Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Hibe 0635480N ve Sağlık araştırmaları hibe AI081220 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. BIC Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı araştırma bursu ile desteklenmektedir.

Genel bakış Protocols, ilk, parazitler% 70 (1 protokolü) öldürme mutagen dozaj tanımlamak için verilmiştir. Sonraki prosedürü bir mutagenized parazit havuzu (protokol 2, Şekil 2), indüklenen çıkış mutantlar zenginleştirmek için sağlanır. Bu, insidansı çıkış mutantların zenginleştirilmiş havuzda test etmek için, ya da, bireysel mutantlarındaki çıkış fenotip (protokol 3) doğrulamak için bir protokol ile takip edilmektedir. Sonuç olarak, bir protokol zenginleştirilen popülasyonlarının tek sınırlayıcı seyreltme (protokol 4) tarafından parazit klonlar oluşturmak üzere temin edilir. 1. Mutajen ve titrasyonu Yüksek mutajenik bileşikleri ve sıvılar ile çalışırken özel dikkat, çift eldiven gibi kullanın. Sıvı atıkların uygun şekilde bertaraf edilmesi için ayrı ayrı toplayın. <ol><li> T25 birleştirilebilmeli insan sünnet derisi fibroblast, taze eridi tachyzoites 1 ml (HFF) hücreleri doku kültürü şişeleri inoküle ve 37 saat 18-25 büyümeye °; C,% 5 CO2 altında, orta Ed1 (% 1 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu, 0.2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin, 50 ug / ml streptomisin, 0.25 ug / ml Amphotericin B, D-MEM ile desteklenmiş ). Bakınız Roos et al. HFF hücreler ve parazitler 21 genel büyüme ve medya için. </li><li> 10 dk için 10 ml% 0.1 fetal bovin serum (D-MEM içerisinde seyreltik Ed1 01:10), orta ve (burada 37 ° C inkübatöründe &quot;olarak da adlandırılır),% 5 CO2 altında nemli 37 ° C inkübatöründe bırakmak orta yerine . </li><li> (, Mutagen çalışma dilüsyonları 5 2.5 1.25, sırasıyla, 10 mM), şişeyi başına 0, 12.5, 25, 50, veya 100 ul&#39;lik ENU (DMSO içinde 1 M stok) veya EMS (DMSO içinde 1 M stok) ekleyin. Her balona 100 ul DMSO ekleyin. 4 saat için 37 ° C inkübatöründe inkübe. </li><li> 10 saniye süreyle, oda sıcaklığında 10 ml soğuk PBS (4 ° C&#39;de ön-soğutuldu) ile tek tabakalı durulama ile üç kez yıkanır. </li><li> 5 ml PBS ekleyin, gevşek kauçuk polis (hücre scr ile tek tabaka kazıyınaper), fibroblast (ağır makas, iğne maruz iğne dışında mili off klibi) parazit fiziksel kaldırmak için 26.5 G iğne ile kazınmış hücrelerin geçmek, 3.0 um polikarbonat filtre ve filtre. Birden fazla iğne pasajlar konak hücre parazit bırakmadan verimliliği artacaktır. </li><li> Parazit konsantrasyonu hemasitometre kullanarak güvenin. Parazitlerin sayma öncesi hemocytomer 5 dakika dinlendiriniz. </li><li> 3 ml başına 10,000 Ed1 parazitler (10 ml 33.333 parazitler için gerekli olan) parazitler seyreltilir. </li><li> 3 ml, seyreltilmiş parazitler (içeren 10.000 parazitler) içinde bir 6 kuyulu plakanın ile tek bir sıra inoküle. Seri HFF iyi ilk 300 ul aktararak 2.7 ml Ed1 içeren hücreleri ile 6-kuyu plaka konfluent 3 kuyu içinde 10 kat parazitler sulandırmak. 7 gün boyunca 37 ° C inkübatör rahatsız plakaları bırakın. </li><li> 15 dak 3 ml / iyi% 100 etanol düzeltmek, leke, orta aspire3 ml / kuyucuk kristal viyole çözeltisi (500 ml% 1 amonyum oksalat ile karıştırılarak 125 ml etanol içinde 12.5 g kristal menekşe) 15 dakika boyunca, 3 ml / durulama ve PBS (dakikada 1) ve hava kuru. Oda sıcaklığında. </li><li> Plaklar sayın ve mutajen konsantrasyonu maruz parazitler (% 70 öldürme dozajı: bkz. Şekil 1)% 30 sağkalım elde etmek için gerekli seçin. % 70 öldürme dozu tarihsel olarak 14 kullanılır ve daha az genom başına 100 nokta mutasyonları (Farrell, Marth, Gubbels ve ark., El yazması gönderilmektedir) ikna edildi. </li></ol> 2. Çıkış mutantlar zenginleştirilmesi (Şekil 2) <ol><li> Öldürme indüklenmesi% 70 oranında bir mutagen dozaj kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi mutajenez gerçekleştirir. Bir geçişi için yeni bir konakçı hücreler balonuna mutagenized nüfus Grow. </li><li> Bir mutagenized nüfusu 120.000 taze lizlendi parazitler 10 ml Ed1, T25, HFF konfluent doku kültürü şişesi bulaştırmak. % 5 CO altında 2 saat süreyle 35 ° C inkübatöründe inkübe2 ve nemlenince (buradan sonra &quot;35 ° C inkübatöründe&quot; olarak adlandırılır). </li><li> , Orta ve 10 saniye daha sonra, 10 ml soğuk PBS ile durulama ve 10 ml Ed1, orta 25 mg / ml dekstran sülfat (DS), 13 ile takviye eklemek aspire edin. % 5 CO2 ve nemlenince (buradan sonra 40 ° C inkübatöründe &quot;adı verilen) altında 26 saat süreyle 40 ° C inkübatöründe inkübe. </li><li> Çıkış zenginleştiricilerin çalışma çözeltisi hazırlayın. 25 mg / ml DS ile desteklenmiş 10 ml HBSSc içeren 15 ml Falcon tüp çalışma konsantrasyonu az tercih çıkış indükleyici sulandırınız. Pre-dilüsyonları sıcak 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de su banyosunda. Çalışma konsantrasyonları için Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> Aspire parazit enfeksiyonlu şişeler orta ve önceden ısıtılmış bir çıkış indükleyicisidir çözümü ekleyin. Tablo 1 &#39;de gösterilen kez, 37 ° C inkübatöründe inkübe. </li><li> Orta aspire edin ve 10 ml soğuk PBS ile 10 saniye yıkayın ve daha sonra 10 ml Ed1 25 mg / ml DS ve 50 mM pirolidin ditiyokarbamatın ile desteklenmiş (PDTC ekleyin: reklam100 mM PDTC PBS içinde Stok d 5 ul) 13. 5 saat 35 ° C&#39;de inkübatöründe inkübe. </li><li> , Orta aspire edin ve 10 ml PBS (oda sıcaklığı) ile bir kez, 10 saniye daha sonra durulama ile 10 ml Ed1, orta eklemek. Günlük erlenlere: Çok parazitleri, monolayer yok kadar 35 ° C inkübatör geri mataralar koyun. Bu kurtarma 7 gün sürer. </li></ol> 3. Çıkış analizleri ile mutant fenotipleri Geçerliliği , Zenginleştirme ekran ve HFF hücrelerinde bir geçiş için zenginleştirilmiş nüfus büyüyor sonra, fenotipleri bir çıkış testi 11,13 teyit etmeniz gerekecek. Bu testte de protokolü 4 sonra tek klonları doğrulamak için kullanılmalıdır. <ol><li> Lamelleri (ortalama 1 ml Ed1 orta) yetiştirilen konfluent HFF hücreleri içeren bir 24 plaka başına 20.000 parazitler içine inoküle. Aktarmak için bir 40 ° C inkübatöründe 24 saat ve sonra 8 saat 35 ° C&#39;de inkübatöründe inkübe. </li><li> 1 ml / PBS (1 ile yıkayıpOda sıcaklığında, 0 saniye). 1 ml çıkış indükleyicilerin (sadece negatif kontrol içerir DMSO), pre-ılıtıldı ve HBSSc içinde seyreltilmiş ve Tablo 1 &#39;de tarif edilen kez için inkübe. </li><li> , Orta aspire edin ve 1 ml / 15 dk için oda sıcaklığında% 100 metanol ile düzeltmek. </li><li> Mutajenez bir autofluorescent protein ifade ebeveyn parazitler için kullanılmış olsaydı, # 3.5 13 adıma geçin. Olmayan floresan proteini ifade parazitler ebeveyn hattı olarak kullanılmış olsaydı, Diff-Quick az 1 oda sıcaklığında 11 dakika boyunca leke ile sabit lamelleri leke. </li><li> , Oda sıcaklığında 24-kuyulu plakanın 5 dakika içerisinde, 1 ml / kuyucuk PBS ile yıkanır. </li><li> Floresan proteini ifade parazitler için: hızlı durulama lamel, GKD 2 O (daldırma) ve floresan sinyal korumak için gelmount altında kızaklar üzerinde monte. Diff-Quick lekeli parazitler için,% 100 etanol içinde 10 saniye yıkayın ve slayt üzerinde monte etmeden önce hava kurumasını bekleyin. </li><li> (Floresan) mikroskop kullanma40-60x objektif vakuoller yüzdesi, vakuol karşı (bkz. Şekil 4) intrasellüler kaldı egressed saymak. </li></ol> 4. Seyreltme sınırlayıcı çıkış mutantlar Clone Fenotip 3 protokol kullanılarak zenginleştirilmiş çıkış mutant nüfus doğrulama sonra, poliklonal nüfus klonlanmış tek parazittir klonlar elde etmek için gereken. <ol><li> , Bir hemositometre parazit nüfus sayımı ve orta Ed1 mililitrede 500 parazitlerin konsantrasyonu ye tamamlanır. </li><li> Konfluent monolayer HFF hücreleri içeren bir 384-plaka, 40 ul / iyi Ed1 çok kanallı pipetlemeyin kullanarak orta orta değiştirin. Pipetlemeyin 40 ul / kuyucuk kuyulara C3-C12, mutant 2 C13-C22 kuyulara, H3-H12 kuyulara içine mutant 3, mutant içine seyreltilmiş mutant 1, Şekil 5 &#39;de gösterildiği gibi, dört poliklonal popülasyonlarının aşağıdaki gibi plaka başına klonlanmış edilebilir: H13-H22 kuyu içine 4 (kuyularda sonu hacmi 80 ul). Sol bir multi-kanal pipeti, pipet kullanarakution yukarı ve aşağı 5 kere, daha sonra başlayan satırı aşağıdaki satır (sıra C, D veya satır H I) 40 ul aktarmak. Bu, 2-kat seri seyreltiler, satır G (1 ve 2 mutantlarının) veya N satır (mutantlarının 3 ve 4) aracılığıyla devam edin. Son satır fazladan 40 ul atın. Plaka bozmadan 7-10 gün boyunca 35 ° C inkübatör inkübe edin. </li><li> Görünür, monolayer &#39;delik&#39; olarak tek bir plak varlığı için bir 10-20x objektif, ters bir mikroskop kuyu kontrol edin. </li><li> Tek bir plak, mutant başına 4 kuyu Pick ve HFF hücreleri ile doku kültürü şişesi konfluent parazitleri aktarmak ve Ed1 orta dolu. 35 ° C inkübatör parazitler büyüyünce;, ekstrasellüler parazit dağıtmak için günlük şişeler salla. Bu genellikle 7 gün sürer. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Mutajenler TRK ve EMS uzun süreler boyunca depolanan sabit değil. Bu nedenle,, mutajenik güç testhisse senetleri tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşımaktadır. Tipik titrasyon TRK ve hem de EMS eğrileri öldürme sonuçlarını ve Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. Ancak, bu, mutagenez deney için uygun dozu kullanılmış olduğunu tespit etmek için her türlü plak testleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Mutagenized parazit nüfus çeşitliliği korumak için, mümkün olduğunca çabuk çıkış mutant ekran ile devam etmek önemlidir. Tipik olarak, yeni bir balona parazitlerin bir geçit kalan parazitler ekran ile ileri gitmeden önce kurtarmak için yapılır. Bunu yaparken, mutantlar bölümü neden olacağını akılda tutulmalıdır. Bu nedenle tüm prosedürü tamamladıktan sonra izole edilen birden fazla klonal mutantların aynı genotip içerdiğini göz ardı edilemez. Fenotipleri (örneğin diferansiyel çıkış indükleyici hassasiyetleri) olmadıkça, onu, mutagenez başına tek bir çıkış mutant izole edilmesi tavsiye edilir aynı mutant birden çok kez izole önlemek içinbirbirlerine çok farklı olabilir. Diğer taraftan,, fenotip arzu edilen mutantların izolasyonu içinde, her bir ekranın sonuçlanır. Özelde, Ca-2 + iyonofor A23187 dirençli fenotip, nadir ve tek bir çıkış mutant izole etmek için çoklu mutajenez deneyler ve ekranlarını gerektirir. Bu nedenle paralel olarak 5-10 mutagenez ve ekran deneyleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Zenginleştirme güç ekranın farklı oranlarda yaban-tip parazitler karıştırma ile, bilinen bir çıkış mutant ile test edilmiştir. Bu karışımları ekranında tabi tutuldu ve, zenginleştirilmiş popülasyonda mutant fenotip sıklığı ölçüldü. Sitoplazmik YFP ifade wild-tip, sitoplazmik RFP ifade parazitler ve bir mutant hattı kullanarak insidansı 13 flow sitometri (Şekil 3) tarafından hızlı bir şekilde kurulabilir. Sonuçları mutant fenotipleri rutin 10.000 wild-tip p başına 1 mutant parazit çıkış ile başlayan 80% saflıkta zenginleştirilmiş olabilirarasites 13. Ancak, ne zaman çıkış mutant: wild-tip parazit başlama oranı, 1:100,000 parazitler ise, izole nüfusun sadece% 1-2 (1:100) çıkış mutantlar. Bu nedenle ekranın zenginleştirme gücü 1.000 kat. Ekranı tipik olarak% 70 geçerli olan 120.000 parazitler, aşılama ile başlayan bu yana, biz genellikle iki tur zenginleştirme gerçekleştirmek. Izole parazit zenginleştirme tur arasında büyüdü. Bu prosedür, yaban-tip parazitler 1:1,000,000 çıkış mutant ile başlayarak zaman dahi% 100 mutant nüfusu yol açar. , Fenotipleri doğrulamak ve karakterize etmek için çıkış testi bireysel vakuol farklılaşmasını sağlayan konak hücre enfeksiyon çokluğu gerektirir. Bireysel parazitlerin etrafa dağılmış olarak yüksek oranda çıkış koşulları analiz ederken bu özellikle önemlidir. Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi, egressed popülasyonlarının ayrılmış değilse yüzdesi düşük kolaydırbir vakuol olarak iki egressed vakuol sayma tarafından çıkış. Çıkış ve işgali ile ilgili süreçleri ve bazı ısıya duyarlı fenotipleri düşük sıcaklıkta hafif bir fenotip gösterilecek yana değil, tüm mutantlar benzer işgali verimliliği olacaktır. Böyle mutantlar nedenle kendi çıkış fenotip doğru bir değerlendirme için yeterince yüksek bir bir vakuol yoğunluğu elde etmek için birkaç kat daha yüksek dozlarda inoküle gerekir. Ayrıca, bazı çıkış indükleyicileri verimli dört veya daha az parazit içeren vakuoller çıkış teşvik etmemektedir. Bunun gibi, zaman çıkış assay başlangıç ​​Vakuollerin sekiz ya da daha fazla parazitler içeren çok önemlidir. Laboratuarımızda biz ekran mutantlar, diğer çıkış arttırıcılar karşı belirli bir çıkış zenginleştirici ile izole. Kendi çapraz reaktivite profilleme mutantların farklı sınıflarda toplanabilir. Son olarak, tüm çıkış mutantlar ısıya duyarlı olacaktır. , Çıkış indükleyicileri intracellula yayımlanmasından önce adımları tetikleme ile izole özellikle mutantlarr Ca 2 + olmayan ısıya duyarlı fenotipleri yatkındır. Bu sinyal, hücre içi Ca 2 + sürümü yakınsar önce çıkış yol açabilir paralel yollara kaynaklanmaktadır. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Şekil 1. Kimyasal mutajen doz titrasyonu. A. Plak Testler çeşitli EMS konsantrasyonları ve çeşitli sayıda da belirtilmektedir başına parazit kullanarak 6-kuyu plaka yapılan. Beyaz noktalar parazit plaklar içinde HFF mono tabakasında oluşturulmuş B, Çeşitli dozajlar için EMS (B) ve TRK (C) maruz bağlı parazitlerin C. sağkalım eğrileri. Survival plak analizleri ile değerlendirildi. % 70 öldürme uyararak doz mutagenez deneyleri için seçilir. , Üç bağımsız deneyin ortalamasını + / - standart sapma gösterilmiştir. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Şekil 2. Zaman ilerlemesi x-ekseni tarafından temsil edilir ise çıkış mutant zenginleştirme ekranın şematik gösterimi. Sıcaklık, y ekseni üzerinde gösterilir. Yeşil parazitler kırmızı parazit wild-tip parazitler yansıtmaktadır çıkış mutant parazitler, yansıtmaktadır. Zamanlama çıkış indükleyici koşulları ve stimülasyon değişiklikleri üst kısmında gösterilir ve, sıcaklık profili yansıtan mavi çizgi üzerinde oklarla işaretlenmiştir. Benimsenen Eidell ve ark. 13 <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Şekil 3. Tipik çıkış mutant fenotipleri zenginleştirme çeşitli oranlarda (x-ekseni) wild-tip parazitler karıştırılarak bir çıkış mutant zenginleştirilmesi sonuçları. Ekrandan sonra büyümüş nüfus çıkış mutant fenotipleri yüzdesi y ekseni çizilir ve akım sitometri (çıkış mutant parazitlerin sitoplazmik YFP ifade ile değerlendirildi, wild-tip parazitler cy ifade) RFP toplasmic. Üç bağımsız deney sonuçları, kırmızı, mavi ve yeşil veri noktaları ile temsil edilmektedir. Benimsenen Eidell ve ark. 13 <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Şekil 4. Tipik bir çıkış testinin sonuçları. . Oklar 4-8 parazit içeren dört farklı bozulmamış vakuol işaretleyin. B. Oklar dört bağımsız egressed vakuol yansıtan dağınık parazitlerin dört gruba işaretleyin. A23187 (B) veya DMSO ile çıkış (A) bir negatif kontrol olarak indüklenen. Parazitler sitoplazmik YFP 22 ifade. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Şekil 5, , Klonal parazit çizgiler. Dört poliklonal popülasyonları (kırmızı, mavi, sarı, yeşil) için seri seyreltme, seri HFF hücreleri ile tek bir 384-plaka confluent seyreltilir. Satır C ve başına 10 parazitleri almak veseyreltilmiş (40 ul + 40 ul) sırasıyla H ve N, satırlar kadar 2-kat. Gri tonunu iyi başına parazitlerin azalan sayısını gösterir. Tipik olarak, tek bir klonlar, DF ve JL satırlar bulunmuştur. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşik </td><td> Hisse senedi </td><td> Çalışma konsantrasyonu </td><td> T25 (10 ml) için ihtiyaç duyulan ul </td><td> İnkübasyon süresi (dk) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> DMSO içinde 1 M </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> 190 Proof </td><td> % 5 </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> DMSO içinde 2 mM </td><td> 1 uM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericin * </td><td> DMSO içinde 2 mM </td><td> 10 uM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericin zenginleştirmek kullanılamazparazitler olarak Ment ekran nigericin stimülasyon hayatta değil; sadece çıkış mutantların doğrulama nigericin kullanın. Tablo 1 işlemlerde kullanılan çıkış indükleyicileri. 25 mg / ml ekran veya mutant doğrulama (çıkış testi) için hiçbir DS DS içeren 10 ml HBBSc sulandırınız. Tüm bileşikler, Sigma-Aldrich.

<ol>
	<li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+[Ca2+]+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii.">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li><li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii.">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li><li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells.">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li><li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+dithiol-induced+Ca2++flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole.">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li><li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin.">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li><li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages.">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li><li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion.">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li><li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii.">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li><li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma.">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li><li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium/hydrogen+exchanger+in+calcium+regulation.">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li><li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress.">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li><li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells.">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li><li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress.">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants.">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship.">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li><li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites.">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li><li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant.">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li><li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii.">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li><li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment.">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li><li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate.">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein.">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii.">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li><li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion.">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li><li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells.">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li><li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells.">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li><li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca(2+)+release+from+inositol+1,4,5-triphosphate+(IP(3))/ryanodine-sensitive+stores.">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li><li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii.">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li><li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection.">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li><li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li></ol>

Biz ifşa şey var.

<html> Açıklanan protokol bir çıkış defekt ile Toxoplasma mutantlar izole etmek için etkili bir yöntem sağlar. Biz çıkış yolu, bir çift işgali fenotip 13 bazıları çeşitli adımlar boyunca başarıyla mutantlar izole. Işgali üzerine potansiyel etkileri diferansiyel antikor boyama 23,24 ile parazit olmayan işgal istila birbirinden ayırmış sözde kırmızı-yeşil testi kullanılarak tespit edilebilir. Hem işgali ve çıkış testleri için bu, parazitler 13,22</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> TRK </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda DMSO, 1 M Stok </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda DMSO, 1 M Stok </td></tr><tr><td> Dekstran Sülfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> PBS içinde 100 mM Stok </td></tr><tr><td> Ocak Şubat Mart Nisan Mayıs Haziran Temmuz Ağustos Eylül Ekim Kasım Aralık Hızlı </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre tutucu </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 mikron polikarbonat filtre </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemositometre </td><td> Hausser Bilimsel </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> 2 inkübatör CO </td><td> Çeşitli üreticiler, </td><td></td><td> Nemlendirilmiş, 35, 37 ve 40% 5 CO2 ° C </td></tr><tr><td> Flöresanlı mikroskop </td><td> Çeşitli üreticiler, </td><td></td><td> İdeal 63x veya 100x petrol hedefi ile ters, geniş alan </td></tr></tbody></table> HBSSc (Black ve ark 11&#39;e göre): <ul><li> 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solüsyonu (Hyclone katalog numarası SH30588) </li><li> 100 ul 1M MgCl2 (100 mM sonu) </li><li> 100 ml 1 M CaCI2 (100 mM sonu) </li><li> 2.0 mL 1M Hepes, pH 7.3 (20 mM sonu) </li><li> 84 mg NaHCO 3 (10 mM sonu) </li></ul>

a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants

Yaygın, zorunlu hücre içi protozoon parazit Toxoplasma gondii immün yetmezlikli hastalarda fırsatçı hastalığa yol açan ve konjenital enfeksiyon üzerine doğum kusurlarına neden olur. 1: litik replikasyon siklusu üç aşama ile karakterize edilir. çekirdekli bir konak hücre aktif invazyonu; 2. konak hücre içine replikasyon; 3. konakçı hücreye aktif çıkış. Acil tahliye mekanizma hala tam olarak moleküler düzeyde anlaşılır bir benzersiz, son derece düzenlenir süreci, giderek takdir ediliyor. Çıkış yatan sinyal yollarının yolları farklı yönlerini 1-5 üzerinde etkili farmakolojik ajanların kullanımı ile karakterize edilmiştir. Gibi çıkış birkaç bağımsız tetikler hücre içi Ca 2 sürümü üzerinde birleşmemiz tespit edilmiştir +, konak hücre işgali 6-8 için de kritik olan bir sinyal. Bu anlayış tanımladı yol açan bir aday gen yaklaşımı bilgilendirdification bitki, çıkış 9 içerisinde yer alan, kalsiyum bağımlı protein kinaz (CDPK) gibi. Buna ek olarak,, anlayış çıkış birkaç son buluşların (kimyasal) genetik yaklaşımlar kullanılarak 10-12 yapılmıştır. Toxoplasma artan genetik erişilebilirlik ile farmakolojik bilgi zenginliği birleştirmek için biz son konak hücrenin çıkış 13 bir kusur ile parazit mutantlar için zenginleşmesine izin veren bir ekran kuruldu. Rutin fenotipleri 16 haline 11,14,15 Toxoplasma biyolojisi çalışmada, yıllar boyunca kullanılan N-etil-N-nitrozoüre (TRK) veya etil metansülfonat (EMS) kullanılarak kimyasal mutajenez olmakla birlikte, sadece son yatan mutasyonlar genetik mapping of -18. Ayrıca, ısıya duyarlı mutantlar, gerekli süreçler disseke edilebilir ve altta yatan genleri doğrudan tespit. Bu mutantlar müsamahakar sıcaklığı (35 ° C) altında vahşi türü olarak davranır, ancak p başarısızbir sonucu olarak, söz konusu mutasyonu, kısıtlayıcı sıcaklığında (40 ° C) roliferate. Burada mutantlarının ısıya duyarlı bir çıkış fenotip 13 ile izole etmek için yeni bir fenotipik bir tarama yöntemi göstermektedir. Meydan çıkış ekranlar için yeniden işgali ve parazitlerin konak hücreleri için genel yapışkanlık hızlı karmaşık,-egressed olmayan parazitler, egressed ayrılması için. Daha önce kurulmuş bir çıkış ekran, ekstrasellüler parazitler 11 intrasellüler ayırmak için adımları biyotinilasyon hantal bir serisi dayanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda zayıf fenotipleri sonuçlanan koşullu mutantlar oluşturmak vermedi. Burada açıklanan yöntem,, parazitleri 19 konak hücre yapışmasını engelleyen glukanıdır bir rakip, dekstran sülfat (DS) de dahil olmak üzere parazitler egressing güçlü bağlılıklarının üstesinden gelir. Ayrıca, ekstraselüler parazitleri özellikle hücre içi parazit bırakır, pirolidin ditiyokarbamatın (PDTC), tarafından öldürüldü20 sağ salim. Bu nedenle, özellikle, indüklenen çıkış hatalarına parazit mutantlar izole etmek için yeni bir fenotipik ekran, genetik güç artık tamamen konak hücre çıkış yatan moleküler mekanizmalar çözülmeye dağıtmış olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants at JoVE.com

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Onun konakçı hücre gelen egresses. Protokoller, kimyasal parazitler mutagenize için sağlanan indüklenen çıkış defekti olan mutantlar için zenginleştirmek, ve klonlanmış mutantlar fenotip doğrulamak.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

12.9K Görüntüleme.  Boston College. İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir Toxoplasma Onun konakçı hücre gelen egresses. Protokoller, kimyasal parazitler mutagenize için sağlanan indüklenen çıkış defekti olan mutantlar için zenginleştirmek, ve klonlanmış mutantlar fenotip doğrulamak.

Video: A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Yüksek Saflaştırılmış Alınması Toxoplasma gondii Süreksiz Sezyum Klorür Gradient ookistleri

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...