik eksiklikleri çeşitli için küratif bir tedavi olarak kemik iliği nakli geniş kullanımı sınırlayıcı engeldir. GVHH alıcı infüze edilir kemik iliği greft mevcut olgun alloreactive T hücrelerinin neden olduğu ve ana organlara zarar edilmektedir. Bununla birlikte, farelerde, T hücreleri GVHD neden olduğu kemik iliği inokulum eklenmesi gerekir. Kapsamlı çalışmalar T hücre yanıtlarını transplantasyon sonrası karakterize yapılmış olmasına rağmen, bioluminescent görüntüleme teknolojisi in vivo T hücre trafiğini modellerini izlemek için bir non-invaziv bir yöntemdir. Ölümcül radyasyon ardından, alıcı fareler donör farelerden alınan kemik iliği hücreleri ve dalak ile nakledilmektedir. L2G85.B6 (yapısal olarak ifade eden transgenik farelerde lusiferaz) alınan T-hücre alt nakli dahil edilmiştir. Sadece belirli T hücre alt nakli olarak, bir in vivo özgül T hücre alt izleyebilirve yere göre, değişik zaman noktalarında GVHD teşvik spesifik T hücre alt gruplarının rolü ile ilgili hipotezler geliştirmek. Önceden belirlenen aralıklarla transplantasyon sonrası anda, alıcı fareler bir Xenogen IVIS CCD kamera kullanarak görüntülü. Işık yoğunluğu foton yoğunluğu (kırmızı = yüksek yoğunluklu, mor = düşük yoğunluklu) dayalı bir pseudo-color görüntü oluşturmak için Yaşayan Image yazılımı kullanılarak belirlenebilir. 4-7 gün transplantasyon sonrası arasında, alıcı fareler GVHH klinik belirtileri göstermeye başlayabilir. Cooke ve ark. 1 alıcı fareler kürk, doku, deri bütünlüğü, aktivite, kilo kaybı ve duruş esas hastalığın ilerlemesini ölçmek için bir puanlama sistemi geliştirmiştir. Fare günlük attı, ve can çekişen olunca ötenazi uygulanır. Alıcı fareler genellikle 20-30 gün transplantasyon sonrası can çekişmekte. Sıçan modellerinde GVHH immünoloji incelemek için değerli araçlardır. Seçerek özellikle T hücre alt ark nakliHer bir alt kümeye oynar rolleri dikkatli belirlenmesi için alçak. Non-invaziv in vivo T hücre yanıtları izleme murin GVHH modelleri değeri başka bir katman ekler.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model at JoVE.com

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için yeteneği<em&gt; In vivo</em&gt; Graft-versus-host hastalığı sırasında T hücre yanıtlarının geliştirilmesi ve idamesi ayrıntılı analizini sağlar.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K Görüntüleme.  The Ohio State University Medical Center. Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için yeteneği In vivo Graft-versus-host hastalığı sırasında T hücre yanıtlarının geliştirilmesi ve idamesi ayrıntılı analizini sağlar.

Video: Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...