Name: a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva at JoVE.com

Yazarlar, teknik adımlarla yardım için Nandini Nallappan ve Sharon Yeo&#39;ya teşekkür etmek istiyorlar. Çalışma, Lee Kong Chian Tıp Fakültesi, Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Singapur Sağlık Bakanlığı Ulusal Tıp Araştırma Konseyi (NMRC) tarafından LT&#39;ye (NMRC / CSA / CSA) verilen Kıdemli Klinisyen Bilim İnsanı Ödülü ile KGC&#39;ye bir Start-Up Grant tarafından finanse edildi. 045/2012) ve NMRC&#39;den bir hibe ile Ulusal Sağlık Yenilik Merkezi tarafından KGC ve LT&#39;ye (NHIC-12D-1409007) uygulanmıştır.

Bu çalışmada kullanılan tüm göz örnekleri, SingHealth Merkezileştirilmiş Kurumsal Değerlendirme Kurulu ve Singapur&#39;da Nanyang Teknoloji Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanan Singapur Ulusal Göz Merkezi&#39;ndeki Kuru Göz Kliniğinden toplanmıştır. NOT: Deneklere IC uygulanmadan önce enflamasyonun derecesini ve gözyaşı disfonksiyonunun ciddiyetini değerlendirmek için klinik testler yapılmıştır. Klinik testler , teşhis aleti, Schirmer testi 17 , Göz Hastalıklarında Standart Hasta Değerlendirme (SPEED) anketi 18 ve kornea ile değerlendirilen , invaziv olmayan gözyaşı parçalanma zamanı (NI-TBUT) 14 ve konjunktival kızarıklık (hiperemi) Boyama 19 . 1. Oküler Örneklerin IC ile Toplanması <ol><li> Klinik durumun belirlenmesinden sonra, anestezi uygulayın1 - 2 damla topikal anestezi, proparakain hidroklorür, üstün bulbar konjunktiva ve alt forniks uygulayarak katılımcının gözleri. Anesteziklerin sarılma hissi aşınması için 4-5 dakika bekleyin. </li><li> Nazal ve temporal bulbar konjunktiva örneklerini iki izlenim sitolojisi cihazı ile toplayın. NOT: İki gösterim örneğinin toplanması için bir aygıt kullanılır. Burada dört izlenim zarının toplanması için iki cihaz kullanıldı. <ol><li> Gösterge sitolojisi cihazını konjonktiva üzerine teğetsel olarak konumlandırın. Basma düğmesine yavaşça basın ve 2 - 3 saniye tutun. NOT: Cihaz membranla birlikte gelir. Düğmeye basıldıktan sonra basınç otomatik olarak serbest bırakılır. Basıncı tahliye etmek ve cihazı çıkarmak yalnızca birkaç saniye alır. </li></ol></li><li> Memeyi, 1 mL kültür ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpüne bırakın (Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) +% 10 fetal sığır serumu(FBS) +% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen Strep)) ile yapıldı. </li><li> 10 uL pipet ucu ile yaklaşık 1 dakika boyunca sürekli kazıyarak cihaz membranından hücreleri izole edin. NOT: Membranın yüzeyi pürüzlü hale geldiğinde sıyırma tamamlanmıştır. Her zarın hücre sayıları değişkendir (100-500 hücre / membran). Örnekleri 2-3 saat içinde işleyin. </li></ol> 2. Akım Sitometri ile İmmünofenotip Hücreleri <ol><li> Ortamı çıkarmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Akış sitometresi boyama tamponu (fosfat tamponlu salin (PBS) +% 0.05 sığır serum albümini (BSA)) ile hücre peletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> CD3 parlak menekşe (BV) 510 (UCHT1), CD4 allofikosiyanin-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 fitoeritrin (PE) -A, CD45RO PE-siyanin 7 (PE- Cy7) -A ve canlı / ölü hücre işareti 7-ADD) oda sıcaklığında 20-30 dakika boyuncaKaranlık. Üreticinin protokolüne göre stoktan doğrudan antikor kullanın. NOT: Antikor konsantrasyonu için, 2.5 uL CD3-BV510, 1.25 uL CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD ve 10 uL CCR7-PE kullanın. Farklı antikor konsantrasyonlarını titre etmek için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC&#39;ler) kullanın. Titrasyon için üreticinin protokolünde belirtilen antikor konsantrasyonunu alın ve önerilen konsantrasyonun yarısı ve dörtte birini kullanın. Diğer florokrom kanallarına dökülmesini önlemek için minimum antikor yoğunluğunu kullanın. Belirtilen antikor konsantrasyonlarında berrak sinyaller gözlemlendi. Tazminat, başlangıçta Williams ve ark.&#39;nda belirtilen protokole göre PBMC&#39;lerin test edilmesiyle gerçekleştirildi. Test için, PBMC&#39;ler burada kullanılan aynı antikor seti ile inkübe edildi ve tekli ve çoklu antikor lekelerini karşılaştırarak telafi edildi. </li><li> Kuluçka döneminden sonraOda sıcaklığında 5 dakika 450 xg&#39;de tüp içine 1 mL boyama tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjleyin. Hücreleri 200 uL boyama tamponuna tekrar süspanse edin. </li><li> Örnekleri bir akış sitometresi makinesinde çalıştırın. <ol><li> Verileri elde etmeden önce, üreticinin talimatlarına göre farklı günlerde veri edinimini normalleştirmek için sitometre kurulum ve izleme (CS &amp; T) boncukları ile akış sitometresi kanal gerilimlerini kalibre edin. <ol><li> Flow sitometri veri toplama yazılımını açın, &quot;Set up &amp; QC&quot; düğmesini tıklayın, doğru CS &amp; T boncuk parti numarasını seçin, boncukları yükleyin ve daha sonra &quot;Start&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol></li><li> Makineye numuneleri yüklemeden önce tüpü hafifçe vurarak hücreleri tekrar süspanse edin. Veri toplama yazılımını açın ve &quot;Önizleme&quot; yi tıklayın. Eşik oranı istikrarlı olduğunda, &quot;Acquire&quot; düğmesini tıklayın. Örnek düzeyini izleyin ve örnekler tükendiğinde &quot;Durdur&quot; u tıklayın. NOT: Örnek başına 10.000 olay elde edin. </li&gt; <li> 10.000 etkinlik edintikten sonra, çalışma sayfasında bir SSC-A ve FSC-A nokta çizelgesi oluşturun. <ol><li> &quot;Poligon Kapısı&quot; düğmesini tıklayın ve enkaz hariç tutmak için FSC-A değeri&gt; 5 x 10 4 olan tüm olayların üzerine bir kapı (bu P1) çizin. Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesine tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin ve &quot;P1&quot; i seçin. P1 nokta çizelgesinin x ekseni üzerinde FSC-A&#39;yı tıklayın, CD3-BV510 olarak değiştirin. CD3 + popülasyonunu seçmek için bir &#39;&#39; Poligon Kapısı &#39;&#39; çizin ve &#39;&#39; P2 &#39;&#39; olarak adlandırın. </li><li> Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesini tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin. P2 nokta grafiğinin x-ekseni üzerinde FSC-A&#39;yı tıklayın ve 7-AAD değerine değiştirin. 7-AAD nüfusu için bir &#39;&#39; Poligon Kapısı &#39;&#39; çizin ve &#39;&#39; P3 &#39;&#39; ü seçin. P3 burada CD3 +Canlı hücreler. </li><li> Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesini tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin. P3 nokta çizelgesinin y ekseni üzerinde x ekseninde CD3-BV510&#39;u, CD4-APCH7&#39;yi tıklayın. Çeyreğin üst ve alt taraflarında Dikdörtgen Kapılar çizin ve sırasıyla &#39;&#39; P4 &#39;&#39; ve &#39;&#39; P5 &#39;&#39; i seçin. P4 canlı CD3 + CD4 + ve P5 canlı CD3 + CD4 - T hücreleridir. </li><li> Yeni bir nokta çizelgesi oluşturmak için &quot;Nokta arsa oluştur&quot; düğmesini tıklayın, nokta lekesini sağ tıklatın, &quot;Plot Editörü&quot; penceresini açmak için &quot;Özellikler&quot; i seçin. CD45RO PE-Cy7&#39;i x-ekseni ve CCR7-PE&#39;yi hem P4 hem de P5 parsellerinin y ekseni üzerine tıklayın. Bu nokta çizelgesinde &#39;&#39; Dört Kapı &#39;&#39; çizin. NOT: Burada sol üst taraf, sağ üst sağ, sol sağ ve sol alt kadranlar naif, merkezi bellek (T CM ), eFfector bellek (T EM ), terminal diferansiye efektör bellek (T EPRA) T hücreleri. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+impression+cytology.">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li><li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+conjunctival+biopsy.">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li><li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+dry+eye.">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).</li><li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease.">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li><li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders.">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection.">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li><li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology.">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li><li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+EyePRIM+Device+for+Conjunctival+impression+for+Flow+Cytometry.">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li><li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors:+review+article.">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li><li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface:+a+review.">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li><li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+(IC+score)+in+patients+with+dry+eye+syndrome.">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li><li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface.">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid.">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li><li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph.">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li><li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+ocular+bulbar+redness:+a+comparison+of+methods.">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li><li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ocular+Redness+Index:+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection.">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li><li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects.">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li><li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine.">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li><li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+tear+syndrome:+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations.">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li><li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8++T+cells.">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li><li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease.">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312 (2017).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta++T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4++T+cells+increases.">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li><li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis.">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlar beyan etmiyor.

Bu, kazıma, sürünme, pipetleme veya emici filtre kağıdı 1 , 2 gibi geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında nispeten hızlı bağışıklık profillemesi için ayakta tedavi kliniklerinde kullanılabilen, kolay, hızlı ve daha az invaziv bir tekniktir. Bu tekniğin bir varyantı araştırma ayarları 22&#39;de zaten kullanılmaktadır . Önerilen yöntemin ileride uygulanması, göz hastalıkları, özellikle immünofotasyon yapılması gereken klinik araştırmalardaki hasta sınıflandırması içindir. Bu teknikle büyük bir sorun, izlenim toplama ve sıyırma işleminden sonra alınan nispeten az bağışıklık hücresidir. Kişi başına dört izlenimden elde edilen CD3 + T hücrelerinin toplam sayısı ~ 500 - 1,000 hücre arasında değişiyordu. Oküler numuneler, daha fazla hücre kaybını önlemek için akış sitometrisi analizinden önce en az sayıda yıkandıs. Protokol içerisinde kalan kritik adımlar ve zorluklar, göz numunelerinin etkin bir şekilde toplanması ve daha yüksek hücre sayıları elde etmek için zarın uygun şekilde kazınmasıdır. Bununla birlikte, bu kısıtlamanın herhangi bir bağışıklık fenotipine yönelmesi muhtemel değildir. Hücrelerin verimini en üst düzeye çıkarmak için burada yapılan sorun giderme, antikorların inkübasyonundan önce ve öncesinde yıkama adımlarının sayısını azaltmaktır. IC&#39;yi kullanmak için başka sınırlamalar da vardır. Steven Johnson sendromunda olduğu gibi ciddi keratinize veya fibroz oküler yüzeye sahip hastalarda, hücresel verim bu çalışmadaki verimden daha düşük olabilir. Örnekler aynı gün içinde analiz edilmek yerine saklanırsa bağışıklık hücrelerinin oranı değişebilir. Bazı hücre tiplerinin diğerlerine oranla depolamaya karşı daha dirençli olup olmadığını öngörmek zordur. Önceki çalışmalar, konjunktiva epitel hücrelerinde 23 yüksek HLA-DR ekspresyon seviyeleri bildirmiştir, bu nedenle inter-HLA-DR ve spesifik bağışıklık hücresi seviyeleri arasındaki korelasyonun değerlendirilmesi yönündeki düşünceler. Bağışıklık hücreleri aynı zamanda kemokinlerin ekspresyon seviyesiyle ilişkili olabilir. Bu konular gelecekteki çalışmalarla ele alınmalıdır.

Etkileyici sitoloji (IC) ilk kez 1977&#39;de Thatcher ve arkadaşları tarafından gerçekleştirildi . O sırada kazıma, sürünme veya pipetleme gibi diğer teknikler yerine konjonktival hücreleri toplamak için bir plastik izlenim diski kullandılar. Mevcut IC tekniği bulbarı ve palpebral konjunktivayı izole etmek ve konjunktival hücrelerin en yüzeysel katmanını toplamak için bir emici filtre kağıdı 2 kullanmaktadır. Farklılaşmanın nihai aşamasına ulaşan bu hücreler sürekli gözyaşı dökülür 3 . IC örneklerinde üç ana hücre popülasyonu bulunur: epitel hücreleri 4 , goblet hücreleri 3 , 5 ve mukozal ilişkili lenfoid doku, yani epitel ile ilişkili efektör T hücreleri veya dendritik hücreler 6 . IC sam&#39;taki oküler yüzey hücreleriMikroskopi, bağışıklık lekelenmesi ve ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile analiz edilebilir 7 . Akım sitometri, son zamanlarda IC membran 8 kazınarak toplanan bağışıklık hücrelerini analiz etmek için kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, IC 6 , 9 , keratokonjonktivitis sikka, vitamin A eksikliği, klinik antipsikoid, atopik hastalık, üstün limbik keratokonjonktivit, vernal keratokonjonktivit ve epitelyal skuamöz metaplazi de dahil olmak üzere birçok oküler yüzey hastalıklarını değerlendirmek için kullanılmıştır. IC, göz teması lenslerinin etkisini değerlendirmek, oküler yüzey mikroplarını tespit etmek ve longitudinal çalışmalarında terapötik etkinlik ve terapötik girişimlerin hoşgörüsünü test etmek için kullanılmıştır. 10 , 11 , 12 . Tıbbi cihaz (EyePrim) bir çeşit poliAkış sitometrisi (OSIC-akışı) ile oküler impresyon sitolojisi tekniği için daha önce onaylanmış olan ve hastalığın progresyonunu ve tedaviye cevabı izlemek için uzunlamasına örneklemeyi kullanma fırsatlarını açan, 0.2 μm membran olan, eter-sülfon (PES) 0.2-μm membran Mukoza pemfigoidinde ilerleyici konjonktiva fibrozu için varsayılan hastalık markörleri olarak tanımlanan intraepitelyal lökositlerin analizi) 13 . Erken araştırmacılar, manuel izlenim gerektiren otoklavlanmış PES filtreleri kullandı. Sonuç olarak, verim değişkendir ve kullanıcı bağımlıdır. Bu tıbbi cihazın avantajı kullanım kolaylığı, standardize edilmiş basınç (Pa veya N / m 2 ) ve tekrarlanabilirlik, tekrarlanabilirlik ve tutarlı hücresel iyileşmeyi mümkün kılmaktadır. Bu teknik, cerrahi dışı, kolay uygulanabilen ve hızlı olduğu için, ayakta tedavi gören bir klinikte faydalıdır. Bu, 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH) direktifine göre Sınıf I (steril) tıbbi bir cihazdır. Sadece gerektirirGöz yüzeyinin bütünlüğünü sağlayan prosedür sırasında topikal anestezi uygulanması. IC&#39;den sonra, hücreler akış sitometrisi için derhal işlenebilir. Ayrıca, oftalmoloji teknisyenleri ve hemşirelerinin göz yüzeyini örneklemek üzere eğitilmesi mümkündür. IC&#39;nin diğer tekniklerden daha iyi olmasına rağmen, birçok zorluk bulunmaktadır. Örneğin, örnekleme alanından ve bulbar konjunktivasındaki bölgesel farklardan dolayı IC&#39;nin konumuna bağlı olarak değişiklik olabilir. Bir başka değişim kaynağı, IC sırasında farklı basınç miktarlarının uygulanmasından kaynaklanmaktadır. Diğer metodolojik konular hücre işlemesinin standartlaştırılmasını içerir: sabitleme süresi ve yöntemi ile örnek alınan malzemenin kararlılığını etkileyebilecek olası depolama şartları. Bu tekniğin genel amacı, oküler izlenim örneklerinin izole edilmesi için bir yöntem geliştirmektir.T kullanımı kolaydır, invaziv değildir ve klinik örneklerin immünolojik karakterizasyonuna uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Local Anaesthesia</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium solution</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Slit lamp BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse analysis software</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

Geleneksel olarak oküler yüzey sitolojisi, spatula teknolojisi ve fırça teknolojisi gibi teknikler ile incelenir. Bu tekniklerle ilgili problem, göz yüzeyinde travmatik lezyonlara neden olabilir; bunlar skarlasmaya, gözkapağı deformitesine, limbal kök hücre yetersizliğine kadar ilerleyebilir ve bazı durumlarda hastaya büyük rahatsızlık verirler. Bu klinik problemleri önlemek için kuru göz hastalığının ve daha sonra neoplazinin, atopik hastalığın, vernal keratokonjonktivitin ve keratokonjonktivit sicca&#39;nın teşhisinde izlenim sitolojisi (IC) geliştirildi. Tipik olarak, klinisyenler elle filtre kağıdını istenilen şekillere kesip oküler yüzeyine uygularlar. Burada, piyasada satılan bir tıbbi cihaz kullanılarak IC&#39;yi nasıl yürütüleceğini anlatacağız. Bu teknik burada flow sitometri ile imünofenotiplendirme ile izah edilmektedir. Bu teknik, daha az manuel elleçleme gerektirir ve göz yüzeyine daha az zarar verir.

IC bu klinik cihazla oküler yüzeyini sağlam tutarken oküler yüzey immün hücrelerini izole etmemize izin veriyordu. Şekil 1 , IC&#39;nin nasıl yapıldığını açıklamaktadır. Numunelerin toplandığı yerden gözün farklı yerleri işaretlenmiştir. Şekil 2 , 10 sağlıklı kontrolten toplanan akış sitometrisinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Geçiş için canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için SSC ve 7-AAD kullanın. 7-AAD - hücreler canlı hücreler olarak tanımlanır. Bu canlı hücreler ayrıca CD3 + ve CD4 + markörleri ile karakterize edilir. Dahası, CD4 + ve CD4 - popülasyonları, her biri, Cyc7 ve CD45RO markörleri ile Naif, T EM , T CM ve T EPRA olarak da karakterize edildi. CD3 + T hücreleri arasında efektör bellek T hücreleri insan oküler yüzeyinde baskındır. Daha önceki eSonuç olarak, CD8 + hafıza hücrelerinin konjonktival epitel T hücrelerindeki sağlıklı bireyler arasındaki en büyük popülasyon olduğu gösterilmiştir20. Şekil 3 , CD4 + ve CD8 + efektör bellek T hücrelerinin (T EM ve T EPRA ) incelenen 10 sağlıklı kontrol grubunda insan oküler yüzeyinin ana alt kümesidir. Şekilde belirtilen her bir popülasyon, işaretleyici fenotip ve isimlerle (Naïve, T CM , T EM , T EPRA ) bildirilir. Kırmızı renkli rakamlar nüfus yüzdesini ifade etmektedir. Bu şekildeki veriler ortalama ± SEM <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Şekil 1: Gösterim Sitolojisi Cihazı Tarafından Oküler Yüzeyden IC Örneklerinin Toplanması. Numuneler temporal ampulden toplandıAr bölgesi gösterilmiştir. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Şekil 2: Akış Sitometrisini Kullanan Nokta Plot Grafiği. Canlı 7-AAD hücreleri seçildi. CD3 + hücreleri ilk kez kapatıldı ve daha sonra bu popülasyon CD4 + ve CD4 - alt gruplarına kapatıldı. Naif (CCR7 + CD45RO - ), santral bellek (CCR7 + CD45RO + ) ve efektör belleğin (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) altkümelerinin oranları CCR7 ve CD45RO belirteçleri yardımıyla belirlendi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FŞekil 3: Sağlıklı İnsan Oküler Yüzeyinin CD4 + ve CD8 + T Hücrelerinde Bağışıklık Hücresi Alt Tipleri. Sağlıklı insan kontrollerinde konjonktival CD4 + ve CD8 + naif, merkezi bellek (T CM ) ve efektör bellek (T EM ve T EPRA ) altkümelerinin dağılımı; Her bir veri noktası, gösterilen ayrı bir bireysel ortalama ± SEM&#39;i temsil eder. Nüfusun yüzdesi, nüfusların her birinin altına kırmızı olarak işaretlenmiştir. Nüfusun toplam yüzdesi% 98&#39;dir, çünkü CD4 + T EPRA popülasyonu bahsedilen dağılım çizgisine dahil edilmemiştir (Bose ve diğerleri 21&#39;den modifiye edilmiştir). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva at JoVE.com

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Görüntüleme.  Nanyang Technological University.  Maruz kalan normal oküler yüzey kornea ve konjonktivadan oluşur. Konjunktiva içerisinde epitel hücreleri, goblet hücreleri ve immün hücreler bulunur. Burada, non-invaziv bir izlenim sitolojisi yöntemi, konjonktivadaki bağışıklık hücrelerini analiz etmek için bir impresyon sitolojisi cihazı ve akış sitometrisi kullanılarak tarif edilmiştir. 

Video: A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Biyomühendislik

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

Kapak Silecek Area izlenim Sitoloji

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

Tıp

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Farelerde Konjonktival Kommenal İzolasyon ve Tanımlama

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular surface gland network. Meibomian glands (MG) secrete lipids that create a covering layer that prevents the evaporation of the aqueous part of the tear film. Neutrophils and extracellular DNA traps populate MG and the ocular surface in a mouse model of allergic eye disease. Aggregated neutrophil extracellular traps (aggNETs) formulate a mesh-like matrix composed of extracellular chromatin that occludes MG outlets and conditions MG dysfunction. Here, a method for inducing ocular surface inflammation and MG dysfunction is presented. The procedures for collecting organs related to the ocular surface, such as the cornea, conjunctiva, and eyelids, are described in detail. Using established techniques for processing each organ, the major morphological and histopathological features of MG dysfunction are also shown. Ocular exudates offer the opportunity to assess the inflammatory state of the ocular surface. These procedures enable the investigation of topical and systemic anti-inflammatory interventions at the preclinical level.

Ocular surface inflammation harms the ocular surface tissues and compromises vital functions of the eye. The present protocol describes a method to induce ocular inflammation and collect compromised tissues in a mouse model of Meibomian gland dysfunction (MGD).

Oküler Yüzey Enflamasyonunun İndüklenmesi ve Tutulan Dokuların Toplanması

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular ...

İnsan Limbal Niş Hücrelerini İzole Etmek, Kültürlemek ve Tanımlamak için Bir Protokol

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used for LNCs isolation. The tissue was divided into 12 pieces under aseptic conditions and digested for 18 h at 37 &#176;C in the cell culture incubator using collagenase A to obtain cell clusters with LNCs and limbal&#160;epithelial progenitor cells. The cell clusters were further digested for 15 min at 37 &#176;C using 0.25% trypsin-EDTA to obtain single cells and then cultured in modified embryonic stem cell medium (MESCM) on a plastic surface coated with 5% Matrigel. Cells were passaged upon 70% confluence, and LNCs were identified using immunofluorescence, real-time quantitative PCR (qPCR), and flow cytometry. Primary LNCs were isolated and passaged more than 12 times. The proliferation activity of LNCs from P4 to P6 was the highest. LNCs expressed higher stem cell markers than BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, and PDGFR&#946;). Furthermore, results showed that P4 LNCs uniformly expressed VIM, CD90, CD105, and PDGFR&#946;, but not Pan-CK, which could be used as a marker for the identification of LNCs. Flow cytometric analysis showed that approximately 95%, 97%, 92%, and 11% of LNCs expressed CD73, CD90, CD105, and SCF respectively, while they were&#160;68%, 99%, 20%, and 3% in&#160;BMMSCs. The standard process for LNC&#160;isolation and identification could provide&#160;a reliable laboratory basis for the widespread use of LNCs.

Yazar Gündemi: Yaygın LNC Araştırmalarını Desteklemek için Limbal Niş Hücre (LNC) İzolasyonunun ve Karakterizasyonunun Standardizasyonu 

Here, we present a protocol to isolate and identify the human limbal niche cells.

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

Histolojik Muayene ve İmmünohistokimya için İntegral Göz Yüzey Dokusu Elde Etmek Için Bozulmamış Göz Küresinin İzolasyon

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Biyoloji

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin that is secreted by conjunctival goblet cells (CGCs) onto the ocular surface contributes to multiple ocular surface diseases. The elimination of exogenous sex hormones is essential to obtain consistent results during in vitro study of sex-based differences in CGCs. This paper describes a method to minimize the presence of exogenous hormones in the study of sex-based differences in CGCs while maintaining their physiological function. CGCs from postmortem human donors of both sexes were cultured from pieces of the conjunctiva in RPMI medium with 10% fetal bovine serum (FBS) (referred to as the complete medium) until confluency. Nearly 48 h before the start of the experiments, CGCs were transferred to RPMI medium without phenol red or FBS but with 1% BSA (referred to as phenol-red-free medium). The normal cellular function was studied by measuring the increase in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) after carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulation using fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopy. The result shows that CGCs maintained normal function in the phenol-red-free media after 48 h. No significant difference in [Ca2+]i response was observed between phenol red-free RPMI medium and complete medium upon Cch stimulation. Therefore, we recommend using the phenol-red free RPMI medium with 1% BSA to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of CGCs in the study of sex-based differences.

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Phenol red-free/fetal bovine serum-free medium is a better option than advanced RPMI to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of conjunctival goblet cells in the study of sex-based differences.

In Vitro Konjonktival Goblet Hücrelerinde Cinsiyete Dayalı Farklılıkları İnceleme Yöntemi

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

Conjunktiva'dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Kapak Silecek Area izlenim Sitoloji

Farelerde Konjonktival Kommenal İzolasyon ve Tanımlama

Oküler Yüzey Enflamasyonunun İndüklenmesi ve Tutulan Dokuların Toplanması

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Histolojik Muayene ve İmmünohistokimya için İntegral Göz Yüzey Dokusu Elde Etmek Için Bozulmamış Göz Küresinin İzolasyon

In Vitro Konjonktival Goblet Hücrelerinde Cinsiyete Dayalı Farklılıkları İnceleme Yöntemi