Riconosciamo l&#39;appoggio del Regno Unito Istituto Nazionale per la Ricerca sulla Salute, il Dr. Hadwen Trust per la ricerca umanistici, della britannica leader di finanziamento carità di ricerca medica senza animali esclusivamente tecniche di ricerca per sostituire gli esperimenti su animali, e il Wellcome Trust (Grant 089.215). Riconosciamo inoltre Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (educazionale di sovvenzione).

<ol>
	<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li><li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li><li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. 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Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li><li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum.">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li><li>Rybtke, M. 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Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li><li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li><li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection.">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In questo studio abbiamo utilizzato un nuovo modello in vitro sulla base di ASM per replicare P. biofilm condizioni aeruginosa all&#39;interno del polmone CF 4. Il modello è stato modificato con successo per la piccola, high-throughput test di agenti antimicrobici. I passaggi critici di questo test sono: <ol><li> Preparazione costante dei mezzi di comunicazione ASM e sterilità mantenimento. Abbiamo dedicato lunghe ore per ottimizzare il modo in cui viene aggiunto ogni componente di ottenere risultati riproducibili ogni volta. Filtrazione della ASM è lento, ma è preferibile alla sterilizzazione in autoclave, che può danneggiare il componente mucina. Noi non consigliamo l&#39;aggiunta di antibiotici, come suggerito da altri 11, perché questo può comportare notevoli pressioni selettive, mutazioni di unità, indurre la lisi profago 16 e altera in modo significativo l&#39;espressione di più geni batterici. </li><li> Il dosaggio deve essere ottimizzata in base al volume of ASM utilizzato. Shaking velocità sono aumentati per i minori volumi e di un biofilm più breve ciclo di vita si osserva. </li></ol> Un&#39;applicazione evidente del modello di piccola scala biofilm ASM è la determinazione più realistica di suscettibilità biofilm BSMIC antimicrobici (90). Nicchie anaerobici e microaerofili sono presenti nel polmone CF e vi sono prove che l&#39;ossigeno è limitata nel profondo del biofilm maturo 2, 17. Qui si dimostra che 10/14 clinica P. aeruginosa isolati da pazienti Sputa CF presentano una notevole (4 - ≥ 128 volte) diminuzione della sensibilità alla tobramicina in condizioni microaerofili in ASM. I risultati di questo studio suggeriscono che antibiotici, come tobramicina, potrebbero essere meno efficaci contro P. aeruginosa nei polmoni CF quelli indicati con i metodi convenzionali test di sensibilità. Questi risultati riflettono gli studi precedenti sulla sensibilità agli antibiotici di biofilm 10. Small-scala saggi ASM quindi fornire una piattaforma semplice, ad alto rendimento per la generazione di significativi dati di sensibilità agli antibiotici per informare meglio le decisioni terapeutiche. Il saggio è limitata nello stesso modo convenzionale test di sensibilità agli antibiotici in singole colonie che vengono prelevati per lo screening che non può essere rappresentativa della popolazione. Tuttavia, riteniamo che un approccio (i) con superficie di crescita non collegato biofilm e (ii) applicabile alle condizioni microaerofili, rappresenta un&#39;alternativa chiara e un potenziale miglioramento dei metodi esistenti. Concludiamo che questo test è un modello adeguato per lo studio P. aeruginosa biofilm popolazioni. Ulteriori test in ambito clinico sarebbe verificare se suscettibilità agli antibiotici basata su biofilm cresciuti P. aeruginosa potrebbe portare a scelte diverse con antibiotici potenzialmente migliori esiti clinici e microbiologici. Indagini simili che utilizzano modelli di biofilm classici hanno dimostrato che i valori BSMIC portarealle raccomandazioni diverse per il trattamento antibiotico 5,17. Oltre al test per l&#39;efficacia delle agenti anti-infettivi, il sistema ASM rappresenta un buon mercato, un&#39;alternativa semplice e riproducibile per modelli animali per studi come quelli che mirano a comprendere la diversificazione delle P. aeruginosa popolazioni. Abbiamo osservato vasta eterogeneità nelle popolazioni naturali di P. aeruginosa recuperato dal paziente Sputa CF 18, 19. Simile la diversificazione fenotipica e genotipica può essere osservato durante la crescita in ASM 4 (ed i nostri dati non pubblicati), che lo rende un interessante modello in vitro delle condizioni polmonari CF. La relativa semplicità del modello ASM rende facile progettare esperimenti a lungo termine adattamento destinato, ad esempio, a monitorare gli effetti degli antibiotici o altre sollecitazioni su P. aeruginosa popolazione divergenza. Inoltre, altri patogeni batterici possono essere coltivate inASM. Ad esempio, Fouhy et al. ASM 2007 hanno utilizzato per studiare la formazione di biofilm da S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DNA di sperma di pesce </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Mucin da suini allo stomaco, di tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-alanina </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-Asparagina monoidrato </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-acido aspartico </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-acido glutammico </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-Istidina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-Isoleucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-Lisina monocloridrato </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-Triptofano </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> L&#39;acido Diethylenetriaminepentaacetic </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> Emulsione di tuorlo d&#39;uovo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 pompa a vuoto a membrana </td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Steritop filtri (diametro dei pori: 0,22 micron, la dimensione del collo: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani mezzo </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96 pozzetti microtitolazione piastre </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td></tr><tr><td> 24 pozzetti di coltura di tessuti trattati con piastre </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen generazione di gas confezioni </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Camera microaerofilo </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramicina solfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulasi, da Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega lettore di micropiastre </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung

Vi è una crescente preoccupazione per la rilevanza dei test di sensibilità in vitro agli antimicrobici quando applicata a isolati di P. aeruginosa da fibrosi cistica (CF) pazienti. Metodi esistenti contare su uno o alcuni isolati coltivati ​​aerobicamente e planktonically. Predeterminate cut-off sono utilizzati per definire se i batteri sono sensibili o resistenti a qualsiasi antibiotico somministrato 1. Tuttavia, durante le infezioni polmonari croniche in CF, P. popolazioni aeruginosa esistono in biofilm e vi sono prove che l&#39;ambiente è in gran parte microaerofilo 2. La netta differenza di condizioni tra i batteri nel polmone e quelli durante i test diagnostici ha messo in discussione l&#39;affidabilità e la rilevanza anche di questi test 3. Media espettorato artificiale (ASM) è un terreno di coltura contenente i componenti di espettorato dei pazienti CF, tra cui aminoacidi, mucina e il DNA libero. P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; Crescita in ASM crescita mimica durante le infezioni CF, con la formazione di auto-aggregazione di strutture biofilm e divergenza della popolazione 4,5,6. Lo scopo di questo studio era di sviluppare un microtitolazione-piastra di analisi per studiare sensibilità agli antibiotici di P. aeruginosa basata sulla crescita in ASM, che è applicabile a queste due condizioni microaerofili e aerobica. Un saggio di ASM è stato sviluppato in un formato micropiastra. P. biofilm aeruginosa sono stati lasciati sviluppare per 3 giorni prima dell&#39;incubazione con agenti antimicrobici a diverse concentrazioni per 24 ore. Dopo l&#39;interruzione biofilm, la vitalità cellulare è stata misurata mediante colorazione con resazurina. Questo test è stato utilizzato per accertare la sessile concentrazione minima inibitoria delle cellule (SMIC) di tobramicina per 15 differenti P. aeruginosa isolati in condizioni aerobiche e microaerofili SMIC ei valori sono stati confrontati con quelli ottenuti con brodo di crescita standard. Mentre non vi eraalcune prove per i valori di MIC maggiori per isolati coltivati ​​in ASM rispetto ai loro omologhi planctonici, le maggiori differenze sono state trovate con i batteri testati in condizioni microaerofili, che hanno mostrato una resistenza molto aumentata fino ad un&gt; 128 volte, verso tobramicina nel sistema ASM, quando rispetto ai saggi effettuati in condizioni aerobiche. La mancanza di associazione tra i metodi attuali test di sensibilità e risultati clinici ha messo in dubbio la validità dei metodi attuali 3. Vari modelli in vitro sono stati utilizzati precedentemente per studiare P. biofilm aeruginosa 7, 8. Tuttavia, questi metodi si basa su biofilm di superficie collegati, mentre i biofilm ASM simili a quelli osservati nel polmone CF 9. Inoltre, la concentrazione di ossigeno ridotto nel muco è stato dimostrato che alterano il comportamento di P. aeruginosa 2 e pregiudica la suscettibilità agli antibiotici 10. Pertanto using ASM in condizioni microaerofili può fornire un ambiente più realistico in cui studiare sensibilità agli antibiotici.

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Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current test diagnostici di sensibilità agli antibiotici si basa sulla crescita planctoniche di isolati in ricchi di nutrienti, le condizioni aerobiche. Qui, ci avvaliamo di un mezzo alternativo sputum artificiale per studiare sensibilità agli antibiotici di Pseudomonas aeruginosa biofilm sia in condizioni aerobiche e microaerofili più rappresentativi del polmone fibrosi cistica.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

use-artificial-sputum-medium-to-test-antibiotic-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

32.4K Views.  University of Liverpool. Current test diagnostici di sensibilità agli antibiotici si basa sulla crescita planctoniche di isolati in ricchi di nutrienti, le condizioni aerobiche. Qui, ci avvaliamo di un mezzo alternativo sputum artificiale per studiare sensibilità agli antibiotici di Pseudomonas aeruginosa biofilm sia in condizioni aerobiche e microaerofili più rappresentativi del polmone fibrosi cistica.

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