Bu çalışma NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796 tarafından desteklenmiştir.

Sunulan Leo-iş akışları protein izotop etiketleme sindirir ve sentetik peptidler için izin verir. Bu zaman süreci deneyler (Şekil 1) ve kantitatif proteomikler karşılaştırmalı çalışmalar gibi proteaz araştırma için de geçerlidir. Her iş akışı iki deneysel adımlar (Şekil 2) oluşur: A) ilgili 18 O-izotop kodlanmış reaksiyonu (proteaz-katalizli peptid bölünme karar örnekleme zamanı; proteaz-katalizli karboksil oksijen alışverişi reaksiyonu; asit katalizörlü karboksil oksijen alışverişi kütle spektrometresi ve 18 O-birleşme kinetiği grafiksel gösterimi ile reaksiyonu) ve B) analizi. A. timecourse Deneyler I. Paleo-timecourse: proteolitik dilinimleri of Proteaz-katalizli etiketleme <ol><li> (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır25 mM NH4 50, 30 dakika süre ile inkübasyonu ile HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) ° C. </li><li> (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla. </li><li> Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein örneklerinin için tamponlar alışverişinde peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri (Sartorius) için PepClean C-18 sıkma sütunlar (Termo) kullanın. </li><li> / Çözülür değiş tokuş peptitler / 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz proteinler (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5.5; tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) ile 1:1 (v / v) nihai H 2 içeren 18 O (% 95, Sigma IsoTec). </li><li> Önceki proteaz ilave olarak bir sıfır zaman noktası numune alımı için: Karışım reaksiyon karışımının 0.5 ul, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamikmatris asit (% 50 asetonitril içinde 10 mg / ml,% 0.1 TFA). Opti bir MALDI-TOF 384 hedef plaka (AB Sciex) üzerinde Noktası numune ve oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakmak kuruyana kadar (yaklaşık 5 dakika). </li><li> Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta:;: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM tripsin 75 nM ECE-1) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve kontrol örneği olarak hizmet verecek. Birinci kısım proteaz-katalize 18 O-etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve proteolitik bölünme reaksiyonları peptid ve protein tespiti, proteolitik etkinlikler tespit edilmesi ve izlenmesi için de kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz neden olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, ne etiket veya dilinim Bu örnek için bekleniyor. </li><li> Reaksiyon çözeltisi kısmı kaldırılması ve des olarak lekelenme ile reaksiyon takipzaman aralıklarında 5. adımı altında açıklanan şekilde değiştirin kadar formda görünüyor. Yukarıda tarif edilen reaksiyon koşulları, en fazla dört günde (yaklaşık 24 noktası) için bir proteolitik reaksiyon izlemek için kullanılır. 30 dk kadar her 5 dk örnekleme başlayın, sonra 4 gün kadar 8 saat ve her 8 saat kadar sonra 2 saat kadar her 30 dakikada, her saat nokta. Parçalanma ürünleri ilk 12 saat içinde gösterilecektir ve alt tabaka 24 saat sonra tamamen hidrolize olması gerekir. Genişletilmiş reaksiyon inkübasyon sürelerinde daha işlenir reaksiyon ara, ayrık olan stabil reaksiyon ürünleri tanımlamak için izin verir. Lekelenme süreleri ve inkübasyon sıcaklığı optimal reaksiyon örnekleme sağlamak için modülasyonlu olması, araştırma sorusu ve verilen enzim-substrat çiftleri üzerinde var olarak. </li><li> Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi uzun lekelenme aralıkları arasında, MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra. </li></ol> II. Paleo-timecourse: Postdigproteolitik terminallerinin estion etiketleme <ol><li> (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla 50 ° C&#39;de 30 dakika inkübasyon ile 25 mM NH 4 HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) içinde DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır </li><li> (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla. </li><li> Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein tampon degişimi peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri için PepClean C-18 sıkma sütunları kullanın. </li><li> Çözülür / temizlenmiş peptid ürünler / proteinler 20 ul proteaz reaksiyon tamponu içinde (örneğin tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) değişimi (örn. tripsin tamamlanması için ilgi proteaz ve özeti: 0.04 nM; 37 ° C, 12 saat). </li><li> PepClean C-18 sıkma sütunlarla Temizleme parçalanma ürünleri. Bu adım, kalan proteaz aktiviteleri ortadan kaldıracaktır. </li><li> Çözülür / (tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz temizlenmiş peptid ürün değişiminde 1:1 (v / v) nihai H 2. 18 O. içeren </li><li> Önceki enzimi eklenmeyen bir sıfır zaman noktası numune alımı için: reaksiyon karışımı, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) Karışımı 0.5 ul. MALDI bir hedef plaka üzerinde Noktası numune ve (yaklaşık 5 dak) kuru kadar oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakın. </li><li> Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM örneğin, tripsin) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve bir kontrol olarak hizmet verecek. Birincialikot proteaz katalize 18 O-postdigestion etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve peptid ve protein ölçümü için kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz tarafından katalize olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, hiçbir etiketleme için bu örnek bekleniyor. </li><li> Reaksiyon alikotları çıkarırken ve bunları adım 7 altında açıklanan tespit ederek tepki uygulayın.) Zaman aralıklarında kadar formda görünüyor. Örneğin, tripsin tarafından katalize karboksil oksijen alışverişi tepkisini izlemek için bundan sonra başlangıçta yukarı 30 dakika ve her 15 dakika için her 5 dk gördü. </li><li> Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi yakalama uzun aralıklar arasında da MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra. </li></ol> III. Aleo-timecourse: karboksil gruplarının asit katalizörlü etiketleme <ol><li> 1:1 (v / v) t olarak 18 O-zenginleştirilmiş su ile tek tek peptidler (50 nM) inkübeo varlığında ya da% 0.1 yokluğunda (kontrol) (v / v) nihai trifluoroasetik asit (toplam hacim 30 ul). </li><li> Numune ile 48 gün süreyle günlük reaksiyon ürünlerinin doğrudan doğruya bir MALDI hedef üzerine alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) ve 0.5μl ile karışım 0.5 ul alikot eş-lekelenme plaka. </li><li> Lekelenme aralığında ve Bölüm B de aşağıda tarif edildiği gibi MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi için MALDI hedef plaka sunmak nihai reaksiyon zaman noktasında tespit sonra </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Kütle spektrumları 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB Sciex) üzerinde elde edilir. </li><li> Önce analiz, enstrüman ± 50 ppm ve maç için altı tepe asgari sayıda azami kütlesi ölçüm hatası toleransı ile peptid standartları karışımı (AB Sciex TOF / TOF cihazları kalibrasyonu için Kütle Standartları Kiti) ile kalibre edilir. </li><li> MS spektrumları (kütle aralığı2,000 kabul edilebilir bir temel pik yoğunluğu aralığı ile adım büyüklüğü 50) - 45,000; 400 - 3.800 - 4.000 m / z) ayarlanabilir bir lazer yoğunluğu (3,400 pozitif iyon modunda kullanarak üç nüsha halinde elde edilir. Tek çekim 400 toplam çekim / spektrumu, alt-spektrumları amacıyla elde edilen, 800 alt-spektrumları sonra yürürlüğe girer koşulları durdurmak (geçmek veya başarısız) satın alınan veya 400 alt-spektrumları geçiş kabul kriterleri. Düşük miktarda numune halinde ya da kompleks biyolojik kökenli varlığında MS tespiti aralığının alt ucunun 800 m / z için yükseltilmiş olmalıdır. Buna ek olarak, LC ayrımı ile ya da yukarıda anlatıldığı gibi, bir örnek temizleme adımı ile tuz ve diğer müdahale bileşikleri çıkarmak için gerekli olabilir. </li><li> MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explorer veri toplama yazılımı ihraç ve spektral işleme ve pik algılama için MASCOT Distiller yazılımı (Matrix Bilimi) kullanır bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi, içine alınır. İzotopik zarflardeconvoluted ve otomatik olarak Mason et al. 12 tarafından tanımlanan ve grup 9 ile uyumlu bir benzer bir algoritma kullanılarak belirlenmiştir 18 O-birleşme oranını göstermektedir. Alternatif olarak, bu tür ZoomQuant 13 ve 14 engerek gibi yazılım araçları, hem de bu tür ticari yazılım paketleri BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) ve Maskot Distiller kantitasyonu Araç Kutusu gibi (Matrix Bilim) 18 O-tipi verileri 15,16 deconvolute yapabilirsiniz. 18 O-şirketleşme oranları (yani, 16 içeren peptidler bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları olarak ifade edilir O, tüm izotopik zarf ile 18 O ya da 1 18 O 2). </li><li> Her bir timecourse deney için, moleküler kütleleri ([M + H] +) tespit edilen tüm türlerin ilişkili peptid MS verileri ve dosyaları elde değerler 100 ppm kütle genişlikte binned birer. </li><li> Aen t üç [M + H] + bir depo doldurmak için gerekli ayarlanır. Bilinen substratlar olması halinde, kutu listesi filtrelenmiş EXPASY FindPept aracını 17 (kullanarak, substrat peptid sekansı ile tahmin proteolitik bölünme ürünleri bir liste ile karşılaştırılır <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) ve bir 200 ppm kitle hata kabul toleransı. </li><li> MS / MS spektrumları FindPept araç ve onlarla ilgili 18 O-birleştirmeleri var bin değerler için öngörülen parçalanma ürünleri tüm kütle değerleri için elde edilir. MS / MS veri kapalı modunda sabit lazer 4200 yoğunluğu ve CID-gaz ile 1kV reflektör pozitif iyon modunda 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer elde edilir. 50 çekim nokta başına 40 alt-spektrumları (2,000 kare / nokta toplam verimli) toplam alt spektrumları başına randomize desen kadar elde edilir. </li><li> MS / MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explo ihraç edilmektedirrer veri toplama yazılımı ve bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi ithal, zirveleri tespit edilir ve MS / MS tepe listeleri ilgili binned MS verileri ile ilişkilidir. </li><li> Peptid belirlenmesi için, MS / MS tepe listeleri aşağıdaki arama parametreleri ile MASCOT arama motorunu kullanarak SwissProt veritabanı karşı aranır: Hiçbir enzim spesifitesi, 150 ppm öncül iyon ve 0.2 Da fragmanı iyon kütle toleransları. </li><li> Peptit ayrıca kimlik Şevçenko ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi Y-dizi parça üzerinde karakteristik iyonlar 18 O-birleşme paternleri teyit ederek veri Explorer yazılımı (AB Sciex) kullanılarak doğrulanabilir. 18. </li></ol> Spektral Zaman ve 18 O-şirketleşme Arsalar C. Hazırlanması Spektral süresi araziler: Bir kullanarak her reaksiyon süresi noktası için MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) olarak Veri Explorer yazılım ihraç edilmektedir ASCII dosyalarımakro ve veri analizi ve grafik yazılım programı (originlab örneğin Kökeni) ithal ve şelale araziler (Şekil 3) olarak görüntülenir. 18 O-kuruluş grafikleri: Her binned peptid bölünme ürün için, bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları (16 O, 18 O 1 veya 18 O 2) her reaksiyon zamanı noktalarında ayıklanır ve (Şekil 4) Zamana karşı çizilen.

<ol>
	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics.">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li><li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics.">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li><li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics:+a+critical+review.">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li><li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+proteolytic+18O+labeling:+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates.">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li><li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples.">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li><li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1:+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling.">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li><li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3.">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156 (2009).</li><li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters.">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li><li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry.">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li><li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindPept,+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification.">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Izotop etiketleme ve zamana bağımlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştirerek, Paleo-timecourse yöntemi peptid ürünlerinin nesil dinamik bir analiz sağlar. Tahlil nicel ve nitel proteomikler çalışmalar için kararlı izotopik olarak etiketlenmiş bir peptit üretmek için ve proteotypic peptidler elde edildikleri kinetik değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, Paleo-timecourse spesifik olarak, fizyolojik olarak uygun koşullar altında ex vivo olarak prote...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzemenin adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Sütunlar </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI hedef plakası </td><td> AB Sciex </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB Sciex </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Malzemeler <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiyotretol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Endotelin-1 enzim (ECE-1) dönüştürme </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsin Altın </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Su-18 O, 97 atom% 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Trifloroasetik asit (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> AB Sciex TOF / TOF cihazları kalibrasyonu için Kütle Standartları Seti </td><td> AB Sciex </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Reaktifler

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Kararlı izotoplar biyolojik kütle spektrometresi için temel araçlardır. Tarihsel olarak, 18 Ey-kararlı izotopu yaygın 1-3 proteolitik enzimlerin katalitik mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik gelişiyle birlikte, istikrarlı izotopik zenginleştirilmiş su 18 O-atomların enzimatik katalize eklenmesi kantitatif protein ekspresyon düzeyleri (Fenselau ve Yao 4, Miyagi ve Rao 5 ve Ye tarafından gözden karşılaştırmak için popüler bir yöntem haline gelmiştir ark. 6). 18 O-etiketleme bir kimyasal için basit ve düşük maliyetli bir alternatif (örneğin iTRAQ, ICAT) ve metabolik (örneğin SILAC) etiketleme teknikleri 7 oluşturmaktadır. Kullanılan proteaz bağlı olarak, 18 O-etiketleme bölünme ürün 3, C-terminal karboksil grubunda, iki 18 O-atomuna kadar birleşme sonuçlanabilir </sup&gt;. Etiketleme Reaksiyon iki bağımsız süreçler, peptid bağı bölünme ve karboksil oksijen değişiminin reaksiyon 8 ayrılabilir. Bizim paleo (p rotease-bir 18 O-zenginleştirilmiş su mploying ssisted l abeling e) enzimatik 18 O-etiketleme adaptasyonu, biz farklı izotop imzaları verim 50% 18 O-zenginleştirilmiş su kullanılmıştır. Yüksek çözünürlüklü ile kombinasyon halinde matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu zaman-of-flight tandem kütle spektrometresi (MALDI-TOF/TOF MS / MS), karakteristik izotop zarf özgüllük yüksek düzeyde bir bölünme ürünleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz daha önce proteolitik reaksiyonlar 10-11 algılamak ve karakterize endojen proteazlar 9 ve izlemek için paleo-metodolojisi kullanılmıştır. Paleo proteolitik bölünme reaksiyonu özünü kodlar yana, deneysel kurulum basit ve biyokimyasal Enri olduğunuklevaj ürünlerinin chment adımlar atlatılabilir. Paleo-yöntem kolaylıkla proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerini ve fizyolojik koşulları temsil karmaşık biyolojik örneklerde proteoliz (ii) analizi izlemek (i) zaman ders deneyler kadar uzatılabilir. Paleo-timecourse deneyler karmaşık proteolitik yolağı reaksiyonlarda hız sınırlayıcı işlem adımları ve reaksiyon ara tanımlamak için yardım. Buna ek olarak, reaksiyon paleo-bize bu tür kendi parçalanma ürünleri rebind ve bir ikinci 18 O-atomu ile birleşmesiyle katalize etmek için yeteneğine sahip serin proteaz tripsin gibi proteolitik enzimlerin belirlemesini sağlar. Böyle bir &quot;çift etiketleme&quot; enzim postdigestion 18 peptidler özel olarak karboksil oksijen değişim reaksiyonu ile etiketlenmiş olduğu O-etiketleme için de kullanılabilir. Bizim üçüncü strateji enzimler ötesinde 18 O-zenginleştirilmiş su istihdam etiketleme uzatır ve 18 O-izotop işareti tanıtmak asidik pH koşullarında kullanırpeptidler içine atures.

Biz dinamik proteolitik enzimler tarafından üretilen peptit parçalanma ürünleri içine 18 O-kararlı izotoplar dahil izlemek için paleo-timecourse iş akışı kullanılır. Sunulan yaklaşım nispeten farklı substrat ve proteaz kombinasyonları için proteolitik işleme yolları incelemek için çok yönlü bir araçtır. Reaksiyon boyunca art arda proteolitik reaksiyonlar alınarak, Paleo-timecourse deney substrat ve ürün bolluk zaman çözüme anlık ve işleme ayrıntıları sağlar. Co-lekelenme...

Watch this Scientific Journal Video about Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water at JoVE.com

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Istihdam izotop etiketleme iş akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş su (LEO-iş akışları) nicel ve nitel proteomik çalışmaları için çok yönlü araçlar vardır. (Paleo) proteaz-destekli iş akışlarında,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomları proteazları aracılığıyla proteolitik bölünme ve karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar tarafından tanıtıldı. Asit katalizörlü (aleo) iş akışında<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomları düşük pH&#39;da karboksil oksijen alışverişi tarafından tanıtıldı.

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş Su

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K Görüntüleme.  Boston Biomedical Research Institute. Istihdam izotop etiketleme iş akışları 18 O-zenginleştirilmiş su (LEO-iş akışları) nicel ve nitel proteomik çalışmaları için çok yönlü araçlar vardır. (Paleo) proteaz-destekli iş akışlarında, 18 O-atomları proteazları aracılığıyla proteolitik bölünme ve karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar tarafından tanıtıldı. Asit katalizörlü (aleo) iş akışında 18 O-atomları düşük pH...

Video: Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biyoloji

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Morris Su Labirent Deney

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases, which is what we do during our quality control procedures. In this assay, casein acts as a substrate. When the protease we are testing digests casein, the amino acid tyrosine is liberated along with other amino acids and peptide fragments. Folin and Ciocalteus Phenol, or Folin's reagent primarily reacts with free tyrosine to produce a blue colored chromophore, which is quantifiable and measured as an absorbance value on the spectrophotometer. The more tyrosine that is released from casein, the more the chromophores are generated and the stronger the activity of the protease. Absorbance values generated by the activity of the protease are compared to a standard curve, which is generated by reacting known quantities of tyrosine with the F-C reagent to correlate changes in absorbance with the amount of tyrosine in micromoles. From the standard curve the activity of protease samples can be determined in terms of Units, which is the amount in micromoles of tyrosine equivalents released from casein per minute.
To view this article in Chinese, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">click here</a>

Sigma&#039;s Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases.

Sigma&#39;nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Yapay Görme Yaklaşımı Kullanarak TEM İş Akışları, Sonuç Analizi ve Veri Yönetimi

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Yazar Spotlight: Transmisyon Elektron Mikroskobu İş Akışlarına, Sonuç Analizine ve Veri Yönetimine Yapay Görme Yaklaşımı  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.