Biz kültür tekniği ile onların yararlı tavsiye için Dr Julie Gordon ve Dr Nancy Manley teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Çocuk Glokom Vakfı ve Sharon-Stewart Aniridi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Fare embriyo kültürü: Tüm deneysel prosedürleri gözden ve devam düzenleyici gözetim korur Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan protokol # A2010 07-119, aşağıdaki sağlık kuralları National Institutes ile sıkı göre yapılmıştır. 1.. Kültür Medya hazırlanması <ol><li> KnockOut DMEM, nakavt Serum Replacement (KSR) (% 10), N-2 Supplement (1x), Albümin, İnek Serum (2%), Penisilin (: aşağıdaki miktarlarda ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı ve takviyeleri ile kültür ortamı hazırlayın 50 IU / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve Amfoterisin-B (1.25 ug / ml). Hazırlanan kültür ortamı, daha önce, aşağıdaki değişikliklerle 15 tarif edilene benzer: antimikotik ilavesi ve özel reaktifler ve ekipman ile ilgili ayrıntılar için antibiyotik iki konsantrasyonunun (bakınız, Li kullanarakMalzemelerin st). Not: Daha önce kullanılan (. Moore-Scott, vd 15) olarak antibiyotik konsantrasyonu embriyo kültürleri 24 saatlik süre kadar taşınan için yeterli oldu. Kültür, 24 saat devam edildi ötesinde, ancak biz kültür kirlenmesini deneyimli bu başarılı bir antibiyotik konsantrasyonunun iki katına ile kontrol edilmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da üretici tavsiyelerine uygun olarak -20 ° C &#39;de, ortam bileşenleri saklayın. KSR ve N-2 Ek tekrarlanan donma ve erime önlemek için -20 ° C&#39;de parçalar halinde muhafaza edilmelidir. Bir kez açıldı KnockOut DMEM üreticinin tavsiyesine göre 30 gün içinde kullanılmalıdır. Kullanımdan önce, 37 ° C bir su banyosu içinde bileşenleri sıcak </li><li> Steril şartlar altında ortam hazırlayın. Tüm ekipman ve kültürü kaputu koymadan önce% 70 alkol sprey ile medya bileşenleri içeren şişelerin yüzeyi dezenfekte edin. </li><li> Ortam bileşenleri steril bir beherde veya doğrudan filtre sistemi (Corning) in ya da karıştırılabilir. İlk KnockOut DMEM&#39;ye albümin tozu ekleyin. Albümin tamamen eriyene kadar hafifçe sallayarak iyice karıştırın. Daha sonra N-2 Ek, KSR ve antibiyotik eklemek ve bir pipet ile iyice karıştırın. Daha sonra vakum emme ile 0.22 um gözenek boyutlu filtre kullanılarak filtre ortamı sterilize. Kullanılana kadar 4 ° C&#39;de 50 ml konik tüp içine saklamak ve ortam dağıtın. Bir kez hazırlanan ortam kültür 4-5 gün içinde kullanılmalıdır. </li></ol> 2. Kültür Ekipmanları Hazırlanması <ol><li> Cam kültür şişeleri ve kauçuk mantarlarını sterilize edin. Bir alüminyum folyo ile kültür şişeleri sarın ve su bir beher içinde kauçuk mantarı şişe yerleştirin ve otoklav ile sterilize edilir. </li><li> Kültür başlamadan önce% 70 alkol sprey sıcak ve 37 ° C ile kültür odası (Precision Kuluçka Birimi) sterilize edin. Kültür odası ekültür şişeleri tutan merkezi bir dönme diski ile quipped. Odacık içine gaz akışı, bir basınç ölçer tarafından düzenlenir ve akış hızı sonunda bir cam tüp içinde suda hava kabarcıkları çıkış gözlemleyerek ayarlanabilir. Bu haddeleme şişe kültürü cihaz Yeni ve Cockroft 17 tarafından tanıtılan orijinal cihazının değiştirilmiş bir versiyonu. </li><li> Kültür bölmeye% 95 O 2/5% CO2 bir gaz karışımı ihtiva eden bir gaz silindiri ve 50 cc / dk &#39;lık bir akış hızı sağlar ve yeterli oksijen gitmesini sağlar &quot;saniyede bir hava kabarcığı&quot; gaz akışını ayarlamak Kültür embriyolar. </li></ol> 3. Fare Embriyo Toplama ve Kültür Hazırlık <ol><li> Yaban tip fare embriyoları elde etmek için, C57BL/6J ve CD-1 (Charles River Laboratories) genetik arka soylannın fareler kullanılmıştır. </li><li> Her gün sabah vajinal fişleri için dişi farelerin kontrol. Th bulma gün öğleE vajinal fiş E0.5 DPC (gün cinsel birleşme gönderebilir) olarak kabul edilmelidir. </li><li> Standart protokolleri izleyen hamile fareler euthanizing tarafından E10.5 DPC de fare embriyolar toplayın. Fareler Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) Hayvanların Ötenazi (2013) için rehber tarafından belirtilen bir CO 2 inhalasyon cihazı kullanılarak ötenazi edildi. Ölüm sağlanması için, servikal dislokasyon CO 2 maruz kaldıktan sonra gerçekleştirilmiştir. </li><li> Araçlara abdominal saç yapışmasını önlemek için ventral karın yüzeyi üzerinde% 70 etanol püskürtün. Sonra keskin künt işletim makas ve rahim bulmak için forseps Microdissecting içinde 4-3/4 bir çift kullanarak ventrale karın boşluğu açmak. Microdissecting forseps bir 4 kullanarak tüm rahim kaldırın ve rahim gövde ve rahim boynuzları ucunda bir ışık işletim makas ile keserek gövdesinden ayırmak. </li><li> Çabuk durulama 1x PBS içinde bütün uterus 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldırahim için bir kan yapışmasını çıkarın ve hemen DMEM içinde yerleştirmek için bir Petri kabı, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. Ayrıca kullanımdan önce% 70 etanol sprey tarafından aletleri sterilize edin. Not: PBS, DMEM ve kültür ortamına dahil olmak üzere, ve tüm işlem boyunca 37 ° C&#39;de muhafaza bunları ön ısıtma çözüm önerilir. </li><li> Bir mikroskop altında, rahim segmental bir ışık işletim makas ile disseke edilmelidir. Bu (köreltilmiş uçlar) modifiye Microdissecting cımbız hafifçe açılmasına genişletmek için sokulabildiği aracılığıyla bölümlere rahmin her iki tarafında küçük açıklıklar ile sonuçlanır. Bu, daha sonra yavaşça Reichert membran ile parietal sarısı kese (PYS) ortaya çıkarmak için Microdissecting bir çift cımbız ile yırtılarak temizlenebilir plasental decidua, maruz kalmasını mümkün kılar. Cımbız kullanarak bir kenarı hafifçe PYS birlikte Reichert membran delmek ve inci ayrıE visseral sarısı kesesi (VYS) altında yatan bozulmamış Vys ile embriyolar maruz katman. Ectoplacental koni ve trophoectoderm türevleri plasental decidua veya Reichert membran ile ya da temizlenebilir. Bakım embriyolar derhal dışarı pop gibi Vys rüptürü önlemek için alınmalıdır. </li><li> Bozulmamış VYS ile Embriyolar daha sonra kültür ortam maddesi plastik bir transfer pipeti kullanılarak 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı içeren bir Petri tabağına transfer edilmelidir. Not: rahim hemen ayrıldıktan sonra kültür ortamına transfer kültüründe embriyonun gelişimi için daha iyi olur. </li><li> Küçük bir açılış büyük kan damarları kaçınarak Microdissecting cımbız ile yumurta sarısının yapılmalıdır. Cımbız keskin bir çift hafifçe kafa bölgesine bitişik bir alanda delerek açılmasını sağlamak için kullanılabilir. Alternatif künt cımbız iki çift sarısı kesesi tutun ve yavaşça küçük bir açılış yapmak için gözyaşı için kullanılabilir.Sonra yavaşça embriyonik kafasını sığdırmak için yeterli bir boyuta cımbız ile genişleterek açıklığı genişletmek. Yakından embriyo tamamlıyor amniyon zarı yavaşça vücuttan düzenlenen ve bir cımbız kullanarak yırtılmış olmalıdır. 15 kese sarısı bununla embriyonik damar bütünlüğünü koruyarak embriyonik baş ve daha sonra bütün embriyo yavaşça sarısı kesesi eksterioze edilmelidir. Not: yumurta sarısı kesesi damar hasarları potansiyel kültür embriyonun gelişimini etkileyebilir. Hasarlı damar sistemi ile bu tür embriyo kültürü için kullanılmamalıdır ve daha sonra iptal edilebilir embriyoların hazırlama için kullanılabilir. </li><li> Embriyonik evreleme kriterleri: gövde ve baş büyüklüğü, bacak ve her gruptan en az iki embriyo için hücre gruplarının sayısını (ler) sayılarak göz morfolojisi ve sahneye dahil morfolojik kriterlere göre mikroskop ve grubu altında embriyolar inceleyin. &lt;strong&gt; Not: Genellikle rahimde gelişme aynı çöp gösteri farklarından elde ve vücut büyüklüğü, morfolojik özellikleri ve Somitlerin sayısında farklılık embriyolar. Ancak, bizim morfolojik kriterlere göre gruplandırılmış embriyolar genellikle benzer hücre gruplarının sayısını (± 1) sergilenen bulundu. Bu nedenle, bu kültür için başlangıç ​​gecikme süresi gibi her embriyo için somitler saymak için gerekli değildir. Not: kültür somitler saymak için kullanılan embriyolar kullanmayın. Kültürünü başlayarak zaman gecikmesini önlemek için diğer embriyoları için kültür başladıktan sonra somitler saymak. Rahim ayrıldıktan sonra kültüre gecikmeli embriyolar genellikle zayıf gelişme gösterirler. </li><li> Orta 37 ° C ısıtılmış taze kültürü ile bir Petri kabı hemen embriyoların transferi ve embriyoların tekrar steril Kültür ile bir Petri kabı transfer edilmelidir kültürü kaputu götürüne medya ortamı ile kültür şişeler içine koymadan önce kültürünü başlatın. Not: embriyoların için birden fazla medya transferlerini kültür embriyo toplama ve diseksiyon farklı adımlar kültürü kaputu yüklü olmayan bir mikroskop altında gerçekleştirilmiştir gibi kirlenmeyi önlemede yardımcı olur önce. Not: DKBKS (&gt; 12 embriyo), süreç yarım embriyolar büyük ve başlangıç ​​kültürü veya kültür ortamı ile bir tabak koyun ve 37 ° C&#39;de CO 2 inkübatör yerleştirdiğinizde Embriyolar uzun süre (&gt; 35-40 dk) kalmıştı dışında biz yavaşlatmak ve bu kültürü daha sonra gelişimini etkileyecek kalp gözlenmiştir. </li></ol> 4. Fare Embriyolar Kültürleme <ol><li> Kültürü kaputu otoklava kültür şişe açın ve bunları düzgün etiket. Kültür ortamı transferi 3 ml t her birine 37 ° C&#39;ye kadar ılıtıldıo şişeler ve ardından fare embriyoları steril plastik transferi pipetler kullanılarak kültür şişeler içine yavaşça transfer edilmelidir. Kültürü şişeleri daha sonra kültür cihazında haddeleme diske kültür şişeleri tutmaya yardımcı kauçuk tıpa ile kapatılmış bir şişe olmalıdır. Not: medya ile kültürü şişeleri farelere ötenazi önce hazırlanan ve kültür tertibatının haddeleme disk üzerine yerleştirilebilir. Bu durum, kültür şişelerine embriyo transferi için süreyi kısaltır. Not: Fareler Embriyolar bireysel olarak veya aynı kültür şişesi içinde iki ya da üç embriyolar ile alt kültürleri olarak kültürlenebilir. </li><li> Kültürü şişeleri aseptik olarak 37 ° C &#39;de kültür aparatına taşınan ve sıkı bir şekilde kauçuk tıpa ile haddeleme disk üzerindeki deliklere onları kanca gerekmektedir. Embr serbest yüzmesini sağlayan dakika (rpm) başına 35 rotasyonlar sabit bir hızda dönmeye haddeleme disk açınAyrıca medya ve yolar embriyonik doku tarafından serbest gaz alışverişi olur. Kültür odası bağlı silindirden gaz kültür şişeleri içine haddeleme disk ve lastik mantarları akar. </li><li> Düzenli Kültür 16-40 saat boyunca embriyolar ve gaz çıkışı ve kültür oda sıcaklığı kontrol edin. Not: fare embriyo manipülasyon kültüründe: embriyoların en az 30 dakika boyunca kültür koşullarına adapte olsun. Daha sonra düşük performans ve güçsüz bir kalp atışı gösteren embriyolar iptal edilebilir ve geri kalan embriyoların daha fazla işleme çalışmaları için kullanılabilir. Örneğin elektroporasyon 5,9,16, mikroenjeksiyon 18, boncuk implantasyon 16, ilaç tedavisi ve diğer işlemler gibi Embriyo manipülasyonu, bu anda gerçekleştirilebilir. Biz başarıyla erken göz gelişimi rollerini incelemek için bazı sinyal molekülleri ile tedavi Affi-jel agaroz boncuk implantasyonu yapıldı. Embriyolar, sonramanipülasyonlar bir taze ortamda geri döndü ve kültürü devam edilebilir. </li><li> 9-10 saat ve kültür 18-19 saat kültür 40 saat boyunca devam edildi sonra belirli aralıklarla tamamen taze ortam ile kültür ortamı değiştirin. Not: kültür 16-18 saat tarafından durdurulduğunda kültür ortamı yerine gerekmeyebilir. </li><li> Kültüründe başarılı ölçüleri: kültüründe embriyonik gelişme vücut büyüklüğü artış, hücre gruplarının sayısı ve baş, kol, kalp ve gözlerin morfolojik geliştirilmesi yolu ile değerlendirilmelidir ise kültüründe embriyonik hayatta kalma vücutta görünür kalp ve kan dolaşımı tarafından belirlenmelidir. </li><li> E11.0 DPC (~ 40-41 ler) ve E12.0 DPC (~ 49-50 ler) utero geliştirilen embriyolarda sırasıyla, 16-18 saat ve 38-40 saat için, kültürlenmiş embriyolar karşılaştırmak için kontrol olarak kullanılmalıdır. </li><li> Kültür sırasında ve utero aşamalarında için farklı zaman noktalarında embriyonik gelişme capt edilebilirdiseksiyon mikroskop altında değe. Nokta görüntüleme yazılımı görüntüleri yakalamak için kullanılan ve daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlendi. </li></ol>

<ol>
	<li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup.">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li><li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture.">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).</li><li>Miura, S., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+of+E5.5+mouse+embryos:+development+to+the+gastrulation+stage.">Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage.</a> Genesis. 37, 38-43 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Yokoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+in+rodent+whole-embryo+culture+are+reprogrammed+to+contribute+to+kidney+tissues.">Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).</li><li>Sadler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+early+somite+mouse+embryos+during+organogenesis.">Culture of early somite mouse embryos during organogenesis.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).</li><li>Kitchin, K. T., Ebron, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+development+of+rodent+whole+embryo+culture:+solvent+toxicity+and+water+insoluble+compound+delivery+system.">Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system.</a> Toxicology. 30, 45-57 (1984).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).</li><li>Cuthbertson, R. A., Beck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+whole+embryo+culture:+a+new+method+for+studying+ocular+development.">Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).</li><li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+explanted+rat+embryos+in+circulating+medium.">Development of explanted rat embryos in circulating medium.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).</li><li>Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+and+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentially+modulate+cytotoxic+effect+of+nitric+oxide+generated+by+serum+deprivation+in+neuronal+PC12+cells.">Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells.</a> J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li><li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin,+insulin-like+growth+factor-1,+and+epidermal+growth+factor.">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li><li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cAMP+signaling+pathways+differentially+regulate+alpha2C-adrenoceptor+expression:+role+in+serum+induction+in+human+arteriolar+smooth+muscle+cells.">Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).</li><li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos.">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li><li>Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-Free+Culture+of+Mid-gestation+Mouse+Embryos:+A+Tool+for+the+Study+of+Endoderm-Derived+Organs.">Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs.</a> Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation.">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li><li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos.">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li><li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development.">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis.">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li><li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li></ol>

Biz herhangi bir rakip mali çıkarlarını yok.

Orta gebelik aşama fare embriyoları, 37 ° C&#39;de% 95 O 2/5 bir haddeleme şişe kültür cihazı içinde% CO2 atmosferinde bir serum içermeyen kültür ortamı içinde kültürlendi Embriyo gelişme ex utero rahim kültürün tamamlanmasından (Şekil 1) için ötenazi farelerden izole edilir zaman, işlem sırasında her adımında birden fazla faktöre bağımlı idi. Gelişimini etkileyen en önemli faktör kültürü başlatmak için alınan zaman oldu. En çok d...

In vitro bütün embriyolarını kullanarak kültür yöntemleri utero erişimi aksi takdirde zor olan embriyonik organogeneziste alan mekanizmaların sinyalizasyon incelemek için uygundur. Tüm embriyolar doku bütünlüğünü sağlamak ve gerekli mekanizmaları sinyalizasyon zamanında oluşumu için önemli olan doku etkileşimleri için uygun destek organojenez esnasında farklı hücresel süreçler için. Bütün embriyo kültürleri vb nakli çalışmaları, genetik ve doku manipülasyonları, boncuk implantasyon çalışmaları, toksikolojik çalışmalar, gibi uygulamalar bir bolluk için bir platform sağlarken., Şu anda kullanılan embriyo kültür sistemleri embriyoların uygun büyüme ve bakım için serum esas bağımlı kültür 1-9. Serum kültür ortamı 6-8, 10, 11% 10-100 arasında değişen en önemli bileşenlerinden biri olarak kullanılmıştır., Bununla birlikte, serumun bileşim, iyi tanımlanmış değildir ve hayvandan hayvana farklı olabilir ve her zaman serum toplanır. Serum laboratuvar hazırlık zaman alıcı ve sıkı prosedürleri içerir iken, tedarik serum ticari farklı partiler arasında önemli değişkenlik gösterir ve deneysel maliyetlerini yükseltir. Bunlara ek olarak, serum gibi potansiyel olarak bazı deneylerin sonuçlarını etkileyebilir büyüme faktörleri, hormonlar veya başka proteinler, doku etkileşimlerinin önemli sinyal molekülleri çalışma gerektirir özellikle bu bilinmeyen faktörler içerebilir. Çalışmalar kültüre serumu ilaveli potansiyel olarak siklik adenosin monofosfatın (cAMP) ve mitojenik sinyal ve fosfoinositid 3 katılan proteinleri (3 PI) kinaz geçitler 12-14 sinyal gibi bazı sinyal moleküllerinin hücre içi seviyelerini değiştirebilir göstermiştir. Bu aksine, bir serum içermeyen kültür sistemi, antijen serbest ortamının avantajlar sağlamaktadırhücresel süreçleri değiştirebilir ve biyolojik olarak aktif enzimleri oruç deneyleri arasında tutarlılık sağlar. Bu çalışmada, 37 ° C&#39;de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde kültür orta gebelik aşama bütün embriyolar için ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılmaktadır C 15,16 °. Bu tanımlanan koşullar altında 16-40 saat için kültürlenmiştir Fare embriyolar hücresel çoğalma, göç ve farklılaşma doku etkileşimlerinin uygun seviyelerini gösteren bu kalp, kol, beyin ve göz gibi genel embriyonik gövde ve farklı yapılarda morfolojik gelişiminde ilerlemesi sergiledi. Göz gibi karmaşık organ sistemlerinin biri için kültüründe embriyonik gelişme moleküler analizi embr okular doku gözlemlenen ile tutarlı olması için, oküler gelişimini sergilemiştirYÖS (hazırlık, Kalaskar ve Lauderdale) rahimde gelişmekte. Böylece orta gebelik aşamasında kültürlendi fare embriyoları, rahimde embriyo geliştirme gözlenen ile karşılaştırılabilir aşamalı büyüme ve gelişme sergilerler morfolojik göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

Orta gebelik aşama fare embriyoları oksijenli haddeleme şişe kültür sistemi içinde ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak kültürlenmiştir. E10.5 fare embriyoları dikkatlice sağlam yumurta sarısının ile rahim izole edildi ve yolk kesesi ile embriyonun damar sürekliliğini korurken hassas cerrahi manevra kapsayan bir süreçte embriyoların yavaşça sarısı kesesi eksterioze edildi. Bozulmamış yolk kesesi veya uzaklaştırılarak yumurta sarısı ile hazırlanan embriyolar ile karşılaştırıldığında, bu embriyolar, üstün hayatta kalma oranı ve benzer koşullar altında kültüre gelişim ilerlemesi sergiledi. Biz, bu fare embriyoları, ne 16-40 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde tanımlanmış bir ortam içinde kültürlendi, karşılaştırılabilir morfolojik büyüme ve gelişme sergilerler olduğunu göstermektedir Embriyoların rahimde gelişmekte. Biz inci inanıyorumyöntem embriyonik organogeneziste önemli sinyal etkileşimleri incelemek için, tüm embriyo kültürünü kullanmak için ihtiyaç duyan araştırmacılar için yararlı olacaktır.

Fare embriyolarının gelişimi ex utero rahim embriyolar kültürlenir süre için vücut izole edilir zaman başlangıç ​​çok sayıda faktöre bağlıdır. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, işlem vücuttan uterus ayrılmasından (Şekil 1A), bozulmamış yolk kesesi (Şekil 1 B) ile embriyoların izolasyonu da dahil olmak üzere bir dizi adım içerir, yumurta sarısı kesesinden embriyoların eksteriorizasyon ( Şekil 1C) ve 37 °...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System at JoVE.com

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K Görüntüleme.  University of Georgia.  Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir. 

Video: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Biyoloji

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Fare Embriyonik Akciğer Kültür, Dallanma Moleküler Mekanizmalar değerlendirin Bir Sistem

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Gaz Geçirgen Malzeme Teknolojisi HYPERStack gemiler Kapalı Sistem Hücre Kültürü Protokolü

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Methods Article

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development