Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

Os apresentados Leo-workflows permitem a rotulagem de isótopos estáveis ​​de proteína digere e peptídeos sintéticos. Estas experiências de cursos de tempo (Figura 1) são aplicáveis ​​a estudos comparativos e quantitativa do proteoma, bem como pesquisas protease. Cada fluxo de trabalho é constituído por duas etapas experimentais (figura 2): A) O tempo de amostragem do respectivo resolvido 18O-stable isotope reacção codificado (protease catalisada clivagem do péptido; protease catalisada reacção de permuta de oxigénio carboxilo; catalisada por ácido a troca de oxigénio carboxil reacção) e B), análise por espectrometria de massa e a representação gráfica de 18 S-cinética de incorporação. TimeCourse Experimentos A. I. paleo-TimeCourse: rotulagem Protease catalisada de clivagens proteolíticas <ol><li> (Opcional) ligações de dissulfureto de proteínas (10 ^ M) e os péptidos (250 nM) são reduzidas com DTT (concentração final 2,5 mM)em 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recentemente preparada) por incubação durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas livres são alquiladas com iodoacetamida (concentração final 10 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 por incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Dependendo protease de interesse, proteína / peptídeo soluções precisam ser limpos-se para remover o tampão residual e agente de alquilação. Use colunas PepClean C-18 (Thermo rotação) para a limpeza do peptídeo e concentradores Vivaspin centrífuga (Sartorius) para troca de tampões para as amostras de proteína. </li><li> Redissolver / peptídeos / proteínas de câmbio em 20 ul de tampão de reacção da protease (ECE-1: 50 mM de MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contendo 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Retirar uma amostra de ponto de tempo zero, antes da adição da protease: Misturar 0,5 ul da mistura de reacção e 0,5 ul alfa ciano-4-hidroxicinâmicoácido matriz (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Ponto de amostra numa placa de Opti-TOF MALDI alvo 384 (AB SCIEX) e deixar as gotas de solvente à temperatura ambiente até estar seco (cerca de 5 min). </li><li> Dividir a solução de reacção em duas aliquotas. A primeira alíquota será incubado com a protease de interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM), à temperatura ambiente ou a temperatura recomendada para a enzima em particular. A segunda alíquota serão incubadas sem protease e servirá como amostra de controlo. A primeira alíquota da amostra representa um padrão para a protease catalisada 18 O-rotulagem e podem ser usados ​​para identificação de péptidos e proteínas, a detecção de actividades proteolíticas e monitorização das reacções de clivagem proteolitica. A segunda alíquota é utilizada para demonstrar que 18 O-incorporação é induzida pela protease e, portanto, nem a rotulagem nem clivagem é esperado para esta amostra. </li><li> Seguir a reacção por remoção de aliquotas da reacção e localizá-los como described no passo 5 em intervalos de tempo como parece em forma. As condições de reacção descritas acima são utilizados para monitorizar a reacção proteolítica por até quatro dias (aproximadamente 24 pontos). Iniciar a amostragem a cada 5 min até 30 min, em seguida, detectar a cada 30 minutos até 2 horas, depois a cada hora até 8 horas e a cada 8 horas até 4 dias. Produtos de clivagem deve aparecer dentro do primeiro 12 hr e do substrato deve ser completamente hidrolisada após 24 hr. Tempos de incubação prolongados de reacção permitem definir os produtos de reacção que são estáveis ​​discretos a partir de intermediários da reacção, os quais são posteriormente processados. Dependendo questão de pesquisa e dados enzima-substrato pares, manchar vezes e temperatura de incubação tem que ser modulada para assegurar amostragem reação ideal. </li><li> Após o ponto de tempo final de reacção é manchado ou em intervalos longos entre manchar, a placa alvo de MALDI é submetido a análise MALDI-TOF/TOF MS / MS como descrito a seguir (Secção B). </li></ol> II. Paleo-TimeCourse: Postdigrotulagem estion de terminais proteolíticas <ol><li> (Opcional) ligações de dissulfureto de proteínas (10 ^ M) e os péptidos (250 nM) são reduzidas com DTT (concentração final 2,5 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos preparados na hora) por incubação durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas livres são alquiladas com iodoacetamida (concentração final 10 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 por incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Dependendo da protease de interesse, proteína / peptídeo soluções precisam de ser limpas-se para remover o tampão residual e do agente de alquilação. Use colunas PepClean C-18 de spin para limpeza de peptídeo e Vivaspin concentradores centrífugos para troca de tampão proteína. </li><li> Redissolver / trocar os produtos limpa-up peptídeos / proteínas em 20 ul de tampão de reacção (por exemplo, protease tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digestão com protease de interesse para finalização (por exemplo, tripsina: 0,04 nM, 37 ° C, 12 hr). </li><li> Limpeza produtos de clivagem com colunas PepClean C-18 spin. Esta etapa irá eliminar atividades de protease residuais. </li><li> Redissolver / trocar os produtos limpa-up peptídicas em 20 ul de tampão de reacção da protease (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contendo 1:1 (v / v) final H 2 O. 18 </li><li> Retirar uma amostra de ponto de tempo zero, antes da adição da enzima: mistura de 0,5 ul da mistura de reacção e 0,5 ul alfa matriz de ácido ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Ponto de amostra numa placa alvo de MALDI e deixar as gotas de solvente à temperatura ambiente até estar seco (cerca de 5 min). </li><li> Dividir a solução de reacção em duas aliquotas. A primeira alíquota será incubado com protease de interesse (por exemplo, tripsina: 0,04 nM), à temperatura ambiente ou a temperatura recomendada para a enzima em particular. A segunda alíquota serão incubadas sem protease e vai servir como um controlo. O primeiroalíquota representa uma amostra padrão de etiquetagem 18 protease catalisada postdigestion O-e pode ser utilizado para a quantificação de peptídeos e proteínas. A segunda alíquota é utilizada para demonstrar que 18 O-incorporação é catalisada pela protease e, portanto, não é esperado de rotulagem para esta amostra. </li><li> Seguir a reacção por remoção de aliquotas da reacção e localizá-los, tal como descrito no passo 7.) Em intervalos de tempo como parece adequada. Por exemplo, nós descoberto inicialmente a cada 5 min durante um período máximo de 30 minutos e a cada 15 minutos depois disso para monitorizar a reacção de permuta de oxigénio carboxil catalisada pela tripsina. </li><li> Após o ponto de tempo final de reacção é manchado ou em intervalos longos entre manchar a placa alvo de MALDI é submetido a análise MALDI-TOF/TOF MS / MS como descrito a seguir (Secção B). </li></ol> III. Aleo TimeCourse-: catalisada por ácido de rotulagem de grupos carboxilo <ol><li> Incubar péptidos individuais (50 nM) com 1:1 (v / v) de água 18 O-enriquecido em tele presença ou ausência (controlo) de 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético final (volume total 30 ul). </li><li> Os produtos de reacção de amostra diários durante 48 dias, por co-spotting uma alíquota de 0,5 ul da mistura de alfa 0.5μl com matriz de ácido ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA), directamente para um alvo MALDI placa. </li><li> Entre os intervalos de manchas e após avistar, do ponto final do tempo de reação apresentar MALDI placa-alvo para MALDI-TOF/TOF análise MS / MS, conforme descrito abaixo na Secção B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS de Aquisição de Dados e Análise <ol><li> Espectros de massa são adquiridos em um 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Antes da análise, o instrumento é calibrado com uma mistura de padrões de peptídeos (Kit de calibração para Padrões de Massa de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos) com um máximo de tolerância do erro de medição de massa de ± 50 ppm e um número mínimo de seis picos para corresponder. </li><li> Os espectros de MS (intervalo de massas400 - 4000 m / z) são adquiridos em triplicado usando o modo de ião positivo com uma intensidade do laser ajustável (3400 - 3800; tamanho do passo 50), com uma gama aceitável a intensidade de base do pico de 2.000 - 45.000. Fotos individuais são adquiridos para espectros sub-, com 400 tiros total / espectro, parar condições entram em vigor depois de 800 sub-espectros são adquiridos (aprovação ou reprovação) ou 400 sub-espectros critérios de aceitação da passagem. No caso de amostras de baixa abundância ou na presença de complexos origens biológicas da extremidade inferior da gama de detecção MS deve ser aumentada para 800 m / z. Além disso, pode ser necessário para remover o sal e outros compostos que interferem com a etapa de limpeza de amostra, como descrito anteriormente, ou por separação por LC. </li><li> Arquivos de dados (MS. T2D arquivos) são exportados da Série Explorador 4000 software de aquisição de dados e importados para o nosso sistema de informações interno de laboratório, que utiliza software MASCOTE Distiller (Matrix Science) para processamento espectral e detecção de pico. Envelopes isotópicassão deconvoluted e 18 ó incorporação rácios automaticamente determinadas usando um algoritmo semelhante ao descrito por Mason et al. 12 e adaptado pelo nosso grupo de 9. Em alternativa, as ferramentas de software, tais como 13 e ZoomQuant Viper 14, bem como os pacotes de software comercial tais como BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Distiller Mascot Quantitation Toolbox (Matrix Science) pode deconvolute 18 O tipo de dados 15,16. 18 ó incorporação rácios são expressos como as contribuições relativas dos isótopos individuais espécies de péptidos (isto é, péptidos contendo 16 ó, 18 ou 18 O 1 O 2) a todo o envelope isotópica. </li><li> Para cada experiência TimeCourse, as massas moleculares ([M + H] +) para todas as espécies de péptidos detectados são extraídos a partir dos ficheiros de dados associados MS e os valores binned a uma largura de 100 ppm em massa. </li><li> AAo menos três [M + H] estão definidos para ser obrigado a preencher um escaninho. No caso de substratos conhecidos, a lista bin filtrado é comparado com uma lista de produtos de clivagem proteolítica previsto a partir da sequência de péptido de substrato utilizando a ferramenta FindPept ExPASy 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) e um 200 ppm em massa de tolerância de erro aceitação. </li><li> Espectros MS / MS são adquiridos para todos os valores de massa dos produtos de clivagem previstos pela ferramenta FindPept e para valores de bin que têm 18 O-incorporações que lhes estão associados. MS / MS de dados são adquiridos em 4800 MALDI Analyzer TOF / TOF em 1kV modo íon positivo refletor, com uma intensidade do laser fixa de 4200 e de gás-CID em modo desligado. 50 disparos são adquiridos num padrão aleatório por espectros de sub--se a um total de 40 sub-espectros por local (produzindo um total de 2.000 disparos / local). </li><li> MS / MS arquivos de dados (. T2D arquivos) são exportados a partir da série 4000 Explorer software de aquisição de dados e importados para o sistema de informação laboratorial em casa, os picos são detectados e listas de MS / MS dos picos estão associados com os dados correspondentes binned MS. </li><li> Para identificação peptídeo, listas de MS / MS de pico são pesquisados ​​no banco de dados SwissProt usando o motor de busca MASCOTE com os parâmetros de pesquisa a seguir: não especificidade enzima, 150 ppm e íon precursor 0,2 fragmento Da tolerâncias de massa de íons. </li><li> Identificações peptídeos podem adicionalmente ser validado com o Data Explorer software (AB SCIEX), confirmando as características 18 O incorporação padrões de íons através y série de fragmentos, como descrito por Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Preparação do Tempo espectral e 18 Ó incorporação de parcelas Parcelas de tempo espectrais: arquivos de dados (MS. T2D arquivos) para cada ponto de tempo de reação são exportados do software Data Explorer como ASCII-arquivos usando ummacro e importados para um programa de análise de dados e software gráfico (por exemplo de origem por OriginLab) e exibido como parcelas de cascata (Figura 3). 18 O-incorporação parcelas: Para cada um dos produtos de clivagem do péptido binned, as contribuições relativas das espécies de isótopos de péptidos individuais (16 O, 18 O 18 O 1 ou 2) são extraídos através de todos os pontos de tempo de reacção e representada graficamente em função do tempo (Figura 4).

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	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. 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G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Através da combinação de rotulagem isótopo estável e de elevada resolução em espectrometria de massa de uma forma resolvida no tempo, o método Paleo TimeCourse-permite uma análise dinâmica da geração de produtos peptídicos. O ensaio pode ser utilizado para gerar péptidos marcados isotopicamente estáveis ​​para estudos quantitativos e qualitativos proteómica e avaliar a cinética através da qual os péptidos proteotypic são gerados. Além disso, Paleo TimeCourse foi concebido para avaliar as vias pr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Colunas PepClean C-18 de Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 placa-alvo MALDI </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Materials <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> O ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamida (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Enzima conversora de endotelina-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsina Ouro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Água-18 O, 97% átomo de 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Kit Padrões de massa para Calibração de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Isótopos estáveis ​​são ferramentas essenciais em espectrometria de massa biológica. Historicamente, 18 O-isótopos estáveis ​​têm sido extensivamente utilizadas para estudar os mecanismos catalíticos das enzimas proteolíticas 1-3. Com o advento da espectrometria de massa à base de proteomics, a incorporação catalisada enzimaticamente, de 18 átomos de O-água isotopicamente enriquecido estável tornou-se um método popular para comparar quantitativamente os níveis de proteína de expressão (revisto por Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-rotulagem constitui uma alternativa simples e de baixo custo para produtos químicos (por exemplo iTRAQ, ICAT) e metabólicas (por exemplo, técnicas de SILAC) rotulagem 7. Dependendo da protease utilizada, 18 O-rotulagem podem resultar na incorporação de até dois átomos de O-18 no grupo carboxilo C-terminal do produto de clivagem 3 </sup&gt;. A reacção de marcação pode ser subdividido em dois processos independentes, a clivagem da ligação peptídica e a reacção de permuta de oxigénio carboxil 8. Em nossa Paleo (p rotease-a e Abeling ssisted l mploying 18 O enriquecido água) adaptação de enzimática 18 O rotulagem, utilizamos 50% de água 18 O enriquecido para produzir assinaturas isotópicas distintas. Em combinação com a alta resolução de laser assistida por matriz de ionização de dessorção de tempo-de-voo espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), os envelopes isotópicos característicos podem ser usados ​​para identificar os produtos de clivagem com um elevado grau de especificidade. Nós já ter usado o Paleo metodologia para detectar e caracterizar proteases endógenas 9 e monitorar reações proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica a própria essência da reação de clivagem proteolítica, a instalação experimental é Enri simples e bioquímicoschment passos de produtos de clivagem podem ser contornados. A paleo-método pode ser facilmente estendido para (i) o curso experiências que monitoram a dinâmica de reações de clivagem proteolítica e (ii) a análise da proteólise em amostras biológicas complexas que representam condições fisiológicas. Paleo-TimeCourse experimentos ajudar a identificar passos limitação de taxa de processamento e intermediários de reação em complexas reações via proteolíticas. Além disso, a reacção de Paleo permite-nos identificar as enzimas proteolíticas como a tripsina serina-protease que é capaz de associar novamente os seus produtos de clivagem e de catalisar a incorporação de um 18 segundo O-átomo. Tais &quot;etiquetagem dupla&quot; enzimas podem ser utilizados para postdigestion 18 O-rotulagem, em que os péptidos marcados são exclusivamente através da reacção de oxigénio carboxil troca. A nossa estratégia terceira estende rotulagem empregando água 18 ó enriquecido além enzimas e utiliza condições de pH ácido para introduzir 18 sinal isótopo estável O-Atures em peptídeos.

Utilizou-se o fluxo de trabalho Paleo TimeCourse para monitorar dinamicamente a incorporação de 18 O-isótopos estáveis ​​em produtos de clivagem de péptidos geradas por enzimas proteolíticas. A abordagem apresentada é uma ferramenta versátil para estudar comparativamente vias de processamento proteolíticas de diferentes substratos e combinações de protease. Por amostragem reacções proteolíticas repetidamente durante o curso da reacção, o experimento Paleo TimeCourse fornece instantâneos r...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Fluxos de trabalho de isótopos estáveis ​​de rotulagem empregando<sup&gt; 18</sup&gt; O-água enriquecida (Leo-fluxos de trabalho) são ferramentas versáteis para estudos quantitativos e qualitativos proteômica. Nos fluxos de trabalho protease assistidas (Paleo),<sup&gt; 18</sup&gt; O-átomos são introduzidos por clivagem proteolítica e reacções de permuta de oxigénio carboxilo mediada por proteases. No catalisada por ácido de fluxo de trabalho (Aleo),<sup&gt; 18</sup&gt; O-átomos são introduzidos por troca de oxigénio carboxilo a pH baixo.

Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando<sup&gt; 18</sup&gt; O-enriquecido Água

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

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