Bu yöntem, immüno-metabolizma alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, farklı hücre tiplerinin karmaşık bir karışımı nda, tek tek canlı hücrelerde mitokondri veya lizozomların sayısallaştırılmasına olanak sağlamasıdır. T ve B hücrelerini incelemek için kullanılan bu yöntem, makrofajlar, dendritik hücreler veya doku örneğinden alınan birincil hücreler gibi diğer birçok hücre tipine de uygulanabilir.
Prosedür, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Chin-Wen Wei tarafından kanıtlanacak. Sayısallaştırma için organelleri etiketlemek için, ilk olarak, işaretçi başına bir yuvarlak alt faks tüpüne altıncı fare T hücrelerine bir kez on ekleyin. Ve santrifüj ile hücreleri pelet.
37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış serumsuz kültür ortamı, organel ekibe özgü prob stok çözeltilerini ortamdaki son çalışma konsantrasyonlarına seyreltmek için kullanılır. Ve tüpler başına 100 mikrolitre probu boyasında hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, uygun boyama dönemi için bir hücre kültürü kuluçka hücreleri kuluçka, tüp başına buz gibi faks tampon bir mililitre ile kuluçka sonunda reaksiyonu durdurarak.
Sonra, başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve önceden titremiş 24G2 hibridoma supernatant buz üzerinde 100 mikrolitre pelet yeniden askıya. On dakika sonra, tüp başına faks tampon bir mililitre ekleyin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve ilgi önceden titremiş floresan kontrküllü antikor kokteyl 50 mikrolitre ile hücreleri etiket.
Tabloya göre uygun konsantrasyonu ekleyin. Ve faks tamponu 20 dakika boyunca buzda, ışıktan korunuyor. Kuluçka sonunda, tüp başına faks tampon bir mililitre ekleyin.
Santrifüj ile hücreleri toplayın. Ve 300 mikrolitre lik faks tamponundaki hücreleri mililitre de propidium iyodür başına bir mikrogramla yeniden askıya alın. Nükleer ve kromozom karşılemi ni ekledikten hemen sonra, akış sitometre analiz bilgisayarını, akış sitometresini, faks edinme yazılımını ve makine platformuna bağlı olarak diğer aksesuar cihazlarını açın.
Akış çizgisinin PBS ile dolu olduğundan ve tamponu sabitlemediğinden emin olmak için PBS'yi yaklaşık bir dakika boyunca sistemde çalıştırın. Yeni bir deneme açın ve sitometre parametrelerini üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.
Ve girdap önce her örnek elde kümeleri ve doublet oluşumunu önlemek için. Otomatik Telafi ayarını açın ve her floresan parametre için nokta çizimleri oluşturun. Tüm gerilimler ayarlandıktan sonra, tazminatı ayarlayın ve telafiyi numunelere uygulayın.
Yan dağılım çizimine karşı ileri bir dağılım oluşturun ve ilgi hücrelerinin çizim içinde görünmesi için gerilimleri optimize edin. İleri dağılım adağı ile ileri dağılım yüksekliği çizimi oluşturun ve tek hücreleri kapama. Yan dağılım alanı arsa karşı bir ileri dağılım alanı oluşturun ve lenfositler kapısı.
Propidium iyodür çizimine karşı bir ileri dağılım alanı oluşturun ve canlı hücreleri kapayın. Tüm gerilimler ayarlandıktan sonra, tazminatı ayarlayın ve telafiyi numunelere uygulayın. Daha sonra ilk örnek tüpü yükleyin, uygun hücre yüzeyi işaretçisi çizimlerini oluşturun ve ilgi çeken nüfusun en az 1.000 olayını toplayın.
Tüm örnekler çalıştırıldığında, sonraki çözümleme için akış verilerini dışa aktarın. Ve gelecekte benzer deneyler için sitometre ayarlarını ve parametreleri korumak için denemeyi şablon olarak kaydedin. Son site mitokondriyal içerikçift negatif bir T hücrelerinde en düşük, çift negatif evre iki ve üç zirve, ve biraz çift negatif evre dört azalma.
Cd4 ve CD8 tek pozitif timositlere göre mitokondri sayısının daha yüksek olduğunu gösteren çift pozitif timositler ile mitokondriyal içeriğinin gelişim sırasında dalgalandığını düşündürmektedir. CD4 ve CD8 tek pozitif timositler, splenik CD4 veya CD8 T hücrelerinden daha yüksek mitokondriyal ortalama floresan yoğunluğu sergilerler ve oksijen açısından zengin kan ortamında dolaşan naif T hücrelerinin timositlerden daha düşük mitokondriyal kütleye sahip olduğunu düşündürmektedir. İlginçtir, mitokondriyal içeriğin bu azalma CD4 T hücre soyundan daha CD8 daha belirgindir, ve T hücre aktivasyonu daha bu organellerin varlığını azaltır.
Tüm timosit popülasyonlarında nispeten düşük, ancak saptanabilen, lisozomal içerikler gözlenir ve çift negatif bir timositte daha belirgin dir. Çevrede bellek ve efektör CD8 pozitif T hücrelerinde nispeten yüksek sayıda izozom tespit edilir. Organel spesifik boyalar ve yüzey belirteci ile akış sitometrisi birleştirilmesi karmaşık bir karışım hücrelerin metabolik durumunu karakterize etmek için güçlü bir yoldur.
Ek organel spesifik boya endoplazmik retikulum tespit etmek için kullanılabilir, otophagic vakuol, veya ilgi diğer hücre içi bölmesi.
