Name: an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

Biz TEER ölçümlerine ilişkin yararlı tartışmalar için Annika ENGBERS ve mükemmel teknik destek için Frank Kurth ve Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) minnettarız. Bu çalışma, HW ve LK, CRC TR128, için SFB1009 proje A03 A08 projeleri Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir; Z1 ve B01 LK ve LK HW ve (Münster Tıp Fakültesi) Klinik Araştırma Disiplinlerarası Merkezi hibe sayısı Kl2 / 2015/14 için.

hayvan bakımı Alman kurallarına göre tüm deneyler için, fareler yetiştirilmiş ve Münster University merkezi bir hayvan tesisine spesifik patojenden serbest durumlar altında tutulur. Bütün deneyler hayvan deneylerinin etik komitenin kurallarına göre yapılır ve Kuzey Ren-Vestfalya, Almanya (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) yerel otoriteler tarafından kabul edildi. 1. MBMEC İzolasyon ve Kültürü Not: Daha önce şu değişiklikler detaylı 14&#39;de anlatıldığı gibi MBMECs izole: <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) 20 yetişkin C57BL / 6 fareler kurban ve kalp ve solunum arrest araştırarak onların ölümünü onaylayın. </li><li> % 70 etanol ile fare durulayın ve makas kullanarak başını kesmek; forseps ve makas kullanılarak kafa derisi çıkarın. foramen magnum başlayarak, kafatasının sol ve sağ tarafında kesiler olun. onun kuyruk tarafı ve tak gelen kafatası kaldırınforseps ile beyin dışarı e. </li><li> Laminer akış kaputu altında, sadece korteks tutarak, bir Petri kabındaki beyin yerleştirin ve beyin sapı, beyincik ve talamus kaldırmak için steril forseps kullanabilir. NOT: Bir mikroskop kullanımı, bu herhangi bir aşaması için gerekli değildir. </li><li> Steril Western lekeleme bir kağıt parçası üzerine korteksi yerleştirin ve meninks artık görünür olana kadar forseps ile yavaşça yuvarlayın. </li><li> (Protokol 14 Aşağıdaki) mekanik ve enzimatik sindirimden sonra, uzun, steril bir iğne ve 5 mi piston kullanılarak yoğunluk gradyanı endotel hücreleri toplamak. Endotel hücreleri eritrositler ile kırmızı halka üzerinde bir karanlık bir tabaka olarak görünür. Yeni 50 mi santrifüj tüpe bu katmanın devri 20-25 mi; DMEM ile tüp kontör. </li><li> Yıkama 14 iki tur sonra, puromisin içeren MBMEC ortamında (4 ug / ml), 6 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 24 oyuklu plaka altı kaplanmış oyuklarına üzerine onları tohum; bir dokuda onları terk37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 kültür inkübatörü üç gün (buradan itibaren &quot;kuluçka&quot; olarak adlandırılır). NOT: MBMEC kaplama çözeltisinin ayrıntılar için Malzemeler Tablosuna bakınız. </li><li> Puromisinin olmayan, taze MBMEC ortam, her sıra için, 1 ml ilave edilerek orta değiştirme; iki gün daha geri 37 ° C ve% 5 CO2 de tabak koydu. </li></ol> 2. Hasat MBMECs <ol><li> MBMEC izolasyondan sonra Beşinci günde MBMEC kaplama solüsyonu ile ön kaplama geçirgen eklerde: uç başına çözeltisi 80 ul ilave edin ve 3 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de bırakmak ve% 5. </li><li> Dikkatle kaplama çözüm pipet ve 30 dakika boyunca ekler hava kurumaya bırakın. orta yıkamak MBMECs kullanılarak plaka her oda sıcaklığında 2 ml (RT) PBS ilave et; bu adımı tekrarlayın. % 0.05 tripsin-EDTA (oyuk başına 300 ul) ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca inkübatör plaka bırakın. </li><li> durdurmak için her bir oyuğa MBMEC orta 2 ml ilave edilirtrypsinization. 15 ml santrifüj tüpüne hücreler toplandı aktarın ve 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj. Süpernatantı atın ve Puromisinin olmadan MBMEC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Hücreleri saymak; % 0.04 tripan mavi 90 ul (hücre 10x seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın. Pipet cam kapak ve hücre sayım odasına (hemositometre) arasındaki bu karışımı 10 ul. odanın (N), dört çeyrek Tripan Mavisi içermeyen hücrelerin sayısı ve sayılan hücrelerin (N &quot;) &#39;nin ortalama sayısını belirlemek aşağıdaki gibidir: K&#39; = K / 4. </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak (10 6 hücre / ml), hücre konsantrasyonu hesaplanır: C = N x 10 4 hemasitometre boyutlarıyla verildi ve 10 adım 2.4 seyreltme faktörüdür 10 x 10 4,. </li><li> Tohum uç başına 260 ul&#39;lik bir hacim içinde 2 x 10 4 hücre. her bir alt bölmeye MBMEC ortamının 810 ul ekle. bölüm 4 ile devam etmek için hazır olana kadar inkübatör ekler ile plaka koyun. NOT: Üst ve alt bölüm için hacimleri insert spesifik ve tüm 24-kuyu biçimleri için işe yaramaz. </li></ol> 3. CD4 + T hücre izolasyonu ve Uyarım <ol><li> CD4 + T hücre Isolation <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) bir yetişkin fare Kurban ve kalp ve solunum arrest ascertaining ederek ölüme onaylayın. </li><li> Temiz bir diseksiyon gemide sırtında fare yerleştirin ve% 70 etanol ile durulayın; dalak ve lenf nodları (inguinal, koltuk altı, brakiyal ve rahim ağzı) periton açıp kaldırmak için steril makas ve forseps kullanabilir; Son olarak, buz üzerinde 5 ml PBS içeren 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın. </li><li> Laminer akış Kaputun altında, üstünde bir 70 mikron hücre süzgecinden ile 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku ile PBS boşaltılarak doku transferi; homojenleştirmeksüzgecinden 1 ml pistonu ile bastırarak dokusudur. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj bunu 30 ml ekleyin. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. tüp FACS tampon diğer 20 ml ekleyin, 40 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de o santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve FACS tampon 500 ul hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Fare CD4 manyetik mikro boncuklar 20 ul ekle karıştırın ve 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj bunu 25 mL ekleyin. </li><li> Bu süre zarfında, mıknatıs bir LS ayırma sütunu yerleştirin ve FACS tamponu 3 ml ile durulayın. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> sütun hücreleri ekleyin. üç kez FACS tamponu 3 ml sütun yıkayın. mıknatıstan sütunu kaldırmak ve yeni bir 15 ml merkezkaç üzerine yerleştirinfugation tüp. FACS tampon 5 ml ekleyin 5 dakika 4 ° C için 500 xg&#39;de sütun piston ve santrifüj onu etiketli hücreleri yıkayın. </li><li> Süpernatant atılır ve T hücre ortamının 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Oyuk başına ortam 100 ul 2.4 ve tohum 1 x 10 5 hücre tarif edildiği gibi hücre sayımı. </li></ol></li><li> CD4 + T hücre uyarımı <ol><li> Poliklonal CD4 + T hücre uyarımı <ol><li> Ön kaplama, istenen nihai konsantrasyonda saflaştınlmış anti-fare CD3 antikoru PBS (klon 145-2C11), bir yuvarlak dipli 96 oyuklu plaka. Örneğin, 1 ug / ml&#39;de α-CD3 ile tam plaka ön kaplama için, PBS, girdap, 5 ml antikor 10 ul (stok konsantrasyon = 0.5 mg / ml) karıştırmak ve karışımın 50 ul iyi çok kanallı pipet ile her. </li><li> 3 saat inkübatörde plaka bırakın. T hücrelerinin izole edilmesi sonra PBS ile iki kez önceden kaplanmış plakayı yıkayın. (Klon saflaştırılmış anti-CD28 antikor ekleyinArzu edilen bir nihai konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri (kadar 37.51), örneğin, 1 ug / ml); iyice karıştırın. T hücrelerini Tohum ve iki ya da üç gün boyunca inkübatör onları bırakın. </li></ol></li><li> Dendritik hücreler (DC&#39;ler) ile antijene özgü CD4 + T hücresi uyarımı Not: DCler antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) olarak kullanılması halinde, bu özel durumlar dışında, T hücresi izolasyon Protokolü izleyin: <ol><li> dalak homojenize önce, 0.5 mg / ml PBS içinde kollajenaz tip Ia 1 ml enjekte ve 15 mi santrifüj tüpe aktarın. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde inkübe edin. PBS ile yıkandıktan sonra, FACS tampon pelet tekrar süspansiyon ve 20 fare CD11c, manyetik mikro boncuklar ul yerine CD4 mikro ekleyin. </li><li> MS ayrımı kolonu ve uygun hacimlerde: FACS tampon 1 ml kolon durulama; FACS tampon 1 ml ve tekrar süspansiyon Hücreler, FACS tamponu üç kez 1 ml sütun yıkayın. </li><li> ilanDCler (örneğin, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) aa 35-55 20 de ug / ml) için tercih edilen bir D antijen, iyice karıştırın ve tohum 5 x 10 4 hücre T hücre kültür ortamında 100 ul başına 96 yuvarlak Alt- iyi. </li><li> Protokol T hücre izolasyonu tarif edildiği gibi, sonunda 96 yuvarlak dipli-oyuk başına T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleyin. </li></ol></li><li> B hücreleri antijen-spesifik CD4 + T hücresi uyarımı NOT: B hücreleri APC &#39;olarak kullanılması halinde, bu istisnalar, T hücre izolasyonu için Protokolü izleyin: <ol><li> Olan B hücreleri (B hücreleri, özellikle MOG 35-55 tanır, örneğin, IgH MOG (Th) fareler) antijen spesifik transgenik farelerden dalak kullanın. </li><li> (TCR MOG (2B2) fareler arasında, örneğin) antijen-spesifik T hücreleri kullanır. Fare CD19 manyetik mikro boncuklar yerine CD4 mikro 20 ul ekleyin. </li><li> B cel için tercih edilen antijen ekleLS (örneğin, 20 ug / ml&#39;de MOG 35-55), 96-yuvarlak dipli oyuklu her B hücre kültür ortamında 100 ul 5 x 10 4 hücrelerini karıştırın ve tohum. </li><li> Her T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleme 96 yuvarlak dipli çukurlu T hücresi izolasyon Protokolü hazırlanır. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Kurma ve TEER Ölçümü Sahne <ol><li> Laminer akış kaputun altında TEER aletinin 24 kuyu modülünü yerleştirin. forseps kullanarak enstrüman MBMECs ile kapakları ve yer ekler çıkarın. </li><li> Modül kuyu alt bölmesine taze ortam 810 ul pipet: uç ve de modülün duvarı arasında dikkatli bir şekilde ekleyin. </li><li> kapaklarını kapatın ve inkübatör aleti koyun. kendi bilgisayarına aleti bağlayın; Gösterge denetleyicisi açmak ve yazılımı açın. </li><li> Pop-up pencerede &#39;yeni ölçüm&#39; seçeneğini seçin. Check &#39;şov TEER&#39; ve &#39;gösteri CCI&#39; kutuları; tuşuna basın &#39;start&#39;. İlk ölçüm tamamladıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için &#39;sonuçları&#39; sekmesinde &#39;tüm kuyuları kontrol&#39; seçeneğini seçin. </li><li> &#39;Dosyanızın adı&#39;&gt; Farklı kaydet&gt; Dosya: Dosyayı kaydedin. NOT: TEER ve Ccl sürekli olarak, otomatik bir şekilde ölçülür olarak, üç ila beş günlük bir süre boyunca değerlerini izler. hücre canlılığı, optimal olmadığı sürece TEER artış eksikliği ile gösterildiği gibi orta değiştirme gerekli değildir. </li><li> Ccl istikrarlı ve daha düşük 1 mF / cm 2 ve TEER maksimum seviyeye ulaştığında T hücreleri ile MBMECs kültür eş zamanlı noktasını seçin. </li><li> Dikkatle mutlak TEER ve Ccl değerlerini incelemek ve MBMECs bu tür kuyular işaretini kaldırarak konfluan yeterli mono tabakaları gelişmemiş olan kuyular hariç. </li><li> Grup kuyuların kalanı: Bir kuyu üzerinde sağ tıklayın ve &#39;yeni ortalama kuyu iyi eklemek&#39; seçeneğini seçin. namPop-up pencerede e; tüm bireysel kuyuları gruplandırılmış olması için de aynı şeyi. </li><li> hepsi ko-kültür önce aynı başlangıç ​​koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyu kontrol edin. Bazı önemli ölçüde farklı mutlak TEER değerlere sahip veya TEER eğimli veya standart hatalar çok büyükse, gruplama kokan. NOT: Kuyular optimal gruplama içinde ve deney grupları arasında hem TEER değerlerinde minimum varyasyon sağlar. </li><li> &#39;Deney&#39; sekmesinde, basının &#39;pause&#39;, enstrüman ayırın ve inkübatör dışına götürün. Laminer akış kaputun altında kapaklarını çıkarın. </li><li> Hazırlanan önceden aktive arzu edildiği gibi, veya belirli sitokinler, antikorlar ya da diğer maddeler olmadan ve / veya naif T hücreleri: hazırlanmış T saflaştırılmıştır mix NA / LE sıçan anti-fare IFN-γ antikoru (klon XGM1.2): Örnek hücreler, TEER aygıtının oyuk başına 20 ug / ml&#39;de. NOT: Bu Granzim B inhibitörü olarak maddeler kullanıldığında, bunlar, birT hücresi stimülasyon başında olan T hücre kültürüne dded: örneğin, Granzim B inhibitörü II (Calbiochem) DMSO içinde 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri ile karıştırılır. Daha fazla bilgi için malzemeler ve donatım bakın. </li><li> Ovülden orta (üst kuyu bölmesi) bazı kaldırın: (Bu MBMEC tek tabaka rahatsız olabilir gibi tüm orta kaçınılmalıdır kaldırma), örneğin dikkatlice 150 ul dışarı pipetle. </li><li> Dikkatli bir şekilde 2 x 10 5 hücre / parçasını içeren ortam 150 ul pipetleme MBMECs T hücrelerinin ekleyin. NOT: Önceden aktive T hücreleri hasat, yalnızca, Tripan Mavi-serbest hücreleri patlatma saymak. </li><li> kapaklarını kapatın ve tekrar inkübatör cihazı yerleştirin. enstrüman ve basın &#39;özgeçmiş ölçümü&#39; yeniden bağlayın. ve &#39;deney&#39; sekmesinde 24 saat, basın &#39;dur&#39; sonra dosyayı (Dosya&gt; Kaydet) kaydedin. </li></ol> 5. Veri Aktarma ve İstatistiksel Analiz <ol><li>Dosya&gt; Dışa Aktar&#39;ı seçerek sonuçları ihracat. </li><li> Pop-up pencere &quot;ayarları&quot; sekmesinde, &quot;alan sınırlayıcı&quot; seçeneğinde &quot;ondalık ayracı&quot; seçeneğinde &quot;.dot&quot; ve &quot;sekme&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;İhracat sonuçları&quot; sekmesinde, dosya adı tüm kuyuları ihraç edilecek kontrol ve &quot;verileri seçmek&quot; seçeneğindeki &quot;teer&quot; ve &quot;Ccl&quot; onay kutularını. </li><li> Basın &quot;ihracat verileri,&quot; aktarılan dosyayı açın ve bir elektronik tabloya veri kopyalama. </li><li> ko-kültür önceki son zaman noktasında Set TEER ve Ccl değerleri% 100 ve diğer tüm için buna göre değerleri değiştirmek: (Her çalışma (ölçüm için verilen TEER ve Ccl değerleri ile, her tekrarında sıralama kriteri:)) ihraç veri normalleştirmek &#39;% 100&#39; vadede göreceli çalışır. </li><li> ayrı ayrı kuyuların kullanılarak ve her tedavi grubu için ortalama standart hata gösteren bir grafik oluşturmak için bir seçim yazılımı normalleştirilmiş verileri kopyalama. </li><li> Pseçim istatistiksel yazılımı kullanarak, çoklu karşılaştırmalar için bir Bonferroni düzeltmesi İki yönlü ANOVA istatistik testi erform. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

tarif edilen protokol birkaç adım başarılı deney için gereklidir. Başlangıç ​​MBMEC izolasyonu ve kültürü sırasında, çalışma mantar sporları, bakteri veya hücre kültürünün bulaşmasını önlemek için, mümkün olduğu kadar, steril koşullar altında gerçekleştirilir çok önemlidir. EC saf bir kültür elde etmek için, bir EC hayatta kalmasını sağlayan, ilk üç gün puromisin içeren ortam, ancak diğer hücre türleri (özellikle perisitler) 41,42 kullanılması tavsiye e...

3 -, kan-beyin bariyeri, merkezi sinir sistemi (MSS) 1 sistemik dolaşıma ayırır. Bu hücrelerin serbest dolaşımını ve suda çözünen moleküllerin difüzyon engeller ve patojenler ve potansiyel olarak zararlı maddelerden koruyan beyin fiziksel bir engel oluşturur. bariyer fonksiyonuna ek olarak, BBB nöronal doku düzgün işleyişini sağlayan beyin parankimi, oksijen ve besin iletimini sağlar. BBB fonksiyonel özellikleri son derece son derece uzmanlaşmış EC ana yapı elemanı olmak üzere, hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından düzenlenir. BBB EC sıkı birleşme (TJ) kompleksleri, fenestrasyonlar eksikliği, aşırı düşük pinocytic aktivitesi ve kalıcı olarak aktif taşıma mekanizmaları varlığı ile karakterize edilir. endotel, astrositik uç ayak ve = ilişkili par katıştırma Diğer BBB bileşenleri AK bazal membran, perisitlerenchymal bazal membran da bbb 2,4 geliştirilmesi, bakım ve işlevine katkıda - 6 ve birlikte nöronlar ve mikroglia ile merkezi sinir sistemi 7 doğru çalışmasını sağlayan nörovasküler birimi (NVU) meydana - 9. Bu gibi nörodejeneratif, enflamatuar veya bulaşıcı hastalıklar gibi nörolojik hastalıklar, çeşitli, BBB fonksiyonu 2,5,10 ele almaktadır. TJ kompleksleri ve moleküler taşıma mekanizmaları düzensizliği BBB geçirgenliği, lökosit ekstravazasyonu, enflamasyon ve nöronal hasarı sebep olur. Böyle patofizyolojik koşullarda BBB özelliklerini incelemek amacıyla, çeşitli in vitro BBB modelleri 9,11,12 kurulmuştur. Birlikte bariyer bütünlüğünün, geçirgenlik yanı sıra taşıma mekanizmaları değişiklikleri değerli bilgiler sağlamıştır. Bu modeller, insan, fare, sıçan, domuz veya b endotel hücrelerini kullanırKoyun kökenli 13-18; 25 - primer endotel hücreleri ya da hücre hatları, in vivo 19 daha yakından BBB taklit etmek için perisitler ve / veya astrositler ile tekli kültür olarak ya da birlikte kültürlenir. Son yıllarda, endotel elektrik direnci (TEER) ölçümü endotel bariyer özelliklerinin 26,27 değerlendirmek için yaygın olarak kabul gören bir araç haline gelmiştir. TEER hücre tek tabaka boyunca iyon akı empedansı yansıtan ve onun azalma tehlikeye endotel bariyer bütünlüğünün ve dolayısıyla artan geçirgenliği hassas bir ölçümünü sağlar. 30 - Çeşitli TEER ölçüm sistemleri Epitelyal Voltohmmeter (EVOM), elektrik Hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) ve gerçek zamanlı hücre analizi 15,28 dahil olmak üzere geliştirilmiştir. TEER bitişik EC arasındaki iyon akımının (paraselüler yol) direnç gösterir ve doğru orantılıdırbariyer bütünlüğü. Empedans spektroskopisi 27,31 yılında, karmaşık toplam empedansı (Z) CCL ölçerek bariyer bütünlüğünün hakkında ek bilgi sağlar, hangi ölçülür. CCL hücre zarı (transsellüler yol) üzerinden kapasitif akımı ile de ilgilidir: hücre katmanı zarın her iki tarafında ücretleri ayırma eşdeğer elektrik devresinde bir kapasitör gibi davranır ve ters bariyer fonksiyonunun orantılıdır. geçirgen ekler üzerinde yetiştirilen zaman, EC, uygun çoğalırlar ve mikro gözenekli membran yayıldı. Bu (kendisi bir kondansatör gibi davranır) ve minimal seviyeye ulaşana kadar kapasitans bir azalmaya yol açar ucun arka kapasitif akımını direnç gösterir. Bu TJ kurulması takip eder komşu EC arasındaki boşluk kapalı olduğu mühür kompleksleri. Bu parasellüler yoldan iyon akı kısıtlar ve onun plato ulaşana kadar TEER arttırır. inflamatuar koşullar altında, ancak, endothelial bariyer tehlikeye: TJ bozulur olsun kompleksleri ve ekin kapasitif bileşeni tekrar yükseldiğinde Ccl arttıkça TEER azalır. Bizim TEER ölçümü otomatik hücre izleme 32 sistemi kullanır: Bu empedans spektroskopisi prensibini takip eder ve önceki uygulamalarını uzanır. Burada, bağışıklık hücreleri ile beyin endotel etkileşimi de dahil olmak üzere bariyer özellikleri çalışma, sağlayan in vitro BBB modeli tarif; özellikle aktive edilmiş T hücreleri. 37 - Bu patofizyolojik koşullar, çoklu skleroz ve hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit 33 olarak merkezi sinir sisteminin bağışıklık hastalıklarının gözlenmektedir. Burada, çok önemli bir adımdır BBB boyunca ensefalitojenik, miyelin özgü T hücrelerinin göçü olup. Bu beyin parankimi içine perivasküler alanda ve giriş onların reaktivasyonuna tarafından takip edilir, diğer bağışıklık hücrelerini işe ve bana neredeACİL enflamasyon ve daha sonra demiyelinasyon 1,35,38. Bununla birlikte, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimin moleküler mekanizması, BBB temel bileşenler, iyi anlaşılmamıştır. Bizim protokol bu boşluğu doldurmak ve aktive T hücreleri ile bunların doğrudan temas ve karmaşık etkileşimi üzerine endotel hücreleri (yani, bariyer bütünlüğü ve geçirgenlik) üzerinde sonuçları yeni bir bakış açısı kazandırmayı amaçlamaktadır. Burada açıklanan protokol mikro-gözenekli membran ile geçirgen eklerde üzerinde tek-katman olarak yetiştirilen primer fare beyni mikrovasküler endotel hücreleri, kullanır. Endotel hücreleri, ortak-kültürlenir poliklonal veya antijen spesifik şekilde ya da ön-aktive edilebilir, CD4 + T hücreleri ile. Ön-aktifleştirilmiş, ancak saf T hücreleri ile MBMECs Co-kültür TEER bir azalmaya ve MBMEC fonksiyon bozukluğu ve engelleyici bir bozulma nicel ölçümünü sağlar CCl bir artışa da neden olur. tekniknon-invaziv: built-in yerine AT tek tabaka büyük olumsuz yönde etkilenmemesi çubuk elektrotlar, kullanır; hücre belirteçleri kullanılmadan bariyer fonksiyonunu izlemek için de kullanılabilir. Bu otomatik bir şekilde sürekli ölçümler yapar ve aynı anda zamanla iki bariyer parametreleri (TEER ve Ccl) bağımsız bir değerlendirmesini sağlar. Yöntem ayrıca, farklı T hücresi aktivasyonunun seviyeleri ve EC ile T hücrelerinin etkilerini ayırt kadar hassastır. Bu fonksiyonel analizlerin geniş bir kullanılabilir: inflamatuar süreçlere de karışırlar farklı sitokinler ve / veya kemokin MBMECs ve T hücrelerinin ko-kültür ilave edilebilir; EC ya da T-hücresi, her iki yanında, hücre yapışma moleküllerinin karşı bloke edici antikorlar kullanılabilir; ve T hücre aktivasyon işaretleme maddelerinin veya sitolitik özellikleri inhibitörleri, T-hücresi priming veya EC ile ko-kültür sırasında ilave edilebilir. Tahlil, aynı zamanda, T-hücresi göçü için kullanışlıdırdeneyler, bu T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, MBMEC tek tabaka bütünlüğünün bir kalite kontrol olarak hizmet edebilmektedir. Bütün bu yöntemini AK tek tabaka bütünlüğünü aktive T hücrelerinin etkisi odaklanarak, in vitro BBB incelemek için çok yönlü ve güvenilir bir araçtır. Bu, kendi kendine reaktif ensefalitojenik T hücreleri BBB çapraz ve enflamasyon ve nöronal zarara neden MS ve hayvan modeli EAE gibi oto-bağışıklık hastalıklarının patojenezinde BBB bozulma mekanizmalarının anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>for TEER measurement as the main readout</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td></tr><tr><td>24-well cell culture plate</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>flat-bottom; for MBMEC culture</td></tr><tr><td>96-well cell culture plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>round-bottom; for immune cell culture</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS LS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>for T cell and B cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>for CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>for B cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Collagen type IV from human placenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Collagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>for MBMEC and immune cell isolation</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>for harvesting MBMECs</td></tr><tr><td>Collagenase Type IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>for T cell culture medium</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>protect from light; for B cell culture medium</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>mouse MOG&lt;sub&gt;35&amp;mdash;55 &lt;/sub&gt;peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>for antigen-specific T cell activation</td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>Recombinant Murine TNF-&amp;alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>recommended final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td></tr></tbody></table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Şekil 1, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan in vitro BBB modelinin genel bir bakış sağlar. Deney üç ana adımdan oluşur. İlk adım beyin korteks primer MBMECs izolasyonu ve beş gün boyunca onların kültürüdür. Onlar hücre kültürü plakasına izdiham ulaştığınızda, MBMECs tripsinize ve sonra TEER enstrüman yerleştirilir geçirgen ekler, üzerine reseeded edilir. TEER ve MBMECs CCL sürekl...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.2K Görüntüleme.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Video: An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Tıp

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

İmmünofloresan Boyama ile Kan-Beyin Bariyer Modellerinin Analizi

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Yazar Spotlight: İnsan Dokularını İncelemek için Doku Çipi Teknolojisinin Kullanımını Geliştirme 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Biyomühendislik

Hücre Bariyeri Bütünlüğünü Değerlendirmek için Transendotelyal Direnç Ölçümü

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Yazar Spotlight: Hücre Bariyeri Bütünlüğünü Değerlendirmek için TEER Algılama Uygulamaları 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ayarlama-up bir

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı