Bu çalışmaya katkıda ve en Yapısal Caffrey Membran ve Fonksiyonel Biyoloji Grup, geçmiş ve şimdiki üyeleri hem birçok kim vardır. Tüm için, ve özellikle Jingquan Tan ve Joseph Lyons, bizim en içten teşekkürlerimizi ve şükranlarımızı. Bu eser Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM75915, P50GM073210 ve U54GM094599) ve FP7 COST ve Marie Curie Eylemleri (CM0902 ve PIEF-GA-2009 hibeleri ile kısmen desteklenmiştir -235612).

1. Laboratuvar Kurulumu Öncesi hasat <ol><li> Hasat için hazırlık olarak, sıvı nitrojen ile kuru köpük Dewar girip hasat gerçekleşecek mikroskop yanına yerleştirin. </li><li> Batmak depolama disk, köpük Dewar içinde sıvı azot içinde, sonuna kadar açın ve tamamen soğumasını bekleyin. </li><li> Bir manyetik çubuk (şekil 5) üzerinde hasat edilmesi kristal uygun bir boyutta bir mikro monte edin. Bu taraftan birini bolus birkaç kristalleri toplamak için gerekli olduğu durumlar için hitap mikro-bağlar ile yüklenmiş yedek manyetik çubuklar bir dizi olması önemlidir. Yedek değneklerini her zaman mevcut olmalıdır. </li><li> Bir mikropipet, ipuçları ve hasat mikroskop yanına kristal büyümesi için kullanılır çökelti çözeltisi yerleştirin. Bu mezofaz kapsayacak şekilde ve iyice açıldığında kurumasını önlemek için gerekli olabilir. </li><li> Bankta bir defter ve kalem ile kapatın ve / veya mübilgisayarı açın. Bunlar, dondurucu soğutuldu, hasat edilmiş ve depolama yerleştirilir olarak kristallerin kalitesi, görünüm, yer, depolama disk numarasını vs ile ilgili gözlemler kaydetmek için kullanılır. </li><li> Asistan kişi açıkça takip edilecek protokol, çeşitli adımlar yer alacak hangi sırayla ve genel süreç içinde kendi rolünü anlamak gerekir hasat ile yardımcı varsa. </li></ol> Yerinde malzeme ve ekipman her ile bir sonraki görevi için: 2. Kristaller Contain Tabaklar ve Wells tanımlayın <ol><li> Harvestable kristalleri bulmak için en basit ve doğrudan bir yöntem ile normal ve çapraz polarize ışık ile bir mikroskop kullanılarak el ile kuyu kontrol etmektir. Mikroskop aydınlatıcı ışık yoğunluğunu ayarlama kristalleri bulmak yardımcı olabilir. </li><li> Alternatif olarak, plakaları, normal otomatik olarak tarandı ve olan bir görüntüleyici Polarize geçtid ışık kristaller aramak için de kullanılabilir. </li><li> Gözle değerlendirin bilgisayar monitörü dijital görüntüler kaydedildi. </li><li> Açıkçası boyutu, kalitesi ve dizüstü Mezofaz veya bir bilgisayarda kristalleri yere hasat ve kayıt yorum yapmak için kristaller olan kuyuları işaretlemek. </li><li> Görüntüleyici gelen hasat için kristalleri içeren plakayı çıkarın. </li></ol> 3. Kübik Mezofaz ile iyi açılması. Metod 1 Kristaller mezo yöntem ile büyür ki içinde cam levhalar sandviç plakaların (Şekil 2). Mezofaz ve orada kristaller erişmek için, bu da açmak için gereklidir. Bu iyi mühürler sonra kaldırılabileceğini üst coverglass kesmek için bir cam kesici alet kullanılarak yapılır. Kesme ve iyi bir kristalizasyon yerinden coverglass kaldırmak için birkaç yaklaşım vardır. Kullanmak için bir tip o tarafından diktef mezofaz olan kristal büyüyen bulunur. Bu, çok viskoz ve yapışkan kübik faz (Şekil 3A) veya daha fazla akışkan varyant, sünger faz (Şekil 3B) olabilir. Bu video yazıda kuyular açmak ve bu hosting malzemelerin hem kristalleri nasıl hasat göstermektedir. <ol><li> Bir ışık mikroskobu sahnede cam sandviç kristalizasyon plakası yerleştirin. </li><li> Boşluk yukarıda ve sadece iyi çevresi dışında bulunan iki konsantrik daireler ile hafifçe bir cam kesici takım skoru coverglass kullanma. Yeni bir kesme aleti ile, puanlama az uygulanan basınç gerektirir. Puan için gerekli basınç bile fractionally artıran yeni bir biri ile aracı yerine, bu genellikle 10 kuyu açtıktan sonra oluşur. </li><li> Iç coverglass serbest amacıyla iki attı çevreleri arasında boşluk içinde cam bölünmesi. Bu cam kırıkları ve toz bir sürü oluşturur. Bir nemlendirilmiş onları temizleyinkağıt havlu. </li><li> Ince uçlu cımbız ve uzak eğerek onunla ve iyi kapalı kavrayıp tarafından azat coverglass çıkarın. Bu durumda, kübik faz sıkışmış kalır ve iyi bir taban plakası üzerinde yerinde. </li><li> Şimdi kristal hasat kullanıma hazır kübik Mezofaz daha net bir görünüm elde etmek için yakınlaştırma. </li></ol> 4. Kübik Mezofaz bir Şey açılması. Metod 2 <ol><li> Iyi bir tarafında ve kendisi de üzerinden genişletmek coverglass içinde düz paralel çizgiler aracı skoru kesme cam kullanılması. Bu kolay cımbız erişim ve coverglass kaldırılması sağlar. </li></ol> Bu özel gösterimde coverglass yapışkan ayırıcı yüzey coverglass serbest içinde çatlaklar. Bu süreçte, coverglass pozisyonda geçer ve çöktürücü kübik faz ayrılır. Coverglass kaldırıldığı zaman çöktürücü bazı onunla birlikte gider. Biz bir maruz b ile solHerhangi Çevre Çöktürücü olmadan Mezofaz arasında Olus. Derhal, kuruma ve kristaller zarar verebilir bir faz değişim geçirmekte gelen Mezofaz önlemek için bir mikropipet kullanarak bolus üstüne 1 ul taze çökeltici ekleyin. Bolus artık kristal hasadı kullanılmak üzere hazırdır. 5. Sünger Faz bir Şey açılması. Başarısız Sünger fazı nedeniyle akış kabiliyetini ile çalışmak daha bağışlayıcı. Iyi kılcallık çevresi temas sünger aşamasında olduğunu akışı sonuçlar Mezofaz dışarı çıkartalım ve kristaller kaybedersiniz. Bu olay bir örneği, bu video klip de gösterilmiştir. <ol><li> Sünger aşamasında Yakınlaştır ve sünger aşamasında kristalleri bulmak için normal ve çapraz polarize ışık arasında ileri ve geri geçiş. </li><li> Iyi skoru açılması ve Bölüm 3&#39;te açıklandığı gibi coverglass kesmek için hazırlık. Bu süreçte, coverglass çatlaklar. Girişimiyi çatlak yönünde çöktürücü kaymalar açmak için yıkamada ve sonunda boşluk ile temas eder. Çöktürücü sünger fazı ve kaybolur kristaller yükünün bazı gider ile. </li></ol> Bu özel sekans olarak, mikroskop üzerinde tamamen çapraz polarize olmayan ve kristaller iyi ve içeriği görünür durumda kalmasını aynı zamanda parlak nesnelerin olarak görülebilir. 6. Sünger Faz bir Şey açılması. Başarılı olarak <ol><li> Sünger aşamasında Yakınlaştır ve hem normal hem de çapraz polarize ışık bir kristal tanımlamak. </li><li> Puan, Bölüm 4.1 &#39;de olduğu gibi, iyi kapsayan coverglass bir bölümünü kesip çıkarın. Eksik olarak çapraz polarize ışık kristal takip etmek için kullanılmaktadır. </li><li> Sadece çökelti çözeltisi dokunana kadar coverglass açıklıktan ve kuyuya kuru doku kağıt parçası tanıtın. Dikkatli çözümü uzakta Wickly neredeyse hepsi gitti ve sonra dokuyu kadar. Bu coverglass altında geri çekilmesi için, bir yerde hala kristal ile, kalan çökeltinin sünger fazı neden olur. </li><li> Puan, kesme ve Bölüm 4.1 &#39;de olduğu gibi bir cımbız coverglass geri kalanı ile kaldırın. Bu durumda, sünger faz böler; bazı coverglass için iyi ve bazı çubuklar kalır. Kristal coverglass üzerinde bolus yer almaktadır. Çok az Çöktürücü mevcut olmadığından, sünger faz kuruma olasılığı nedeniyle bir faz geçişi geçmesi başlar. Bu, bolus merkezine doğru göç eder çift kırılma bir halka olarak görülebilir. Hemen geçişi durdurmak için bolus uygulamasına çökeltici ekleyin. Bolus artık kristal hasat kullanıma hazırdır. </li></ol> 7. Kübik Faz Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller <ol><li> Açık kuyuda kübik faz bolus kristalleri bulmak için normal ve çapraz polarize ışık arasında ileri ve geri gidin. Ten fazla dört çift kırınım kristaller onun video dizisi Çapraz polarize ışık ile kübik faz bolus olarak görülebilir. </li><li> Kullanın cryo-loop (Şekil 5) hasat derhal Dewar sıvı nitrojen içine, kristaller için taze maruz Mezofaz soruşturmayla kristalleri balık ve sonra onları atılmak için, cryo-loop bulunan monte. İdeal olarak, hasat ve ek soğutma birini sürekli ve hızlı hareket halinde gerçekleşmesi gerekir. Mümkün olduğunca az kalarak Mezofaz kristal ile hasat edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, kriyo-Koruyucu in mezo-yetiştirilen kristalleri ile gerekli değildir. </li><li> Hemen kristal başarıyla hasat olduğunu düşündüren artık orada olduğunu doğrulamak için hasat için kullanılan Mezofaz bolus incelemek hasat sonrası kriyo-döngü içinde kristal aramak mümkün olmadığından. </li></ol> 8. Sünger Faz Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller <ol><li> Açık kuyuda sünger faz bolus kristalleri bulmak için normal ve çapraz polarize ışık arasında ileri ve geri gidin. Bu video dizisi birçok çift kırınım kristaller çarpı polarize ışık altında bolus olarak görülebilir. </li><li> Kullanım bir kriyo-döngü (Şekil 5) hasat hemen Dewar içinde sıvı azot içine, sünger fazdan kristal çıkarmaya ve bunları atılmak için, ya da cryoloop yer alan monte edilmiştir. Kübik aşamasından hasat olduğu gibi, ideal, kriyo-soğutma işlemi kristal gerçek hasat olay arasında geçen ve sıvı nitrojen içine dalan mümkün olduğunca az zaman ile hasat hemen gerçekleşmesi gerekir. Mümkün olduğunca az kalarak sünger faz kristal ile hasat edilmelidir. Belirtildiği gibi, kriyo-Koruyucu in mezo-yetiştirilen kristalleri ile gerekli değildir. </li></ol> 9. Dewars Kristaller saklanması <ol><li> Sıvı ni içine monte döngü dalmışlardırTrogen köpük Dewar içinde depolama pak holding yuvalarından birine yerleştirin. Bütün manipülasyonlar döngü ile yapılır, manyetik çubuk ve pakı üst sıvı azot içinde batık. </li><li> Dizüstü bilgisayar ve / veya bilgisayarda konumu ve ayrıntıları hasat ve cryo sogutmali kristal kaydedin. </li><li> Köpük Dewar içinde pakı tam veya günün bir depolama veya taşıma Dewar bir rafa pak yuvasına disk aktarımı tamamlandığında için hasat olduğunda sıvı nitrojen dolu. Kristaller kırınım veri toplama için sinkrotron tesisine ulaşım Dewars sevk edilebilir. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Hasat ve kriyo-soğutma egzersizleri amaçları, kriyo-döngüler içine barındırma Mezofaz bir kristal aktarmak ilmekledi kristal sırlamak ve bir Dewar sıvı azot depolama yerleştirmek için burada gösterilmiştir. Hasat ve c nerede ideal bir durumdurryo-soğutma kristal kırınım kalite süreç içinde korunur şekilde yapılır. Mümkün olduğunca az Mezofaz kristal ile hasat edilmelidir. Bu kristal bulmak ve vitrifikasyon amacıyla kriyo-soğutma hızlandırılır ve kırınım veri toplama sırasında Mezofaz arka plan dağılım müdahale en aza indirmek için, X-ışını çok daha az zorlu bunu merkezleme yapmaktır. Kristal görülemez ve kriyo-soğutmalı örneklerin bazı örnekler Şekil 6 &#39;da gösterilmiştir. Kristal gözle görülemez Nerede veri toplama 27 kiriş kristal bulmak ve merkezi ona amacıyla kırınımı rastering başvurmak genellikle gerekli değildir. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Içinde ve üzerinde iki tabakalı lipid gösteren bir biyolojik zar şematik are proteinler çeşitli yer alır. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. A tam yüklü ve mühürlü 96-cam sandviç kristalizasyon tabağı. Her iyi 50 nl kübik faz ve 1 ul çökelti çözeltisi içerir. Anlaşılır olması için, kübik faz Sudan Red ile boyanmış ve çökelti çözeltisi Metilen Blue içerir olmuştur. Referans 5 Gönderen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Lipidik Mezofaz büyüyen membran proteinlerinin Kristalleri. A. H. bacteriorhodopsin bir kristal ile kübik faz E. B12 vitamini reseptörü / taşıyıcı, BtuB bir kristal içeren halobium. B. sünger fazı, coli. Referans 25 Gönderen. Kübik ve sünger fazları Görünüş zıt oylandıRances olarak paneller A karşılaştırarak açıktır ve A orijinal şekline oldukça viskoz ve bozulmaz kübik faz B.. Bu akmaz. Bu, pürüzlendirilmiş bir görünüme sahip mezofaz bolus kenarlarında özellikle belirgindir. Sözleşme ile, sünger faz önemli ölçüde daha az viskoz ve akış yapar. Böylece, sünger faz orijinal şeklini korumak için başarısız olur ve kenarları tipik olarak pürüzsüz. Jeffamine içerir uyaran, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiol, propoxylate bütandiol ve heksandiol, pentaeritritol, kübik gelen sünger faz 4,26 için bir geçiş neden olabilir. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Akış mezo-yetiştirilen membran protein kristalleri üretimi, hasat ve kriyo-soğutma (A) yer alan adımları özetlemektedir. Kesik, kırmızı çevrili Sadece bu adımlarıçizgi, ve (B) &#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, bu Jüpiter madde olarak ele alınmıştır. A Referans is from 3 Panel. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Boş kriyo-döngü bir manyetik çubuk üzerinde yerinde düzenlenen bir pim üzerine monte edilmiş. Pimi (A) ve mikro-mount Genişletilmiş manzarası (B) hasat ve kriyo-soğutma için bu önemli aracı gösterilmektedir. B mikro montaj sonunda boş döngü çapı 30 mikron. Yaygın diğer döngü türleri test değil sahip olsa da, biz MiTeGen kübik ve sünger aşamalarında hem de gösterilen çalışma döngüsü olduğunu bulmak. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Kriyo-döngüler gibi bir sinkrotron beamline üzerine bir in-line mikroskop altında incelendi. A, B membran proteinlerinin Şekil 6. Hasat ve kriyo-soğutmalı kristalleri. Hasat kristalleri örnekleri (caa3 sitokrom oksidaz 34 (A), diaçilgliserol kinaz, DgkA (B)) kristalleri (mavi ok) Avlanan kristal bir kriyo-döngü cryo sogutmali Mezofaz görünmez olduğu bir cryo-loop. C. Örnek cryo sogutmali Mezofaz aracılığıyla görünür olduğu yere. Döngü ucu kırmızı ok ile tanımlanır. Kalarak cryo sogutmali Mezofaz mavi ok ile tanımlanır.

<ol>
	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes.">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2/D3+selective+antagonist.">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li><li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole.">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li><li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist.">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li><li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li><li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist.">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li><li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor.">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li><li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist.">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li><li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal++structure+of+the+&#946;2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the &#946;2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function.">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li><li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta(2)+adrenoceptor+complex.">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li><li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin.">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li><li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+nociceptin/orphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic.">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li><li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists.">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video yazıda lipidik Mezofaz yetiştirilen kristaller hasat ve kırınım veri toplama kullanılmak üzere hazırlık ve sonuçta yapı tayini için kriyo-soğutmalı nasıl gösterdi. Hosting Mezofaz viskoz ve yapışkan kübik faz veya daha fazla sıvı sünger faz 4 olabilir. Cam sandviç plakaların nasıl açılır ve kristallerin çok fazla hasat edilir nasıl mezofaz türüne bağlıdır. Bu vaktinden uğraşıyor iki birinin olduğunu bilmek önemlidir. Barındırma lipid ve ikinci çöktürücü ve kimlik bu açıdan önemli olan ve kristalleşme de mezofaz bolus fiziki görünüş de (Şekil 3) birbirinden ayırmak için kullanılabilir. Her iki Mezofaz türlerinden Hasat bu makalede izah edildi. Cam sandviç plakaları bir lipidik Mezofaz gelen küçük kristaller Hasat zamanı, beceri, exper gerektiren zahmetli bir süreçtirience, sabır ve istikrarlı bir el. Tüm malzeme ve teçhizat önceden hazır olduğundan böylece hasat için zaman uygun miktarda bir kenara bırakarak ve laboratuar kurmak için önemlidir. Hasat ile yardımcı olmak için bir ikinci kişi gerekli değil ama tavsiye edilir. Bu kişi hasat yapıyor bireysel ön işaretli tabak tedarik yanı sıra depolama disk içine hasat kristalleri ile cryo sogutmali monte döngüler yerleştirilmesi için yardımcı olabilir. Ayrıca, asistan kırınım veri toplama sırasında önemli kanıtlamak olabilir hasat sırasında yapılan kristalleri üzerinde gözlemler belgeleyen önemli bir destek rolü oynayabilir. Asistan yokluğunda, ses ile aktive ses-kayıt cihazı dokümantasyon için avantaj için kullanılan olabilir. Bu makalede açıklanan protokol sonrasında Görüntüleyicisi kalk ve kristal hasadı ile çalışan yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, bu işlem kolay değildir ve bu olduğunu takdir için önemli olan practice değerli membran protein kristalleri hasat içine başlatmadan önce gereklidir. Özellikle değerli değildir protein kristalleri ile test plakaları ilk denemeleri bu nedenle tavsiye edilir. Bu cam kesme değerli bir deneyim ile acemi sağlayacak, cam parçaları kaldırarak Mezofaz yerinden coverglass yukarı kaldırarak, kristaller görmek ve hasat sırasında onları izlemek için mikroskopta polarize özelliğini kullanarak, ve nihayet mesophases farklı türleri ele ve onlardan hasat. Ve uzatma kristaller hasat edilebilir hangi ile kolaylığı, Mezofaz dokusu kristalleşme sırasında zaman ile değişimi yapar. Daha az değerli kristaller ile ama daha değerli olanları aynı koşullar altında yetiştirilen verdiğiniz kişiler ile hasat uygulama için bu nedenle önemlidir. Bu, mezo veya lipidik kübik faz yöntemi 28 ile lizozim ve thaumatin kristallerinin büyümesini mümkün olduğunu ve bu consid olmalıdırmalzemeler ve yöntem ile elde yakınlık yoluyla uzanırlar. Bir de onun kaprislerine öğrenmek için ilk protein içermeyen Mezofaz çalışan düşünmelisiniz. Burada gösterilen prosedürler tüm rahat bir 20 ° C veya oralarda yapıldı. Bu, daha düşük sıcaklıklarda mezo yöntemi ile kristallerin büyümesi mümkündür. Bu nedenle, bir yarı kararlı durum faz içinde barındıran lipid olarak monoolein 4 ° C&#39;de 1,2,29,30 de kullanılabilir. Alternatif bir düşük sıcaklıkta kristalleşme 31 için rasyonel bir şekilde tasarlanmış 7,9 MAG kullanmaktır. Biz belli membran proteini hedefleri ile rutin düşük sıcaklık crysallogenesis yapın. Bu durumda, kristal büyüme ve hasat bir gömme 4 ° C&#39;de soğutma yapılır. Bu koşullar altında çalışmak sıcak ve rahat kıyafetleri ihtiyacı olan değil, en az olan kendi zorlukları vardır. Makromoleküler crys kullanarak yapı tayini genel sürecinde sonraki adımtallography kristaller hasat ve bu makalede gösterildiği gibi ek soğutmalı üzerine kırınım veri toplamaktır. mezo-yetiştirilen yılında kristaller genellikle küçük. Bununla birlikte, kullanışlı kırınım veri toplama 20 mikron 9 olduğu bir maksimum boyuta sahip olan kristalleri ile mümkün olmuştur. Bu amaç için, mikro-ışın sinkrotron X-ışını kullanılan ve bu seri 32,33 ayrı bir Jüpiter madde amacı, bir edilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Bileşenleri </td></tr><tr><td> Eğimli Cımbız </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Tek pipet uçları </td><td> Gilson </td><td> Çeşitli </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Köpük Dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Cam ve metal çöp konteynerleri </td><td> Daniels Sağlık </td><td> DD479OL </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Hasat döngüler </td><td> MiTeGen </td><td> Çeşitli </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Mikroskop Hasat </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Çeşitli </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Manyetik itmedüğmesine numune yükleme değnek </td><td> Hampton Araştırma / Moleküler Boyutları </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Orijinal Puck (sadece ALS tarzı robotlar ile kullanım için) </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-035 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Pipetleme cihazlar </td><td> Gilson </td><td> Çeşitli </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Çöktürücü çözümleri </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-030 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Kanca kolu ve kilitleme çubuğu ile Puck rafa Kargo Cane (orijinal ALS-stili) </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-029 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Arıtılmış su </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Koruyucu gözlük </td><td&gt; Çeşitli </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Örnek Pin Bazlar - Manyetik (non-bakır) </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-015 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Nakliye Dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Dokular </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Tungsten-karbür cam kesici (TCT Scriber) </td><td> Silverline Araçlar (Yeovil, UK) </td><td> 633657 </td><td> Araç </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

Proteinler mekanistik bir seviyede nasıl işlediğini anlamak için önemli bir rota ideal atomik çözünürlükte, mevcut hedef proteinin yapısına sahip olmaktır. Halen orada integral membran proteinleri (Şekil 1), ve bunların oluşturdukları kompleksler uygulanan gibi bilgileri yakalamak için tek bir yol olduğunu ve bu yöntem makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX) &#39;dir. MX kırınım kalite kristaller zar proteinlerinin durumunda, ihtiyaç bulunmaktadır yapmak için, kolayca oluşturmaz. Lipidik mesophases, özellikle kübik ve sünger fazlar 1-5 kullanımını gerektirir membran proteinleri kristalize için bir yöntem (bu G protein-kenetli reseptör alanında 6-21 içinde olmuştur başarıları nedeniyle geç de dikkat kazanmıştır <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Bununla birlikte, bu yöntem, bundan sonra mezo veya lipidik kübik faz yöntemi olarak adlandırılan, kendi teknik ile birliktezorluklar. Bu nedeniyle sık sık mikro kristalleri kristaller olarak büyümesi olan lipidik mezofaz genel olarak viskoz ve yapışkan doğası, kısmen ortaya çıkar. Kristaller işleme 22,23 hasat sırasında sonuç olarak zor ve özellikle çok olur. Problemler kriyo-soğutma ve nihai X, hasat için, kristaller burada kristalleri (Şekil 2) 24,25 büyüdüğü içinde cam sandviç plakaların mezofaz bolus ortaya çıkarmak için açılmış olmasını gerektirir ki hasat önce gelen basamakta da ortaya çıkar, ve -ışını kırınım veri toplama. Kristaller hasat edilmelidir hangi kübik ve sünger Mezofaz türevleri (Şekil 3) derinden farklı rheologies 4,26 var. Kübik faz kalın bir diş macunu benzer yapışkan ve yapışkan. Buna karşılık, sünger fazlı akış için ayrı bir eğilim ile daha akışkandır. Açılış kristalizasyon kuyuları containi için Buna göre, farklı yaklaşımlarkübik ve sünger faz içinde gelişen kristaller ng gerçekten farklı yöntemler iki mezofaz tür kristal hasadı için gerekli olmasından dolayı, çağrılır. Rafine ve uygulanan Membran Yapısal ve İşlevsel Biyoloji (MS &amp; FB) Grubu ve bu Jove makale (Şekil 4) ayrıntılı olarak açıklanmıştır oylandı sadece yapmak için protokoller. Örnekler kristaller başarıyla hasat ve kriyo-soğutulur durumlarda verilir. Ayrıca problemler kristaller onarılamaz kaybına neden olduğu durumlarda ortaya çıkan örnekler verilmiştir ve bu sorunların önlenebilir açıklanmıştır. Bu makalede Görüntüleyicisi hasat için, cam sandviç kristalizasyon kuyu açılması ve kübik ve sünger aşamalarında büyüyen membran proteinlerinin kriyo-soğutma kristalleri için adım adım yönergeler sağlanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography at JoVE.co

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik kübik ve sünger aşamalarında büyüdü hasat ve kriyo-serin membran proteini kristaller Yapısal ve İşlevsel Biyoloji Grup Caffrey Membran uygulanan prosedürler açıklanmıştır.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K Görüntüleme.  Trinity College Dublin. Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik kübik ve sünger aşamalarında büyüdü hasat ve kriyo-serin membran proteini kristaller Yapısal ve İşlevsel Biyoloji Grup Caffrey Membran uygulanan prosedürler açıklanmıştır.

Video: Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biyoloji

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.