Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR sovvenzione 1R01DE019796.

Le presentati leo-flussi di lavoro consentono una etichettatura degli isotopi stabili di proteine ​​e peptidi sintetici digerisce. Questi esperimenti tempo (Figura 1) sono applicabili a comparativi e quantitativi studi di proteomica e la ricerca della proteasi. Ogni flusso di lavoro è costituito da due fasi sperimentali (Figura 2): A) Il tempo di campionamento risolta del rispettivo 18 O-isotopi stabili con codifica reazione (proteasi-catalizzata clivaggio peptide; proteasi-catalizzata carbossilico reazione di scambio di ossigeno, acido-catalizzata scambio di ossigeno carbossilico reazione) e B) analisi mediante spettrometria di massa e la rappresentazione grafica di 18-O incorporazione cinetica. A. TimeCourse Esperimenti I. Paleo-TimeCourse: Proteasi-catalizzata etichettatura dei cleavages proteolitici <ol><li> (Opzionale) legami disolfuro di proteine ​​(10 mM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale 2.5 mM)in 25 mM NH 4 HCO 3 (sia preparata) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C. </li><li> (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare PepClean colonne C-18 di spin (Thermo) per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori (Sartorius) per scambiare i buffer per campioni di proteine. </li><li> Ridisciogliere / peptidi / proteine ​​di cambio in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell&#39;aggiunta della proteasi: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamicoacido matrice (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Caricare il campione su un Opti-TOF 384 piastra segnale MALDI (AB SCIEX) e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 minuti). </li><li> Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con la proteasi di interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura raccomandata per il particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come campione di controllo. La prima aliquota rappresenta un campione standard di proteasi-catalizzata 18 O-etichettatura e può essere utilizzato per l&#39;identificazione di peptidi e proteine, rilevamento di attività proteolitiche e monitoraggio delle reazioni di scissione proteolitica. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è indotta dalla proteasi, quindi, né etichettatura né scissione è prevista per questo esempio. </li><li> Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come described sotto passaggio 5 a intervalli di tempo, come sembra in forma. Le condizioni di reazione descritte sopra sono usati per controllare una reazione proteolitica fino a quattro giorni (circa 24 punti). Avviare il campionamento ogni 5 min fino al 30 min, quindi individuare ogni 30 minuti fino a 2 ore, poi ogni ora fino a 8 ore e ogni 8 ore fino a 4 giorni. Prodotti di scissione dovrebbe apparire entro i primi 12 ore e il supporto deve essere completamente idrolizzato dopo 24 ore. Estesa tempi di incubazione di reazione permettono di definire i prodotti di reazione stabili che sono discreti da intermedi di reazione, che vengono ulteriormente elaborati. Seconda domanda di ricerca e di proposta enzima-substrato coppie, i tempi di individuazione e temperatura di incubazione devono essere modulata per assicurare campionamento ottimale reazione. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistamento, la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B). </li></ol> II. Paleo-TimeCourse: Postdigetichettatura estion di Termini proteolitici <ol><li> (Facoltativo) legami disolfuro di proteine ​​(10 pM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale di 2,5 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 (entrambi preparati) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C. </li><li> (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare le colonne PepClean C-18 di spin per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori per lo scambio delle proteine ​​buffer. </li><li> Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici / proteine ​​in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi tripsina (es: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digerire con proteasi di interesse al completamento (es. tripsina: 0,04 nM; 37 ° C, 12 ore). </li><li> Scissione Cleanup con colonne PepClean C-18 di spin. Questo passo sarà eliminare le attività residue della proteasi. </li><li> Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 O. 18 </li><li> Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell&#39;aggiunta di enzima: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Spot campione su una piastra MALDI e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 min). </li><li> Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con proteasi di interesse (ad esempio tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura consigliata per la particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come controllo. Il primoUn&#39;aliquota rappresenta un campione standard per proteasi-catalizzata 18 O-postdigestion etichettatura e può essere utilizzato per la quantificazione delle proteine ​​e peptidi. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è catalizzata dalla proteasi, pertanto, alcuna etichettatura è prevista per questo esempio. </li><li> Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come descritto al punto 7.) Ad intervalli di tempo, come sembra in forma. Per esempio, abbiamo scoperto inizialmente ogni 5 minuti fino a 30 minuti e ogni 15 minuti dopo che per monitorare il carbossile reazione di scambio di ossigeno catalizzata da tripsina. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistare la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B). </li></ol> III. Aleo-TimeCourse: acido-catalizzata etichettatura dei gruppi carbossilici <ol><li> Incubare singoli peptidi (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-acqua arricchita in tegli presenza o assenza (controllo) del 0,1% (v / v) finale di acido trifluoroacetico (volume totale 30 microlitri). </li><li> I prodotti di reazione del campione al giorno per 48 giorni per co-spotting una aliquota 0,5 microlitri della miscela con 0.5μl di alfa ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% TFA) direttamente su un bersaglio MALDI piastra. </li><li> Tra gli intervalli di spotting e dopo aver individuato il punto finale tempo di reazione presenta una piastra segnale per MALDI-TOF/TOF MALDI MS / MS, come descritto di seguito nella sezione B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS di acquisizione dati e analisi <ol><li> Gli spettri di massa sono invece acquistati su MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Prima dell&#39;analisi, lo strumento è tarato con una miscela di standard peptide (Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti), con una tolleranza massima di errore di massa di misura di ± 50 ppm e un numero minimo di sei picchi da abbinare. </li><li> MS (range di massa400 - 4.000 m / z) sono acquisiti in triplice copia utilizzando la modalità di ioni positivi con una intensità del laser regolabile (3.400 - 3.800; passo di 50) con un accettabile campo di intensità base del picco di 2.000 - 45.000. Scatti singoli vengano acquistate per sub-spettri, con 400 colpi totali / spettro, stop condizioni entreranno in vigore dopo 800 sub-spettri vengono acquisiti (positivo o negativo) o 400 sub-spettri criteri di accettazione passaggio. In caso di bassa abbondanti campioni o in presenza di complessi ambienti biologici l&#39;estremità inferiore del campo di rilevamento MS dovrebbe essere portato a 800 m / z. Inoltre, può essere necessario rimuovere sale e altri composti che interferiscono con un passo di pulitura campione come descritto in precedenza, o mediante separazione LC. </li><li> MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla serie 4000 di acquisizione dati e software Explorer importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, che utilizza il software Distiller MASCOT (Matrix Science) per l&#39;elaborazione spettrale e il rilevamento di picco. Buste isotopichesono deconvoluto e 18 O-incorporazione coefficienti determinati automaticamente utilizzando un algoritmo simile a quello descritto da Mason et al. 12 e adattato dal nostro gruppo 9. Alternativamente, strumenti software come ZoomQuant Viper 13 e 14, nonché pacchetti software commerciali quali come Bioworks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Mascot Distiller quantificazione Toolbox (Matrix Science) può deconvolute 18 O-tipo di dati 15,16. 18 O-incorporazione rapporti sono espressi come i contributi relativi delle singole specie isotopi peptide (cioè, peptidi contenenti almeno il 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) per la busta isotopica. </li><li> Per ogni esperimento TimeCourse, le masse molecolari ([M + H] +) per tutte le specie peptidiche rilevati vengono estratti dai file di dati associati MS ed i valori categorizzata in una larghezza 100 ppm di massa. </li><li> Lat almeno tre [M + H] + sono impostati per essere tenuti a compilare un bidone. Nel caso di supporti noti, l&#39;elenco bin filtrato viene confrontato con l&#39;elenco dei prodotti di scissione proteolitica previsto dalla sequenza di peptide substrato utilizzando lo strumento ExPASy FindPept 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) e 200 ppm di massa tolleranza di errore di accettazione. </li><li> MS / MS sono acquisiti per tutti i valori di massa dei prodotti di scissione previsti dallo strumento FindPept e per valori bin che hanno 18 O-incorporazioni essi associati. MS / MS dati sono stati acquisiti in MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer in modalità riflettore 1 kV ione positivo, con una intensità del laser fissa di 4200 e CID-gas in modalità off. 50 scatti vengono acquisiti in un modello randomizzato per ogni sub-spettri fino a un totale di 40 sotto-spettri per spot (producendo un totale di 2.000 scatti / spot). </li><li> MS / MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla Serie 4000 Explorer software di acquisizione dati e importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, i picchi vengono rilevati e MS / MS liste di punta sono associati con i corrispondenti dati raggruppate MS. </li><li> Per l&#39;identificazione peptide, MS / MS liste di picco sono confrontati con il database SwissProt utilizzando il motore di ricerca MASCOT con i seguenti parametri di ricerca: nessuna specificità dell&#39;enzima, 150 ppm di ione precursore e 0,2 Da frammento tolleranze di massa di ioni. </li><li> Identificazioni peptidi possono inoltre essere convalidati utilizzando il software Data Explorer (AB SCIEX) confermando le caratteristiche 18 O-incorporazione modelli in tutto y serie frammenti ionici come descritto da Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Preparazione del Tempo spettrale e 18 O-incorporazione Personaggi Grafici spettrali tempo: MS file di dati (. T2D file) per ogni punto il tempo di reazione vengono esportati dal software Data Explorer come ASCII-file utilizzando unmacro e importato in un programma di analisi dei dati e software di grafica (ad esempio origine OriginLab) e visualizzati come grafici a cascata (Figura 3). 18 O-incorporazione piazzole: Per ogni prodotto peptide cestinate scissione, dei contributi delle singole specie isotopi peptide (16 O 18 O 18 O 1 o 2) vengono estratti attraverso punti di tutti i tempi di reazione e funzione del tempo (Figura 4).

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J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Combinando etichettatura isotopo stabile e ad alta risoluzione spettrometria di massa in un tempo risolto modo, il paleo-TimeCourse metodo permette una analisi dinamica della generazione di prodotti peptidici. Il saggio può essere utilizzato per generare peptidi marcati con isotopi stabili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica e di valutare la cinetica con cui vengono generati peptidi proteotypic. Inoltre, Paleo-TimeCourse è progettato per valutare percorsi proteolitici sotto specifica, fisiologicamente r...

<table border="1"><tbody><tr><td> Denominazione del prodotto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Colonne PepClean C-18 Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI obiettivo piastra </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Materiali <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Alfa ciano-4-idrossicinnamico acido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> L&#39;endotelina-1 enzima di conversione (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsina Oro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Acqua-18 O, 97% atomo 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Isotopi stabili sono strumenti essenziali in spettrometria di massa biologica. Storicamente, 18 O-isotopi stabili sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi catalitici di enzimi proteolitici 1-3. Con l&#39;avvento di spettrometria di massa a base di proteomica, la enzimaticamente catalizzata incorporazione di 18 atomi di O-da stabile l&#39;acqua arricchita con isotopi è diventato un metodo popolare per confrontare quantitativamente i livelli di espressione di proteine ​​(recensione da Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-etichettatura costituisce un&#39;alternativa semplice ea basso costo per chimica (ad esempio iTRAQ, ICAT) e metaboliche (es. SILAC) tecniche di etichettatura 7. A seconda della proteasi utilizzato, 18 O-etichettatura può provocare l&#39;incorporazione di fino a due atomi di O-18 nel C-terminale gruppo carbossilico del prodotto di scissione 3 </sup&gt;. La reazione di marcatura può essere suddiviso in due processi indipendenti, la scissione del legame peptidico e il carbossile reazione di scambio di ossigeno 8. Nel nostro Paleo (p rotease-a ssisted e Abeling l mploying 18 O arricchita di acqua) l&#39;adeguamento delle enzimatica 18 O-etichettatura, abbiamo utilizzato il 50% 18 O arricchita di acqua per ottenere le firme isotopiche distintive. In combinazione con alta risoluzione matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo spettrometria di massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), le buste isotopici caratteristici possono essere utilizzati per identificare prodotti di taglio con un elevato grado di specificità. Abbiamo in precedenza hanno usato il Paleo-metodologia per individuare e caratterizzare proteasi endogene 9 e monitorare le reazioni proteolitici 10-11. Poiché Paleo codifica l&#39;essenza stessa della reazione taglio proteolitico, la configurazione sperimentale è enri semplice e biochimichepassi chment di prodotti di dissociazione può essere aggirato. Il Paleo-metodo può essere facilmente esteso per esperimenti di tempo (i) del corso che controllano la dinamica delle reazioni taglio proteolitico e (ii) l&#39;analisi della proteolisi in campioni biologici complessi che rappresentano le condizioni fisiologiche. Paleo-TimeCourse esperimenti di aiuto per identificare il tasso di limitazione fasi di lavorazione e prodotti intermedi di reazione in complesse reazioni pathway proteolitici. Inoltre, il paleo-reazione ci permette di identificare enzimi proteolitici come la tripsina serina proteasi che è in grado di associare nuovamente i suoi prodotti di scissione e catalizzare l&#39;incorporazione di un secondo 18 O-atomo. Tali &quot;doppio&quot; etichettatura enzimi possono essere usati per postdigestion 18 O-etichettatura, in cui i peptidi sono etichettati esclusivamente dalla reazione carbossile scambio di ossigeno. La terza strategia si estende l&#39;etichettatura impiegando 18 O arricchita di acqua al di là degli enzimi e utilizza condizioni di pH acido per introdurre 18 O-stabile segno isotopoture in peptidi.

Abbiamo usato il Paleo-TimeCourse flusso di lavoro per monitorare in modo dinamico l&#39;incorporazione di 18 O-isotopi stabili in prodotti di dissociazione peptidici generati dagli enzimi proteolitici. L&#39;approccio presentato è uno strumento versatile per studiare comparativamente percorsi di elaborazione proteolitici per substrati diversi e combinazioni di proteasi. Campionando reazioni proteolitici ripetutamente nel corso della reazione, il paleo-TimeCourse esperimento fornisce istantanee risolta nel t...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano<sup&gt; 18</sup&gt; O-acqua arricchita (Leo-flussi di lavoro) sono strumenti versatili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica. In flussi di lavoro proteasi assistite (Paleo),<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomi sono introdotti da scissione proteolitica e carbossilici reazioni di scambio dell&#39;ossigeno mediata da proteasi. Nel acido-catalizzata (Aleo) del flusso di lavoro,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomi sono introdotti da scambio di ossigeno carbossile a pH basso.

Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando<sup&gt; 18</sup&gt; O arricchita di acqua

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K Views.  Boston Biomedical Research Institute. Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano 18 O-acqua arricchita (Leo-flussi di lavoro) sono strumenti versatili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica. In flussi di lavoro proteasi assistite (Paleo), 18 O-atomi sono introdotti da scissione proteolitica e carbossilici reazioni di scambio dell'ossigeno mediata da proteasi. Nel acido-catalizzata (Aleo) del flusso di lavoro, 18...