Biz Sağlık Araştırma İngiltere Ulusal Enstitüsü, Dr Hadwen Güven İnsani Araştırmalar, Birleşik Krallık&#39;ın önde gelen medikal araştırma yardım fonu sadece hayvansal olmayan araştırma teknikleri hayvan deneyleri yerine ve Wellcome Trust (Hibe 089.215) verdiği destek için minnettarım. Ayrıca Novartis İlaç Birleşik Krallık Ltd (sınırsız eğitim bursu) kabul ederler.

1. Yapay Balgam Orta hazırlanması (ASM) <ol><li> Birkaç saat bir süre içinde çok yavaş balığı sperm 250 ml steril su ile 4 g DNA ekleyin. DNA eritilip birkaç saat sürer ve oda sıcaklığında gece boyunca karıştırılmıştır edilebilir. </li><li> Musin tamamen eriyene dek domuz mide (tip II) yavaş yavaş 250 ml steril su ile 5 g musin ekleyin. Solüsyonu 4 &#39;de bir gece karıştırıldı edilebilir ° C. </li><li> 100 ml steril su içinde, L-tirozin ve L-sistein hariç olmak üzere, her bir temel ve gerekli olmayan L-amino asit 0,25 g eritilir. 0.5 M potasyum hidroksit 25 ml steril su içinde L-tirozin (M r 56,11 g / mol) ve 0.25 g, 25 mL L-sistein 0.25 g eritilir. </li><li> 5.9 mg diethylenetriaminepentaacetic asit (DTPA), steril su, 100 ml KCl 5 g NaCl ve 2.2 g eritilir. </li><li> Bir şişe içinde 1 litrelik DNA, musin, L-amino asitleri, DTPA, NaCl ve KCl birleştirir. </li><li> Yumurta sarısı e 5 ml ekleE mulsion ve steril su ile yaklaşık 850 ml dolgu. </li><li> 1 M Tris (pH 8.5; M r 121,14) ile 6.9 pH ayarlayın ve steril su ile hacmi 1 litre getirmek. </li><li> Sırasıyla 0.22 um ve 45 mm&#39;lik bir gözenek büyüklüğü ve boyun ile Vacuubrand ME 2 diyaframlı vakum pompası ve Millipore Steritop filtre birimleri kullanılarak süzme yoluyla sterilize ASM. Her Steritop filtre ünitesi, üç kez hemen yeniden kullanılabilir, ancak, filtreler yeniden kullanım önce steril su ile iki kere durulanmış gerekir. Filtrasyon işlemi yavaştır ve 2 gün boyunca gerçekleştirilebilir. ASM diğer sürümleri yerine, olası ilaç etkileşimleri nedeniyle filtrasyon Ancak 11, antibiyotik ilavesi kullanan geliştirilmiş olup, bu özel uygulama için yöntem önermiyoruz. </li><li> Süzülmeden ve ASM süzüldü karanlıkta 4 ° C de muhafaza edilmelidir. Taze ASM kullanılması ancak tavsiye edilir, bu bir ay için maksimum bu şartlar altında tutulabilir. </li&gt; </ol> 2. Planktonik Sesil Hücre Asgari Metabolik İnhibitör Konsantrasyon (PSMIC) Belirlenmesi <ol><li> 15 planktonically yetiştirilen P. için minimum metabolik inhibitör konsantrasyon (PSMIC) değerlerini belirlemek için aeruginosa izolatları, ANKEM BSAC 12 İngiliz Derneği kuralları açıklandığı gibi mikrodilüsyon yöntemi, yapılmalıdır. Tercih antibiyotik, bu durumda tobramisin sülfat içinde, seri antibiyotik konsantrasyonları arasında uygun bir aralık sağlamak üzere bir 96-kuyucuklu mikrotitre plaka Luria-Bertani (LB) ortam içinde seyreltilir. </li><li> P. gecede kültürleri sulandırınız 0,05 bir OD 600 LB in aeruginosa (± 0.01) ve seri olarak seyreltilmiş 100 ul antibiyotik içeren 96 kuyucuklu mikrotitre plaka kuyucuklara hacim 100 ul ilave edin. 0.5 mg / ml - bu durumda, tobramisin sülfat nihai konsantrasyonu 512 arasında değişmektedir. Sekiz her antib tekrarlanmakiotic konsantrasyonu yapılmalıdır. </li><li> Her izolat için negatif kontrol kuyuları hiçbir antibiyotik ilave edildiği, kurulmalıdır. Ayrıca, sekiz kuyu aşağı analizi sırasında boş olarak kullanılması (Bölüm 2.6) sadece LB içermelidir. </li><li> (5% O 2,% 10 CO 2, ve% 85 N 2) ya da mikroaerofilik aerobik şartlar altında çalkalama olmadan 37 ° C&#39;de 2 gün - 1 için 96-kuyucuklu mikrotitre inkübe. Mikroaerofilik koşulları büyük anaerobik kavanoz içinde CampyGen gaz üretim paketleri kullanılarak elde edilir. </li><li> İnkübasyondan sonra, bakteriyel bir büyüme Fluostar omega mikroplaka okuyucu ve MARS Veri analiz yazılımı kullanılarak 600 nm dalga boyunda her bir yanı içerisinde bakteriyel kültür absorbans ölçümüyle belirlenmiştir. </li><li> Antibiyotik ile tedavi edilen planktonik kültürler (A antibiyotik tedavi planktonik hücreler) ve negatif kontrol (A negatif kontrol) gelen emilim Absorpsiyon çıkarma tarafından düzeltilmesi gerekmektedirSadece kuyular içeren LB (boş) elde edilen arka absorbans iyon. Canlılık yüzdesi inhibisyonu sonradan x% 100 (A antibiyotik tedavi planktonik hücreler anlamına / A negatif kontrol ortalama) olarak hesaplanmıştır. PSMIC 90 planktonik bakteri büyümesini% 90 inhibisyonuna neden olan antibiyotik konsantrasyonu olarak tanımlanır. </li><li> Tercih edilen bir antibiyotik, 10 ul% 0.02 (v / v) resazurin (damıtılmış suda seyreltildi) her bir oyuğa ilave edilir ve plaka 1 için aerobik şartlar altında kuluçkaya yatırılır tedavisinden sonra bakteriyel yaşayabilirliği belirlemek için - 37 ° de 2 saat C, 150 devirde ise sarsıntılı. Canlı hücreler pembe floresan resorufin forma mavi resazurin boya azaltacaktır. </li><li> Resazurin ile inkübasyondan sonra, her bir kuyunun 540 nm dalgaboyu ve Fluostar Omega mikroplaka okuyucuda 590 nm emisyon dalga boyu kullanarak floresan izlemek. Olduğu tarif edildiği gibi veriler analiz edilmelidirdüşük. </li></ol> 3. Biyofilm Sesil Hücre Minimum İnhibitör Konsantrasyon Tayini (BSMIC) <ol><li> P. Gecelik kültürleri aeruginosa (bu durumda, P. aeruginosa 15 izolatı kullanılmaktadır) ,05 bir OD 600 (± 0.01), taze ASM daha sonra daha da seyreltilmiş 1:100 LB içinde seyreltilmiş edilmelidir (toplam hacim 1.8 ml) eklenmiştir. </li><li> Seyreltilmiş kültürleri (1.8 ml) bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakası muamele her oyuğa ilave edilmelidir. Üç kuyular sadece aşağı analizi sırasında boş (Bölüm 3.9) olarak kullanılmak üzere ASM içermelidir. </li><li> 75 rpm&#39;de çalkalama ise, 37 ° C&#39;de aerobik şartlar altında veya mikroaerofilik 3 gün için laboratuar parafilm ve inkübe ile 24-kuyucuklu plaklar sabitlemek. Mikroaerofilik koşulları büyük anaerobik kavanoz içinde CampyGen gaz üretim paketleri kullanılarak elde edilmelidir. </li><li> Taze uygun bir konsantrasyon aralığı sağlamak için, bu durumda tobramisin sülfat içinde, tercih antibiyotik sulandırınızASM. 1 mcg / ml - Bu durumda, nihai konsantrasyonu 512 arasında değişmekteydi. 24-kuyucuklu plak uygun kuyulara, 200 ul hacimde, antibiyotik konsantrasyonu, her ekleyin. Dört her bir antibiyotik konsantrasyonu çoğaltır yapılmalıdır. Tercih edilen bir antibiyotik maruz kalmaz Biyofilmler bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. </li><li> 75 rpm çalkalanırken, 37 bir daha 24 saat aerobik veya mikroaerofilik koşulları ° C altında laboratuar parafilm ve inkübe ile 24-iyi plakaları sabitleyin. </li><li> Tercih edilen bir antibiyotik varlığında inkübasyondan sonra, 100 ul 100 mg / ml selülaz (0.05 M sitrat tamponu içinde seyreltilir [9,6 g / l Citrate.H NaOH ile su ve pH 2 0-4,6] kullanılarak bakteri biyofilmler bozabilir 1 saat boyunca 150 rpm&#39;de çalkalama ederken) ile, 37 ° C&#39;de aerobik şartlar altında 24-kuyucuklu plaklar inkübe edilir. Gerekirse, biyofilm daha bu aşamada el pipetleme tarafından bozulmuş olabilir. </li><li> Metabolik faaliyetleri belirlemek içinkesintiye biyofilmler salınan bakteriyel hücrelerinin,% 0.02 100 ul (v / v) resazurin (damıtılmış su ile seyreltilir) 24-kuyucuklu plaklar, her oyuğa ilave edilmesi ve 1 inkübe - 37 ° C &#39;de 2 saat , 150 devirde ise sarsıntılı. </li><li> Resazurin ile inkübasyondan sonra, her bir kuyunun 540 nm dalgaboyu ve Fluostar Omega mikroplaka okuyucu ve MARS Veri Analiz Yazılım yılında 590 nm emisyon dalga boyu kullanarak floresan ölçmek. </li><li> Antibiyotik ile tedavi edilen biyofilm (F antibiyotik ile tedavi edilen biyofilm) ve negatif kontrol (F negatif kontrol) gelen floresans gelen Floresans ASM içeren kuyulardan elde edilen eşiğe çıkarılması ile düzeltilmelidir sadece (F boş). Canlılık yüzdesi inhibisyonu sonradan x% 100 (F antibiyotik tedavi biyofilmlerin anlamına / F negatif kontrol ortalama) olarak hesaplanmıştır. BSMIC 90 antibiyotik olarak tanımlanırtik konsantrasyonu metabolik aktivite% 90 inhibisyon neden olur. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar ASM biyofilm küçük (2 ml) bir hacim içinde mevcuttur ve biyofilmler tam olarak 3 gün (Şekil 1A) içinde oluşturulmaktadır. Bu titizlikle bozmaya zor olmalı biyofilm, pipet ile ortaya konabilir. Mikrokoloniler geniş hacimli 4 (Şekil 1B) yetiştirilen kıyaslanabilir. Şekil 2 elektron mikroskobik görüntü analizi ile tespit olarak planktonically ve biyofilm yetiştirilen hücreler arasında önemli farklılıklar göstermektedir. Biyofilm kültürlerin açıkça biyofilm içindeki hücrelerin ve bireysel yapıları çevreleyen hücre dışı matriks ciddi düzeyde tespit etmek zordur göstermektedir. Çeşitli çalışmalarda biyofilm yaşam tarzı antimikrobiyal duyarlılık 13, 14 etkileyebileceğini düşündürmektedir. Bizim küçük ölçekli ASM assay Dete için kullanılabilirAynı anda birden izolatı için birden çok antibiyotik BSMIC rmine. Assay of akışı Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bakteriyel hücre canlılığı üzerinde antibiyotik etkisi resazurin deneyi kullanılarak ölçülebilir. Antibiyotikler, bu durumda tobramisin içinde kurulmuştur biyofilm eklenebilir ve 24 saat süre ile inkübe edilir. Bu biyofilm bozulur ve resazurin eklendikten sonra. Metabolik olarak aktif hücreleri pembe (resorufin) 15 ila mavi (resazurin) bir renk değişimi ile sonuçlanan resazurin boya azaltabilir. Şekil 4A bir örnek deney gösterir ki içinde P. aeruginosa, bir mikrotitre plakası içinde biyofilm bozulması ve resazurin ilavesinden önce tobramisin farklı konsantrasyonları ile inkübe edildi. Canlı hücreler pembe floresan formu, resorufin için boya azaltmak ise mavi floresan olmayan renk, cansız hücreleri gösterir. SMIC sonra yüzde içine floresans dönüştürerek hesaplanabilirbakteriyel canlılığı kalan. Şekil 4B artan tobramisin konsantrasyonu% canlılığı değişiklik gösterir. % 10 canlılığı SMIC 90 hesaplamak için bir cut-off olarak seçildi. Aerobik koşullar altında, tobramisin SMIC 90 değerleri planktonik kültürleri daha bir biyofilm olarak yetiştirilen hücreler daha yüksektir. Tablo 1 test edilen bütün suşlar için PSMIC 90 ve BSMIC 90 değişimini göstermektedir. LB (planktonik modu) göre ASM (biyofilm modu) yetiştirilen aerobik koşullarda, tobramisin direnç dramatik bir artış (2 SMIC de&gt; 32 kat artış) en izolatlarının gözlendi Tablo 2 gösterir. Aerobik şartlar altında yetiştirilen biyofilmler göre ek olarak, mikroaerofilik koşullar altında yetiştirilen biyofilmler 2 ila&gt; 128-kat bir artış SMIC sergiledi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig1.jpg" /> Şekil1. ASM P. P. aeruginosa biyofilm aeruginosa suşu PAO1 ASM yetiştirilen makroskopik görünür kümeleri (mikrokoloniler) oluşturur. vidalı kapaklı cam şişeler Duran. B, 2 ml ASM kültürlerde Biyofilm oluşumu (7 gün büyüme sonra 30 ml ASM kültürlerinde A, Biyofilm oluşumu (büyük ölçekli) küçük ölçekli) 24-iyi polistiren levhalar 3 gün büyüme sonrası. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig2.jpg" /> Şekil 2. ASM biyofilmlerin TEM mikrografları A / C TEM mikrografı; PAO1 (x 27,000) PAO1grown planktonik B / D TEM mikrografı (x57, 000), sırasıyla, planktonically ve ASM yetiştirilen ve ASM sırasıyla. Planktonically yetiştirilen bakteriler LB broth geceleme yetiştirildi. Biyofilmler 30 ml ASM kültürlerde 7 gün süre ile yetiştirildi. Siyah oklar biyofilm içindeki hücrelere başvuran ve yıldızlar ekstraselüler boşluk bakın. Ölçek çubukları = 1um. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig3.jpg" /> Şekil 3. ASM biyofilm antimikrobiyal duyarlılık testinin İş Akışı. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3857/3857fig4.jpg" /> Şekil 4. Bakteri hücreleri, farklı bir antibiyotik konsantrasyonları ve kalan metabolik aktivite resazurin kullanılarak belirlendi ile inkübe edildi antibiyotik duyarlılığının belirlenmesi için resazurin kullanımı. A, resazurin bir mavi floresan olmayan okside formu cansız hücreleri göstermektedir ve metabolik azalır pembe floresan resorufin. B aktif hücreleri, Floresans şiddeti kalan bakteriyel canlılık yüzdeleri dönüştürülür. % 10 canlılığı MSMIC90 hesaplamak için cut-off olarak seçildi. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3857/3857fig4large.jpg" target="_blank">lar görmek için buraya tıklayın</a>ger rakam. </span&gt; <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Suşları </td><td colspan="2"> PSMIC 90 (ug / ml) 1 </td><td colspan="2"> BSMIC 90 (ug / ml) 1 </td></tr><tr><td> Aerobik </td><td> Mikroaerofilik 2 </td><td> Aerobik </td><td> Mikroaerofilik 2 </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> Fenerbahçe Salgın Strain (LES) izole </td></tr><tr><td> LESB58 21 </td><td> 8 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 128 </td></tr><tr><td> LES400 22 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 8 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 256 </td><td> 512 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LES431 22 </td><td> 4 </td><td> 8 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 16 </td><td> 64 </td><td> 64 </td><td> 256 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 32 </td><td> 128 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td colspan="5"> Sigara LES izolatların </td></tr><tr><td> 49461 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 16 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59032 </td><td> 0.5 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59073 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 59076 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> &gt; 512 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> 27 </td><td> 8 </td><td> 16 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 16 </td><td> 32 </td><td> 4 </td><td> &gt; 512 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tobramisin için P. aeruginosa Duyarlılıkları. PSMICs ve BSMICs tobramisin belirlenmesi için 1 2-kat seri seyreltiler kullanılmıştır 512 arasında değişen - 0.5 mg / ml (n = her bir konsantrasyonu için 8) ve 512-1 ug / ml (n = 4 her biri için konsantrasyon), sırasıyla;; PSMICs standardı kullanılarak belirlenmiştir mikrodilüsyon yöntemi 1. 2 mikroaerofilik koşullarda% 5 O 2,% 10 CO 2, ve% 85 N 2 idi. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Zorlanma </td><td colspan="4"> PSMIC 90 / BSMIC 90 katlık değişime 1 </td></tr><tr><td> PSMIC aerobik → PSMIC mikroaerofilik </td><td> BSMIC aerobik → BSMIC mikroaerofilik </td><td> PSMIC aerobik → BSMIC aerobik </td><td> Mikroaerofilik PSMIC → BSMIC mikroaerofilik </td></tr><tr><td> PAO1 </td><td> 0 </td><td> &gt; 64 </td><td> 2 </td><td> 128 </td></tr><tr><td colspan="5"> LES izole </td></tr><tr><td> LESB58 </td><td> 8 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LES400 </td><td> 4 </td><td> 32 </td><td> 0.25 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> LESB25 </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 16 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> LESB55 </td><td> 4 </td><td> &gt; 8 </td&gt; <td> 4 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LESB64 </td><td> 4 </td><td> ND </td><td> &gt; 32 </td><td> &gt; 8 </td></tr><tr><td> LES431 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </td><td> 8 </td><td> &gt; 64 </td></tr><tr><td> LESB49 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> LES109 </td><td> 4 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> &gt; 4 </td></tr><tr><td colspan="5"> Sigara LES izolatların </td></tr><tr><td> 49461 </td><td> 2 </td><td> &gt; 32 </td><td> 0 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 59032 </td><td> 4 </td><td> &gt; 128 </td><td> 8 </td><td> &gt; 256 </td></tr><tr><td> 59073 </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> 59076 </td><td> 2 </td><td> &gt; 16 </td&gt; <td> 2 </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0.5 </td><td> &gt; 32 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 2 </td><td> &gt; 128 </td><td> 0.25 </td><td> &gt; 16 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. PSMICs ve tobramisin için BSMICs ve Katlama değişikliği. Belirlenmediği 1 ND; kalın değerleri SMIC kat değişiklikler&gt; 10 gösterir.

<ol>
	<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li><li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li><li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+and+clinical+response+to+parenteral+antibiotic+administration:+lack+of+association+in+cystic+fibrosis.">Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis.</a> Chest. 123, 1495-1502 (2003).</li><li>Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolony+formation:+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung.">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).</li><li>Garbe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+JG024,+a+pseudomonas+aeruginosa+PB1-like+broad+host+range+phage+under+simulated+infection+conditions.">Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions.</a> BMC Microbiol. 10, 301 (2010).</li><li>Naughton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+AES-1+exhibits+increased+virulence+gene+expression+during+chronic+infection+of+cystic+fibrosis+lung.">Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung.</a> PLoS One. 6, e24526 (2011).</li><li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pseudomonas+biofilm+susceptibilities+to+assign+simulated+antibiotic+regimens+for+cystic+fibrosis+airway+infection.">Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).</li><li>Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+limitation+on+the+in+vitro+antimicrobial+susceptibility+of+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+grown+planktonically+and+as+biofilms.">Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).</li><li>Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients.">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).</li><li>Hill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibilities+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+derived+from+patients+with+cystic+fibrosis+under+aerobic,+anaerobic,+and+biofilm+conditions.">Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li><li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum.">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li><li>Rybtke, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+implication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+infections.">The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway.">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li><li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rapid+and+simple+non-radioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes:+an+alternative+to+[3H]thymidine+incorporation+assay.">A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).</li><li>Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antibiotic+treatment+on+bacteriophage+production+by+a+cystic+fibrosis+epidemic+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).</li><li>Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms.">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li><li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections.">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li><li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations.">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li><li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia.">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li><li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li><li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection.">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada P. çoğaltmak ASM dayalı in vitro model bir roman kullanılan CF akciğer 4 içinde aeruginosa biyofilm koşulları. Model antimikrobiyal ajanların küçük ölçekli, yüksek hacimli test başarıyla güncellenmiştir. Bu testin kritik adımları: <ol><li> ASM medya ve bakımını sterilite tutarlı hazırlanması. Her bir bileşen tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için her seferinde ilave edildiği şekilde optimize etmek için uzun saatler vermiş. ASM filtrasyon yavaştır ama musin bileşeni zarar verebilir otoklav, daha çok tercih edilir. Bu, oldukça seçici baskıların, sürücü mutasyonlar empoze profaj lizis 16 neden ve anlamlı birden fazla bakteri genlerinin ifadesi değiştirebilir çünkü başkaları 11 tarafından önerilen antibiyotiklerin yanı sıra, tavsiye değil. </li><li> Tahlil hacmi o göre optimize edilmelidirf ASM kullanılabilir. Çalkalama hızı küçük miktarlar için artar ve daha kısa bir biyofilm yaşam döngüsü görülmektedir. </li></ol> Küçük ölçekli ASM biyofilm modelinde bariz bir uygulama biyofilm antibiyotik duyarlılıkları (BSMIC 90) daha gerçekçi bir tespit. Anaerob ve mikroaerofilik nişler CF akciğer bulunan ve oksijen olgun biyofilm 2, 17 içinde derin sınırlı olduğunu kanıtlar vardır. İşte göstermektedir ki 10/14 klinik P. ASM mikroaerofilik şartlarda tobramisin duyarlılık azalması - CF hasta balgamlari gelen aeruginosa izolatlarının önemli (≥ 128 kat 4) sergilerler. Bu çalışmanın sonuçları, tobramisin gibi antibiyotikler, P. karşı daha az etkili olabileceğini düşündürmektedir geleneksel duyarlılık test yöntemleri gösterdiğinden daha CF akciğer aeruginosa enfeksiyonları. Bu sonuçlar, biyofilm 10 antimikrobiyal duyarlılık üzerine önceki çalışmalarda yansıtmaktadır. Küçük-ölçekli ASM deneyleri böylece daha iyi tedavi kararları için anlamlı antibiyotik duyarlılık veri üretebilmek için basit bir yüksek verimlilik platformu sağlamak. Testi, tek koloniler geleneksel antibiyotik duyarlılık testi olarak tüm nüfusu temsil olmayabilir tarama için toplanır aynı şekilde sınırlıdır. Bununla birlikte, non-yüzeyine iliştirilmiş biyofilm büyümesi ve mikroaerofilik koşullarına (ii) kullanılarak uygulanabilir bir yaklaşım, (i), açık bir alternatif yöntemler mevcut için potansiyel bir iyileştirme temsil inanıyoruz. Biz bu testte P. çalışmak için uygun bir model olduğu sonucuna aeruginosa biyofilm nüfus. Klinik ortamlarda daha fazla test antibiyotik duyarlılıkları biyofilm-yetiştirilen P. dayalı olmadığını araştırmalıdır olurdu aeruginosa gelişmiş bir mikrobiyolojik ve klinik sonuçları ile farklı antibiyotik seçimini yol açabilir. Klasik modelleri kullanarak biyofilm Benzer soruşturmalar BSMIC değerleri sebep olduğunu göstermiştirantibiyotik 5,17 için farklı önerilere. Anti-enfeksiyon ajanlarının etkinliği test etmek yanı sıra, ASM sistemi, örneğin P. çeşitlendirilmesi anlaşılması amacıyla, bu gibi çalışmalar için hayvan modellerinde için ucuz, basit ve tekrarlanabilir bir alternatif temsil eder aeruginosa nüfus. Biz P. doğal popülasyonlarının yoğun heterojen gözlemledik aeruginosa CF hasta balgamlari 18, 19 kurtarıldı. Benzer fenotipik ve genotipik çeşitlendirilmesi bu CF akciğer koşulların in vitro model cazip hale ASM 4 (ve yayınlanmamış veriler) büyüme sırasında görülebilir. ASM modelinin uygulama kolaylığı kolay uzun vadeli bir adaptasyon deneyleri P. üzerine antibiyotikler ya da diğer gerilme etkileri izlenmesi azından, örneğin, hedef tasarımı kolaylaştırır aeruginosa nüfus sapma. Buna ek olarak, diğer patojenlerden yetiştirilebilirASM. Örneğin,. 2007 S. biyofilm oluşumunu incelemek ASM Fouhy ark kullanmış maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Balık sperm DNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Domuz mide, tip II Müsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-Alanin </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-asparagin monohidrat </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-Aspartik asit </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-Sistein </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-glutamik asit </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glisin </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-histidin </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-Isoleucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-Lösin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-Lizin monohidroklorür </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-Metiyonin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanin </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-prolin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-serin </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-treonin </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-triptofan </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Diethylenetriaminepentaacetic asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> Yumurta sarısı emülsiyonu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 diyaframlı vakum pompası </td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Steritop filtreler (Gözenek boyutu: 0.22 um, Boyun boyutu: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani orta </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96-çukurlu mikrotitre plaka </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td></tr><tr><td> 24-iyi doku kültürü ile tedavi edilen plakaları </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen gaz üretim paketleri </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Mikroaerofilik odası </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramisin sülfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Selülaz, Aspergillus Nijer gelen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega mikroplaka okuyucu </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung

P. izolatlar uygulandığında in vitro antimikrobiyal duyarlılık testleri ile ilgisi hakkında endişe büyüyor kistik fibrozis (KF) hastaların aeruginosa. Mevcut yöntemler tek güvenmek ya da birkaç izolat aerobik ve planktonically büyüdü. Önceden belirlenmiş bir kesik bakteri hassas ya da herhangi bir antibiyotiğe dirençli 1 olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Ancak, CF, P. kronik akciğer enfeksiyonları sırasında aeruginosa nüfus biyofilmler var ve çevre 2 büyük ölçüde mikroaerofilik olduğunu kanıtlar vardır. Akciğer ve tanısal test sırasında bu bakteriler arasında koşullarında yalın farkı sorgulamaya bu testlerin 3 bile güvenilirliği ve alaka çağırdı. Yapay balgam orta (ASM) amino asitler, müsin ve serbest DNA da dahil olmak üzere CF hastanın balgam bileşenleri içeren bir kültür ortamıdır. P. aeruginosa &lt;/ Em kendi kendine bir araya biyofilm yapıları ve nüfus farklılığı 4,5,6 oluşumu ile CF enfeksiyonları sırasında ASM mimikler büyüme&gt; büyüme. Bu çalışmanın amacı, P. antimikrobiyal duyarlılık okumak için mikrotitre plaka test geliştirmek oldu aeruginosa mikroaerofilik ve aerobik koşullarda hem uygulanabilir ASM, büyüme dayalı. Bir ASM tahlil, bir mikrotitre plaka biçiminde geliştirilmiştir. P. aeruginosa biyofilmler 24 saat boyunca, farklı konsantrasyonda önceden antimikrobiyal ajanlar ile inkübasyondan ila 3 gün için geliştirmek için izin verildi. Biyofilm kesinti sonra, hücre canlılığı resazurin ile boyanarak ölçüldü. Bu deneyde 15 farklı P. için tobramisinin sessile hücre minimum inhibisyon konsantrasyonunun (SMIC) tespit etmek için kullanıldı aerobik ve mikroaerofilik koşulları ve SMIC değerlerin altında aeruginosa izolatları standart suyu büyüme ile elde edilenlerle karşılaştırıldı. Bulunmazkenkendi planktonik muadillerine göre ASM yetiştirilen izolatları için artan MİK değerleri için bazı kanıtlar, büyük farklılıklar ASM sisteminde tobramisin doğru bir&gt; 128 kat, bir çok artan direnç gösterdi mikroaerofilik koşulları, test bakteri bulunmuştur zaman aerobik şartlar altında gerçekleştirilir deneyleri ile karşılaştırıldığında. Mevcut duyarlılık test yöntemleri ve klinik sonuç arasındaki ilişkinin bulunmaması, 3 mevcut yöntemlerin geçerliliğini sorgulamıştı. İn vitro model birkaç P. incelemek için daha önceden kullanılmış olan aeruginosa biyofilmlerin 7, 8. ASM biyofilmler CF akciğer 9 gözlenen benzeyen ise Ancak, bu yöntemler, yüzey ekli biyofilmler güveniyor. Buna ek olarak, mukus azaltılmış oksijen konsantrasyonu P. davranışını değiştirir gösterilmiştir aeruginosa 2 ve antibiyotik duyarlılık 10 etkiler. Bu nedenle usinmikroaerofilik şartlarda g ASM antimikrobiyal duyarlılık çalışma için daha gerçekçi bir ortam sağlayabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung at JoVE.com

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

use-artificial-sputum-medium-to-test-antibiotic-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

32.5K Görüntüleme.  University of Liverpool. Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Video: Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Immünkompetan Kemirgenler bir Sağlam Pnömoni Modeli karşı antibakteriyel etkinliğini değerlendirmektir<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;<i&gt; H. influenza</i&gt;<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ya da<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing methods in general. Additionally, little evidence exists comparing handwashing methods to determine which are most efficacious at removing infectious pathogens. Research is needed to provide evidence for the different approaches to handwashing that may be employed during infectious disease outbreaks. Here, a laboratory method to assess the efficacy of handwashing methods at removing microorganisms from hands and their persistence in rinse water is described. Volunteers' hands are first spiked with the test organism and then washed with each handwashing method of interest. Generally, surrogate microorganisms are used to protect human subjects from disease. The number of organisms remaining on volunteers' hands after washing is tested using a modified "glove juice" method: the hands are placed in gloves with an eluent and are scrubbed to suspend the microorganisms and make them available for analysis by membrane filtration (bacteria) or plaque assay (viruses/bacteriophages). Rinse water produced from the handwashing is directly collected for analysis. Handwashing efficacy is quantified by comparing the log reduction value between samples taken after handwashing to samples with no handwashing. Rinse water persistence is quantified by comparing rinse water samples from various handwashing methods to samples collected after handwashing with just water. While this method is limited by the need to use surrogate organisms to preserve the safety of human volunteers, it captures aspects of handwashing that are difficult to replicate in an in vitro study and fills research gaps on handwashing efficacy and the persistence of infectious organisms in rinse water.

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, there is little evidence on which handwashing methods are most efficacious at removing infectious disease pathogens. We developed a method to assess the efficacy of handwashing methods at removing microorganisms.

Yükselen Bulaşıcı Patojenlerin Giderilmesi İçin El Yıkama Etkinliğini Test Etmenin Bir Metodu

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe infections, complications, and mortality worldwide with a huge impact on our society and on the health system. In particular, patients with compromised immune systems or pre-existing and chronic pathologies, such as cystic fibrosis (CF), are subjected to frequent antibiotic treatments to control the infections with the appearance and diffusion of multidrug resistant isolates. Therefore, there is an urgent need to address alternative therapies to counteract bacterial infections. Use of bacteriophages, the natural enemies of bacteria, can be a possible solution. The protocol detailed in this work describes the application of phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infection in CF zebrafish embryos. Zebrafish embryos were infected with P. aeruginosa to demonstrate that phage therapy is effective against P. aeruginosa infections as it reduces lethality, bacterial burden and pro-inflammatory immune response in CF embryos.

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Presented here is a protocol for Pseudomonas aeruginosa infection and phage therapy application in cystic fibrosis (CF) zebrafish embryos.

Kistik Fibrozis Zebrabalık Embriyolarında Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonuna Karşı Faj Tedavisi Uygulaması

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.