Yazarlar, teknik adımlarla yardım için Nandini Nallappan ve Sharon Yeo&#39;ya teşekkür etmek istiyorlar. Çalışma, Lee Kong Chian Tıp Fakültesi, Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Singapur Sağlık Bakanlığı Ulusal Tıp Araştırma Konseyi (NMRC) tarafından LT&#39;ye (NMRC / CSA / CSA) verilen Kıdemli Klinisyen Bilim İnsanı Ödülü ile KGC&#39;ye bir Start-Up Grant tarafından finanse edildi. 045/2012) ve NMRC&#39;den bir hibe ile Ulusal Sağlık Yenilik Merkezi tarafından KGC ve LT&#39;ye (NHIC-12D-1409007) uygulanmıştır.

Bu çalışmada kullanılan tüm göz örnekleri, SingHealth Merkezileştirilmiş Kurumsal Değerlendirme Kurulu ve Singapur&#39;da Nanyang Teknoloji Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanan Singapur Ulusal Göz Merkezi&#39;ndeki Kuru Göz Kliniğinden toplanmıştır. NOT: Deneklere IC uygulanmadan önce enflamasyonun derecesini ve gözyaşı disfonksiyonunun ciddiyetini değerlendirmek için klinik testler yapılmıştır. Klinik testler , teşhis aleti, Schirmer testi 17 , Göz Hastalıklarında Standart Hasta Değerlendirme (SPEED) anketi 18 ve kornea ile değerlendirilen , invaziv olmayan gözyaşı parçalanma zamanı (NI-TBUT) 14 ve konjunktival kızarıklık (hiperemi) Boyama 19 . 1. Oküler Örneklerin IC ile Toplanması <ol><li> Klinik durumun belirlenmesinden sonra, anestezi uygulayın1 - 2 damla topikal anestezi, proparakain hidroklorür, üstün bulbar konjunktiva ve alt forniks uygulayarak katılımcının gözleri. Anesteziklerin sarılma hissi aşınması için 4-5 dakika bekleyin. </li><li> Nazal ve temporal bulbar konjunktiva örneklerini iki izlenim sitolojisi cihazı ile toplayın. NOT: İki gösterim örneğinin toplanması için bir aygıt kullanılır. Burada dört izlenim zarının toplanması için iki cihaz kullanıldı. <ol><li> Gösterge sitolojisi cihazını konjonktiva üzerine teğetsel olarak konumlandırın. Basma düğmesine yavaşça basın ve 2 - 3 saniye tutun. NOT: Cihaz membranla birlikte gelir. Düğmeye basıldıktan sonra basınç otomatik olarak serbest bırakılır. Basıncı tahliye etmek ve cihazı çıkarmak yalnızca birkaç saniye alır. </li></ol></li><li> Memeyi, 1 mL kültür ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpüne bırakın (Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) +% 10 fetal sığır serumu(FBS) +% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen Strep)) ile yapıldı. </li><li> 10 uL pipet ucu ile yaklaşık 1 dakika boyunca sürekli kazıyarak cihaz membranından hücreleri izole edin. NOT: Membranın yüzeyi pürüzlü hale geldiğinde sıyırma tamamlanmıştır. Her zarın hücre sayıları değişkendir (100-500 hücre / membran). Örnekleri 2-3 saat içinde işleyin. </li></ol> 2. Akım Sitometri ile İmmünofenotip Hücreleri <ol><li> Ortamı çıkarmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Akış sitometresi boyama tamponu (fosfat tamponlu salin (PBS) +% 0.05 sığır serum albümini (BSA)) ile hücre peletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> CD3 parlak menekşe (BV) 510 (UCHT1), CD4 allofikosiyanin-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 fitoeritrin (PE) -A, CD45RO PE-siyanin 7 (PE- Cy7) -A ve canlı / ölü hücre işareti 7-ADD) oda sıcaklığında 20-30 dakika boyuncaKaranlık. Üreticinin protokolüne göre stoktan doğrudan antikor kullanın. NOT: Antikor konsantrasyonu için, 2.5 uL CD3-BV510, 1.25 uL CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD ve 10 uL CCR7-PE kullanın. Farklı antikor konsantrasyonlarını titre etmek için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC&#39;ler) kullanın. Titrasyon için üreticinin protokolünde belirtilen antikor konsantrasyonunu alın ve önerilen konsantrasyonun yarısı ve dörtte birini kullanın. Diğer florokrom kanallarına dökülmesini önlemek için minimum antikor yoğunluğunu kullanın. Belirtilen antikor konsantrasyonlarında berrak sinyaller gözlemlendi. Tazminat, başlangıçta Williams ve ark.&#39;nda belirtilen protokole göre PBMC&#39;lerin test edilmesiyle gerçekleştirildi. Test için, PBMC&#39;ler burada kullanılan aynı antikor seti ile inkübe edildi ve tekli ve çoklu antikor lekelerini karşılaştırarak telafi edildi. </li><li> Kuluçka döneminden sonraOda sıcaklığında 5 dakika 450 xg&#39;de tüp içine 1 mL boyama tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjleyin. Hücreleri 200 uL boyama tamponuna tekrar süspanse edin. </li><li> Örnekleri bir akış sitometresi makinesinde çalıştırın. <ol><li> Verileri elde etmeden önce, üreticinin talimatlarına göre farklı günlerde veri edinimini normalleştirmek için sitometre kurulum ve izleme (CS &amp; T) boncukları ile akış sitometresi kanal gerilimlerini kalibre edin. <ol><li> Flow sitometri veri toplama yazılımını açın, &quot;Set up &amp; QC&quot; düğmesini tıklayın, doğru CS &amp; T boncuk parti numarasını seçin, boncukları yükleyin ve daha sonra &quot;Start&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol></li><li> Makineye numuneleri yüklemeden önce tüpü hafifçe vurarak hücreleri tekrar süspanse edin. Veri toplama yazılımını açın ve &quot;Önizleme&quot; yi tıklayın. Eşik oranı istikrarlı olduğunda, &quot;Acquire&quot; düğmesini tıklayın. Örnek düzeyini izleyin ve örnekler tükendiğinde &quot;Durdur&quot; u tıklayın. NOT: Örnek başına 10.000 olay elde edin. </li&gt; <li> 10.000 etkinlik edintikten sonra, çalışma sayfasında bir SSC-A ve FSC-A nokta çizelgesi oluşturun. <ol><li> &quot;Poligon Kapısı&quot; düğmesini tıklayın ve enkaz hariç tutmak için FSC-A değeri&gt; 5 x 10 4 olan tüm olayların üzerine bir kapı (bu P1) çizin. Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesine tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin ve &quot;P1&quot; i seçin. P1 nokta çizelgesinin x ekseni üzerinde FSC-A&#39;yı tıklayın, CD3-BV510 olarak değiştirin. CD3 + popülasyonunu seçmek için bir &#39;&#39; Poligon Kapısı &#39;&#39; çizin ve &#39;&#39; P2 &#39;&#39; olarak adlandırın. </li><li> Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesini tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin. P2 nokta grafiğinin x-ekseni üzerinde FSC-A&#39;yı tıklayın ve 7-AAD değerine değiştirin. 7-AAD nüfusu için bir &#39;&#39; Poligon Kapısı &#39;&#39; çizin ve &#39;&#39; P3 &#39;&#39; ü seçin. P3 burada CD3 +Canlı hücreler. </li><li> Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesini tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin. P3 nokta çizelgesinin y ekseni üzerinde x ekseninde CD3-BV510&#39;u, CD4-APCH7&#39;yi tıklayın. Çeyreğin üst ve alt taraflarında Dikdörtgen Kapılar çizin ve sırasıyla &#39;&#39; P4 &#39;&#39; ve &#39;&#39; P5 &#39;&#39; i seçin. P4 canlı CD3 + CD4 + ve P5 canlı CD3 + CD4 - T hücreleridir. </li><li> Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesini tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin. CD45RO PE-Cy7&#39;i x-ekseni ve CCR7-PE&#39;yi hem P4 hem de P5 parsellerinin y ekseni üzerine tıklayın. Bu nokta çizelgesinde &#39;&#39; Dört Kapı &#39;&#39; çizin. NOT: Burada sol üst taraf, sağ üst sağ, sol sağ ve sol alt kadranlar naif, merkezi bellek (T CM ), eFfector bellek (T EM ), terminal diferansiye efektör bellek (T EPRA) T hücreleri. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+impression+cytology.">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li><li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+conjunctival+biopsy.">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li><li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+dry+eye.">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).</li><li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease.">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li><li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders.">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection.">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li><li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology.">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li><li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+EyePRIM+Device+for+Conjunctival+impression+for+Flow+Cytometry.">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li><li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors:+review+article.">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li><li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface:+a+review.">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li><li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+(IC+score)+in+patients+with+dry+eye+syndrome.">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li><li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface.">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid.">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li><li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph.">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li><li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+ocular+bulbar+redness:+a+comparison+of+methods.">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li><li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ocular+Redness+Index:+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection.">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li><li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects.">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li><li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine.">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li><li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+tear+syndrome:+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations.">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li><li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8++T+cells.">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li><li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease.">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312 (2017).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta++T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4++T+cells+increases.">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li><li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis.">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlar beyan etmiyor.

Bu, kazıma, sürünme, pipetleme veya emici filtre kağıdı 1 , 2 gibi geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında nispeten hızlı bağışıklık profillemesi için ayakta tedavi kliniklerinde kullanılabilen, kolay, hızlı ve daha az invaziv bir tekniktir. Bu tekniğin bir varyantı araştırma ayarları 22&#39;de zaten kullanılmaktadır . Önerilen yöntemin ileride uygulanması, göz hastalıkları, özellikle immünofotasyon yapılması gereken klinik araştırmalardaki hasta sınıflandırması içindir. Bu teknikle büyük bir sorun, izlenim toplama ve sıyırma işleminden sonra alınan nispeten az bağışıklık hücresidir. Kişi başına dört izlenimden elde edilen CD3 + T hücrelerinin toplam sayısı ~ 500 - 1,000 hücre arasında değişiyordu. Oküler numuneler, daha fazla hücre kaybını önlemek için akış sitometrisi analizinden önce en az sayıda yıkandıs. Protokol içerisinde kalan kritik adımlar ve zorluklar, göz numunelerinin etkin bir şekilde toplanması ve daha yüksek hücre sayıları elde etmek için zarın uygun şekilde kazınmasıdır. Bununla birlikte, bu kısıtlamanın herhangi bir bağışıklık fenotipine yönelmesi muhtemel değildir. Hücrelerin verimini en üst düzeye çıkarmak için burada yapılan sorun giderme, antikorların inkübasyonundan önce ve öncesinde yıkama adımlarının sayısını azaltmaktır. IC&#39;yi kullanmak için başka sınırlamalar da vardır. Steven Johnson sendromunda olduğu gibi ciddi keratinize veya fibroz oküler yüzeye sahip hastalarda, hücresel verim bu çalışmadaki verimden daha düşük olabilir. Örnekler aynı gün içinde analiz edilmek yerine saklanırsa bağışıklık hücrelerinin oranı değişebilir. Bazı hücre tiplerinin diğerlerine oranla depolamaya karşı daha dirençli olup olmadığını öngörmek zordur. Önceki çalışmalar, konjunktiva epitel hücrelerinde 23 yüksek HLA-DR ekspresyon seviyeleri bildirmiştir, bu nedenle inter-HLA-DR ve spesifik bağışıklık hücresi seviyeleri arasındaki korelasyonun değerlendirilmesi yönündeki düşünceler. Bağışıklık hücreleri aynı zamanda kemokinlerin ekspresyon seviyesiyle ilişkili olabilir. Bu konular gelecekteki çalışmalarla ele alınmalıdır.

Etkileyici sitoloji (IC) ilk kez 1977&#39;de Thatcher ve arkadaşları tarafından gerçekleştirildi . O sırada kazıma, sürünme veya pipetleme gibi diğer teknikler yerine konjonktival hücreleri toplamak için bir plastik izlenim diski kullandılar. Mevcut IC tekniği bulbarı ve palpebral konjunktivayı izole etmek ve konjunktival hücrelerin en yüzeysel katmanını toplamak için bir emici filtre kağıdı 2 kullanmaktadır. Farklılaşmanın nihai aşamasına ulaşan bu hücreler sürekli gözyaşı dökülür 3 . IC örneklerinde üç ana hücre popülasyonu bulunur: epitel hücreleri 4 , goblet hücreleri 3 , 5 ve mukozal ilişkili lenfoid doku, yani epitel ile ilişkili efektör T hücreleri veya dendritik hücreler 6 . IC sam&#39;taki oküler yüzey hücreleriMikroskopi, bağışıklık lekelenmesi ve ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile analiz edilebilir 7 . Akım sitometri, son zamanlarda IC membran 8 kazınarak toplanan bağışıklık hücrelerini analiz etmek için kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, IC 6 , 9 , keratokonjonktivitis sikka, vitamin A eksikliği, klinik antipsikoid, atopik hastalık, üstün limbik keratokonjonktivit, vernal keratokonjonktivit ve epitelyal skuamöz metaplazi de dahil olmak üzere birçok oküler yüzey hastalıklarını değerlendirmek için kullanılmıştır. IC, göz teması lenslerinin etkisini değerlendirmek, oküler yüzey mikroplarını tespit etmek ve longitudinal çalışmalarında terapötik etkinlik ve terapötik girişimlerin hoşgörüsünü test etmek için kullanılmıştır. 10 , 11 , 12 . Tıbbi cihaz (EyePrim) bir çeşit poliAkış sitometrisi (OSIC-akışı) ile oküler impresyon sitolojisi tekniği için daha önce onaylanmış olan ve hastalığın progresyonunu ve tedaviye cevabı izlemek için uzunlamasına örneklemeyi kullanma fırsatlarını açan, 0.2 μm membran olan, eter-sülfon (PES) 0.2-μm membran Mukoza pemfigoidinde ilerleyici konjonktiva fibrozu için varsayılan hastalık markörleri olarak tanımlanan intraepitelyal lökositlerin analizi) 13 . Erken araştırmacılar, manuel izlenim gerektiren otoklavlanmış PES filtreleri kullandı. Sonuç olarak, verim değişkendir ve kullanıcı bağımlıdır. Bu tıbbi cihazın avantajı kullanım kolaylığı, standardize edilmiş basınç (Pa veya N / m 2 ) ve tekrarlanabilirlik, tekrarlanabilirlik ve tutarlı hücresel iyileşmeyi mümkün kılmaktadır. Bu teknik, cerrahi dışı, kolay uygulanabilen ve hızlı olduğu için, ayakta tedavi gören bir klinikte faydalıdır. Bu, 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH) direktifine göre Sınıf I (steril) tıbbi bir cihazdır. Sadece gerektirirGöz yüzeyinin bütünlüğünü sağlayan prosedür sırasında topikal anestezi uygulanması. IC&#39;den sonra, hücreler akış sitometrisi için derhal işlenebilir. Ayrıca, oftalmoloji teknisyenleri ve hemşirelerinin göz yüzeyini örneklemek üzere eğitilmesi mümkündür. IC&#39;nin diğer tekniklerden daha iyi olmasına rağmen, birçok zorluk bulunmaktadır. Örneğin, örnekleme alanından ve bulbar konjunktivasındaki bölgesel farklardan dolayı IC&#39;nin konumuna bağlı olarak değişiklik olabilir. Bir başka değişim kaynağı, IC sırasında farklı basınç miktarlarının uygulanmasından kaynaklanmaktadır. Diğer metodolojik konular hücre işlemesinin standartlaştırılmasını içerir: sabitleme süresi ve yöntemi ile örnek alınan malzemenin kararlılığını etkileyebilecek olası depolama şartları. Bu tekniğin genel amacı, oküler izlenim örneklerinin izole edilmesi için bir yöntem geliştirmektir.T kullanımı kolaydır, invaziv değildir ve klinik örneklerin immünolojik karakterizasyonuna uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD3 BV510</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">563109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD4 APCH7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">641398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD45RO PECy7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">337168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">7-AAD solution</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">555816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CCR7 PE</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">552176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Pippetes</td>
			<td style="width:300px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Local Anaesthesia</td>
			<td style="width:300px;">Alcaine</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Equipments</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Keratograph 5M</td>
			<td>Oculus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Slit lamp BioMicroscope</td>
			<td>Haag Streit</td>
			<td>BM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">EyePrim</td>
			<td>Opia Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACS Verse</td>
			<td style="width:300px;">BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Softwares</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">GraphPad 6.0</td>
			<td style="width:300px;">Prism</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACSVerse analysis software</td>
			<td style="width:300px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

Geleneksel olarak oküler yüzey sitolojisi, spatula teknolojisi ve fırça teknolojisi gibi teknikler ile incelenir. Bu tekniklerle ilgili problem, göz yüzeyinde travmatik lezyonlara neden olabilir; bunlar skarlasmaya, gözkapağı deformitesine, limbal kök hücre yetersizliğine kadar ilerleyebilir ve bazı durumlarda hastaya büyük rahatsızlık verirler. Bu klinik problemleri önlemek için kuru göz hastalığının ve daha sonra neoplazinin, atopik hastalığın, vernal keratokonjonktivitin ve keratokonjonktivit sicca&#39;nın teşhisinde izlenim sitolojisi (IC) geliştirildi. Tipik olarak, klinisyenler elle filtre kağıdını istenilen şekillere kesip oküler yüzeyine uygularlar. Burada, piyasada satılan bir tıbbi cihaz kullanılarak IC&#39;yi nasıl yürütüleceğini anlatacağız. Bu teknik burada flow sitometri ile imünofenotiplendirme ile izah edilmektedir. Bu teknik, daha az manuel elleçleme gerektirir ve göz yüzeyine daha az zarar verir.

IC bu klinik cihazla oküler yüzeyini sağlam tutarken oküler yüzey immün hücrelerini izole etmemize izin veriyordu. Şekil 1 , IC&#39;nin nasıl yapıldığını açıklamaktadır. Numunelerin toplandığı yerden gözün farklı yerleri işaretlenmiştir. Şekil 2 , 10 sağlıklı kontrolten toplanan akış sitometrisinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Geçiş için canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için SSC ve 7-AAD kullanın. 7-AAD - hücreler canlı hücreler olarak tanımlanır. Bu canlı hücreler ayrıca CD3 + ve CD4 + markörleri ile karakterize edilir. Dahası, CD4 + ve CD4 - popülasyonları, her biri, Cyc7 ve CD45RO markörleri ile Naif, T EM , T CM ve T EPRA olarak da karakterize edildi. CD3 + T hücreleri arasında efektör bellek T hücreleri insan oküler yüzeyinde baskındır. Daha önceki eSonuç olarak, CD8 + hafıza hücrelerinin konjonktival epitel T hücrelerindeki sağlıklı bireyler arasındaki en büyük popülasyon olduğu gösterilmiştir20. Şekil 3 , CD4 + ve CD8 + efektör bellek T hücrelerinin (T EM ve T EPRA ) incelenen 10 sağlıklı kontrol grubunda insan oküler yüzeyinin ana alt kümesidir. Şekilde belirtilen her bir popülasyon, işaretleyici fenotip ve isimlerle (Naïve, T CM , T EM , T EPRA ) bildirilir. Kırmızı renkli rakamlar nüfus yüzdesini ifade etmektedir. Bu şekildeki veriler ortalama ± SEM <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Şekil 1: Gösterim Sitolojisi Cihazı Tarafından Oküler Yüzeyden IC Örneklerinin Toplanması. Numuneler temporal ampulden toplandıAr bölgesi gösterilmiştir. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Şekil 2: Akış Sitometrisini Kullanan Nokta Plot Grafiği. Canlı 7-AAD hücreleri seçildi. CD3 + hücreleri ilk kez kapatıldı ve daha sonra bu popülasyon CD4 + ve CD4 - alt gruplarına kapatıldı. Naif (CCR7 + CD45RO - ), santral bellek (CCR7 + CD45RO + ) ve efektör belleğin (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) altkümelerinin oranları CCR7 ve CD45RO belirteçleri yardımıyla belirlendi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FŞekil 3: Sağlıklı İnsan Oküler Yüzeyinin CD4 + ve CD8 + T Hücrelerinde Bağışıklık Hücresi Alt Tipleri. Sağlıklı insan kontrollerinde konjonktival CD4 + ve CD8 + naif, merkezi bellek (T CM ) ve efektör bellek (T EM ve T EPRA ) altkümelerinin dağılımı; Her bir veri noktası, gösterilen ayrı bir bireysel ortalama ± SEM&#39;i temsil eder. Nüfusun yüzdesi, nüfusların her birinin altına kırmızı olarak işaretlenmiştir. Nüfusun toplam yüzdesi% 98&#39;dir, çünkü CD4 + T EPRA popülasyonu bahsedilen dağılım çizgisine dahil edilmemiştir (Bose ve diğerleri 21&#39;den modifiye edilmiştir). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva at JoVE.com

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Görüntüleme.  Nanyang Technological University.  Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir. 

Video: A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Non-invaziv Endotrakeal Entübasyon Erişkin Sıçanlarda Komple Timektomi

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...