Biz FACS analizi ile yardım için at UBC Biyomedikal Araştırma Merkezi Andy Johnson teşekkür ederim. Wong Laboratuvar Kanser Araştırma Fonu Kanada Kanser Topluluğu Araştırma Enstitüsü (işletme hibesi # 019250) tarafından ve İlaç Bilimleri, UBC Fakültesi Araştırma yeniden yatırım fonlarından sağlanır. JMYW Kanada Araştırma Sandalyeler ve Sağlık Araştırması Kariyer Geliştirme programları için Michael Smith Vakfı tarafından desteklenmektedir.

1. Hücre Hazırlık <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Şekil 0" /> <ol><li> Yaklaşık% 60 konfluent bir yoğunluğa ulaşmak üzere plakası hücreleri. Hücreler toplama zamanda log fazında olmalıdır. Mcf7 hücreleri için, bu 5 x 10 5 hücre / uygun bir ortamda 10 cm plakasına tohumlama gerçekleştirilir. HT29 ve LS180 hücreleri 6 x 10 5 hücre / 6 cm plakasına tohumlanmıştır. Biz, DMEM ortam% 10 FBS ve 1 x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş kullanılır. Doğru pozitif ve negatif kontroller için tohum plakaları emin olunTest numunesinin yanında. Bunlar, aşağıdakileri içerir: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> ben </td><td> pozitif kontrol </td><td> Sadece BrdU </td></tr><tr><td> ii </td><td> pozitif kontrol </td><td> PI sadece </td></tr><tr><td> iii </td><td> negatif kontrol </td><td> BrdU negatif, PI negatif </td></tr></tbody></table> (Bu tür Bu protokol anlatılan biri olarak birden timepoints sahip bir ön deneyi gelecek koleksiyon yürütmek için bu süre boyunca zaman çerçevesi sınırlamak için kullanılabileceğini belirtmek gerekir.) <ol start="2"><li> Kaplamalı hücreler 37 C&#39;de inkübe edilir ° C&#39;de,% 5 24-48 saat boyunca CO 2, böylece hücreler kurtarma ve bağlamak için olanak sağlar. </li><li> Bromodeoxyuridine (BrdU) ile etiket hücreleri nabızlamak için, DMEM wi değiştirilir10 uM BrdU içeren inci taze medya. Hücreler ° C&#39;de,% 5 CO2 DNA&#39;ya BrdU dahil edilmesi için izin vermek üzere 37 az 1 saat süre ile inkübe edilir. Negatif kontrol olarak hareket etmek işlenmemiş bir tabak bıraktığınızdan emin olun. </li><li> Puls-etiketleme ortam kaldırılır ve hücreler 1X PBS ile kısaca durulanır. </li><li> Taze büyüme ortamı eklenir (eksi BrdU) ve hücreler ° C&#39;de,% 5 CO2 toplama için uygun timepoint ulaşılıncaya kadar, 37 inkübe devam izin verilir. </li></ol> 2. Hasat ve Fiksasyon <ol><li> Adım 1.3 ila tedavi edilmemiş hücrelerin sıfır timepoint olarak kabul edilir. Bu örnek, BrdU tedavisi hemen sonra toplanır 1 saat timepoint birlikte toplanabilirler. </li><li> Hücreler hasat etmek için, ortam kaldırılır ve plakalar 1X bir kez PBS ile durulanır. </li><li> Hücreler 5 dak Sup için 1500 rpm&#39;de santrifüje edilerek, tripsinize kültür ortamı içinde toplanmış ve daha sonra topak haline edilirernatant atılır. </li><li> 5 ml buz gibi soğuk 1X PBS ile 1-10 x 10 6 hücre durulayın. 5 dakika Fazı için 1500 rpm&#39;de santrifüj atılır. </li><li> Hücre topağı sonra buz gibi soğuk PBS /% 1 FBS 100 ul içinde tekrar süspanse edilir. Hücre topaklanma önlemede PBS yardımcıları% 1 FBS eklenmesi. </li><li> -20 ° C, hücreler 70 sabitlemek için% 5 ml etanol ile damla damla ekleme bu hücreler. </li><li> 4 ° C&#39;da 30 dakika veya saklamak için buz üzerinde inkübe. Bu, çeşitli timepoints örneklerinin toplanması durdurmak için hangi ideal bir adımdır. Bunların örnekleri protokolünün kalanı ile eş zamanlı olarak işleme izin vererek, birkaç gün boyunca etanol içinde bırakılabilir. </li></ol> 3. BrdU ve PI Boyama <ol><li> 1500 rpm&#39;de 5 dakika için santrifüjleme ile pelet hücreleri. </li><li> Sabitleştirici çıkarın, ancak ~ 50 ul vortekslendi tarafından pelet gevşetmek için hangi bırakın. </li><li> DNA denatüre yavaşça 2N HCI / Triton X-100 ile 1 mLvorteks ederken damla damla. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe örnekleri. </li><li> 1500 rpm&#39;de 5 dakika örnekleri santrifüj edilerek pelet hücreleri. Aspire ve supernatant atın. </li><li> Denatürasyon adım nötralize etmek için, 0.1M sodyum tetraborat, pH 8.5 1 ml hücre pelletini. </li><li> 1500 rpm&#39;de 5 dakika hücreleri santrifüjleyin. Aspire ve supernatant atın. </li><li> BrdU boyama karışımı 75 ul (50 ul% 0.5 tween 20/1% BSA / PBS + 20 ul FITC konjuge anti-BrdU + 5 ul 10 mg / ml RNase) içerisinde hücre pelletini. </li><li> Işıktan korunan 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Pelet hücreleri, 1500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca örnekleri santrifüjlenir. Aspire ve supernatant atın. </li><li> PBS 5 ug / ml propidium iyodür ihtiva eden 1 ml hücre pelletini. </li></ol> 4. Akım Sitometri <ol><li> Hücrelerin analiz için, bir akış sitometresi 488 nm lazer ve donanımlıUygun filtreler gereklidir. Böyle CellQuest gibi analiz yazılımı aşağıda özetlenen araziler yaratmak için gereklidir. </li><li> Akış sitometresi ile örnek çalıştırırken, hücrelerin düzgün boyut dağılımı (Şekil 1A) sağlamak için bir forward scatter (SSC-H) karşı tarafında dağılım (FSC-H) arsa oluşturun. Bu parametreler her iki doğrusal bir ölçekte çizilmiştir. </li><li> Aynı zamanda FL3-H (PI leke) vs FL2-W (Şekil 1B) bir arsa görüntülemek. Bu plot hücre döngüsünün normal dağılım deseni dahilinde hücre fraksiyonu izole etmek için bir geçit (R3) oluşturmak için kullanılır. Genel olarak, bu dağılım deseni sırasıyla hücre döngüsünün G1 ve G2 fazlar, temsil PI boyamanın 2N ve 4N DNA içeriği hücreleri iki yığın ile karakterize edilir. Bu 2 kümeleri arasında bulunan hücrelerin bir dize hücre döngüsünün S fazında meydana devam eden DNA replikasyonu temsilcisidir. </li><li> Bir komplo displayi oluşturmang y-ekseni ve x-ekseni (Şekil 1C) üzerindeki PI (lineer arsa) üzerinde FL1-H ile adım 4.3, (FITC, günlük arsa) gelen kapılı hücreleri (R3). Bu plot analizi için veri toplamak için çeşitli 1,1 belirtilen kontrol yanı sıra kullanılarak geri kalan parametreleri belirlemek için kullanılır. </li><li> Sitometresinin üzerine PI sadece lekeli örneği yerleştirin. X-ekseninde ~ 200 G1 yerleştirmek için kazanç ayarlayın. Bu leke PI bir histogram grafiği de görselleştirmek için daha kolay olacaktır. </li><li> İkinci bir denetim akış sitometresinde bir BrdU-tek numune çalışan içerir. Hücrelerin 2 popülasyonları (BrdU pozitif vs BrdU negatif) arsa üzerinde görünür ki kazanç ayarlayın. İdeal olarak, BrdU negatif hücrelerin sadece 10 -1 altında görüntülenmesini konumlandırılmış. </li><li> Son kontrol BrdU / PI negatif örneğidir. Hücreleri üst veya sağ kadran herhangi görünmez olmasını sağlamak için bu negatif kontrol çalıştırın. </li><li> Çeşitli araziler parametreleri ayarlandıktan sonra,Akım sitometrisi BrdU ve PI boyalı hücrelerin işlenmesi için kalibre ve hazırdır. Doğru PI fraksiyonu (4.3 adıma bakınız) ortasında korunaklı olan 10.000 hücrelerin en az tahsilat okumak gerekir. </li><li> Toplanan verileri analiz etmek, bu FlowJo veya FacsDiva gibi yazılımları kullanılmaktadır. Yukarıda bahsedilen parselleri her bu programlara yeniden ve niceliksel ve İstatistiksel analiz gerçekleştirilebilir. </li><li> Analizin son nokta art arda birkaç adım içerir. PI vs FL2-W arsa olumlu PI kapılı hücrelerle FITC vs PI bir komplo oluşturma bir bisiklet nüfus ayırmasına olanak sağlar. İkinci bir kapı BrdU pozitif nüfusu izole ederek bu komplo oluşturulur. X ekseni üzerinde PI ile bir histogram arsa üzerinde bu farklı nüfus ifade bir hücre döngüsü ilerleme zamanı ders izlemenize olanak sağlar. Bu G1 veya zamanın bir fonksiyonu olarak G2 içeriğine sahip BrdU-pozitif hücrelerin sayısı çizilmesi ile daha da görüntülenmiştir olabilir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Normalde propidyum iyodür ile boyanmış bisiklet hücrelerin sırasıyla, 2N ve 4N DNA içeriği içeren hücreleri (Şekil 2) karşılık gelen G1 ve G2 farklı zirveleri var. BrdU Darbe etiketleme aktif DNA (yani S fazı) sentezleyerek hücrelerden bir alt nüfusun seçici etiketleme için izin verir. Kısa bir süre BrdU reaktifi uzaklaştırıldıktan sonra, tüm etiketli hücreler S fazı (Şekil 3) bulunmaktadır. Onlar hücrenin döngüsünün sonraki aşamalarında geçerken kısa bir darbe etiketleme kısıtlayarak bir çok kez puan boyunca hücrelerin bu şimdi ayrı alt-nüfus takip edebiliyor. Bu, bir G1 ayrı olmaması ve G2 zirveleri Şekil 3&#39;te 1 saat bir zaman noktasında görüntülenmiştir olabilir. Ek bilgi BrdU etiketleme adım elde edilebilir. Bölünen hücre oranı, bir est ölçülen, fakat sadece edilebiliriki örnek arasındaki hücre döngüsü aşamasında dağıtım mak de tespit edilebilir. Onlar G2 döngüsü, ilerleme devam ettikçe BrdU reaktif çıkarılmasını takiben eşit aralıklı aralıklarla hücrelerin toplanması ile, hücreler izlenebilir ve sonunda nihayet G1 ile BrdU pozitif kızı hücreler olarak ortaya çıkan, orijinal hücre hücre bölünmesi için hareket DNA içeriği (Şekil 4). Hücre döngüsü faz miktar ve kinetik analizi için bir örnek Şekil 5 &#39;de verilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Temsilcisi mcf7 hücre popülasyonunun (A) Forward Scatter karşı Side Scatter Plot. Bir temsilci mcf7 hücre popülasyonunun (B) PI karşı Genişlik (FL-W) Arsa. Perdeleme son analizde (R3) hücre çiftler çifti çıkarmak için gösterilmiştir. Bu lazer ışını ve Şeref geçmesi için daha uzun sürer gibi hücre çiftler çifti, tek bir hücre daha büyük puls genişliğine sahip olacakcevher analize dahil edilebilir. Bir temsilci mcf7 hücre popülasyonunun (C) PI karşı FITC (BrdU) Arsa. Perdeleme yalnızca FITC (BrdU) pozitif hücrelerin (R4) içerecek şekilde gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Normalde bisiklet hücrelerinin toplam nüfusu Temsilcisi histogram grafiği. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. FITC (BrdU)-pozitif hücreleri için perdeleme sonra, BrdU puls çıkarıldıktan sonra 1H toplanmıştır hücrelerinin histogram plot. Etiketin çıkarılmasını takiben bir erken timepoint BrdU-pozitif hücreler sadece DNA sentezi esnasında hücre başarılı bir etiketleme doğrulayan, hücre döngüsünün S-fazlı in olan hücreleri ile tutarlıdır DNA içeriğini gösteren örnekleri karşılık PI profillerini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> lt = &quot;Şekil 4&quot; /&gt; Şekil 4. Kanser hücresi hatlarında, kolorektal kanserler HT29 (A) ve LS180 (B) yanı sıra, meme kanseri mcf7 (C) arasındaki hücre döngüsü ilerlemesi kinetikleri karşılaştırılması. Hücreler BrdU darbe çıkarılmasını takiben, 8 saat boyunca her saat toplanmıştır. Bu deneyde, kolorektal hücre hattı LS180 hücre döngüsünün G2 fazı ile hızlandırılmış hücre döngüsü sürecinde net bir profil gözlenmiştir. Kolorektal kanser hücrelerinin iki profil arasında kinetikleri karşılaştırarak, bir G1 pik ortaya çıkması, bu pik yoksun HT-29 hücre çizgisi için uygun bir zaman noktası ile karşılaştırıldığında, LS180 hücreleri, T = 4H post-BrdU belirgindir. İki kolorektal hücre hatları biri biriyle karşılaştırıldığında, mcf7 hücreler önemli ölçüde azalmayla bisiklet edilir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <html> yeniden 5 &quot;/&gt; Şekil 5. BrdU-etiketli kanser hücreleri (A) Kantitatif hücre döngüsü faz analizi. Dekan / Jett / Fox algoritma HT29, LS180 ve mcf7 (yeşil resimli) uygulandı. Her numuneden elde edilen hücre döngüsü faz dağılım her aşama için% toplam BrdU-pozitif hücreler olarak ifade edilir. Önceki zaman noktalarının bazı analizler geçersiz sonuç olarak sadece her hücre hattı için zaman noktaları seçmek, görüntülenir. Bu daha erken zaman noktalarında, tüm BrdU-pozitif hücreleri S-faz ve bu nedenle algoritması uygulama için gerekli olan ayrı G1 ve G2 zirveleri, yoksundur. (B), kanser hücrelerinin Histogramlar hücre döngüsünün G2 / M aşamalarında kinetiği progresyon gösteren. G2 / M aşamalarında İlerleme HT29 ve mcf7 takip LS180 hücreleri için hızlı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <html> jpg &quot;alt =&quot; Şekil S1 &quot;/&gt; Şekil S1. Flow sitometri kontrolleri. mcf7 hücreler PI ne BrdU boyanmış ne (A) negatif kontrol olarak gösterilir. (B) PI sadece boyandı. (C) BrdU-FITC etiketli örnekleri. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="S2 Şekil" /> PI karşı FITC (BrdU) floresan emisyon spektrumu arasındaki ilişkiyi gösteren S2. Şematik gösterimi Şekil. Flüoresan kanalı 1 (FL1, FITC) ve flüoresan kanalı 3 (FL3, PI) için spektral toplama pencere karşılık gelen kutular içinde gösterilmiştir. FL1 ve FL3 algılama arasında fluorofor spektrumları örtüşme yoktur. PI ve FITC-BrdU gelen deneysel verileri eş-etiketli hücreler sırası FL1/FL3 kanallar toplanır ettiği bir floresans dengeleme gerekli değildir. Floresans spektrumları BD BioSciences web sitesinden elde edilmiştir:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D+as+a+therapeutic+target+in+cancer.">Cyclin D as a therapeutic target in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).</li><li>Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+is+balancing+development,+differentiation+and+de-differentiation+to+assure+cancer+prevention.">p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention.</a> Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).</li><li>Dickson, M. A., Schwartz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-cycle+inhibitors+for+cancer+therapy.">Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy.</a> Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>van Opstal, A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+phosphatidylinositol+3-kinase+activity+prevent+cell+cycle+progression+and+induce+apoptosis+at+the+M/G1+transition+in+CHO+cells.">Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).</li><li>Gasnereau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+to+sort+mammalian+cells+in+cytokinesis.">Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis.</a> Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).</li><li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+cell+populations+in+G1/S+and+G2/M+phases+of+the+cell+cycle.">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).</li><li>Pedrali-Noy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+HeLa+cell+cultures+by+inhibition+of+DNA+polymerase+alpha+with+aphidicolin.">Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).</li><li>Merrill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization.">Cell synchronization.</a> Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).</li><li>Fleisig, H. B., Wong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+promotes+efficient+cell+cycle+kinetics+and+confers+growth+advantage+to+telomerase-negative+transformed+human+cells.">Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells.</a> Oncogene. , (2011).</li><li>Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZ703,+an+imidazo[1,2-a]pyridine+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1+and+2,+induces+E2F-1-dependent+apoptosis+enhanced+by+depletion+of+cyclin-dependent+kinase+9.">AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9.</a> Cancer Res. 66, 435-444 (2006).</li><li>Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+cycle+by+flow+cytometry.">Analysis of cell cycle by flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).</li><li>Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

BrdU eklenmesi ile akım sitometri birleştirerek, hücre döngüsü kinetiğini incelemek için gerekli araçlara sahip. Bir timidin analoğu olarak işlev BrdU en ayırt edici özelliği bir bisiklet hücrenin DNA içeriği ölçümü için olanak budur. Hücre siklusu sentez aşamasında büyüyen bir kızı DNA zincir haline BrdU ile birleşmesiyle bir G2 büyüme dönemi ve sonuçta hücre bölünmesi, S fazında DNA çoğaltma yoluyla bisiklet hücrelerinin bir alt izlemenizi sağlar nedir . BrdU etiketin sinyal s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> bromodeoxyuridine </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> propidyum iyodür </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml stok </td></tr><tr><td> FITC anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> sodyum tetraborat </td><td> Balıkçı </td><td> S80172 </td><td> 0.1M, pH 8.5 </td></tr><tr><td> FACS Kalibre </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

Hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında başlaması ve sonraki ilerleme Hassas kontrol hücreleri prolifere olarak büyük öneme sahiptir. Hücre döngüsü bölünmesi, büyüme ve önemli hücre döngüsü bileşenlerinin üretimi ve deregülasyon karsinogenez 1,2 tetikleyici faktörler sorumlu tutulmuştur ayrılmaz bir parçasıdır. Anti-kanser tedavileri Moleküler ilaçlar sıklıkla hücre döngüsü bölünmesi 3 düzenlenmesi ve koordinasyonundan sorumlu biyolojik yollar hedef. Hücre döngüsü kinetikleri hücre türüne göre değişir olmalarına rağmen, hücre döngüsünün dört aşamada arasında hücrelerinin dağılımını mitojen ve büyüme faktörü ifade tutarlı bir desenine bağlı olarak, belirli bir hücre hattı içinde daha çok tutarlıdır. Genotoksik olayları ve diğer hücre-stres katali için izin vermek için yakalanması veya belirli bir hücre döngüsü aşamasında geçici bir duraklama sonuçlanan, hücre döngüsü progresyon geçici blok sonuçlanabiliruygun tepki mekanizması kolayca dolaşmak mümkündür. Deneysel olarak da hücre döngüsü ilerleme aşamasında referans ile bir hücre popülasyonunun davranışlarını gözlemlemek için yeteneği hücre biyolojisinde önemli bir ilerlemedir. Gibi mitotik olarak ortak prosedürlerin hücre döngüsü 4-6 belirli aşamalarında hücrelerin izole etmek için kullanılır, diferansiyel santrifüj veya akım sitometri tabanlı sıralama kurtulamıyorum. Bunlar, fraksiyonlara, hücre döngüsü faz daha sonra popülasyonlar zenginleştirilmiş deneysel tedavi tabi tutulur. Ayrılmış fraksiyonların Verim, saflık ve canlılık sıklıkla bu fiziksel ayırma yöntemleri kullanarak tehlikeye girebilir. Aynı zamanda, hücre popülasyonlarının ayırma ve fraksiyonlara hücreleri seçili hücre döngüsü aşamasından ilerleyebilir sayede deneysel tedavi başlangıcı arasındaki zaman atlamalı, başarılı bir şekilde uygulanması ve bu deneylerin yorumunda önemli sorunlar oluşturabilmektedir. St diğer yaklaşımlarKamuoyu iliĢkileri programları hücre döngüsü aşamalarında hücreleri senkronize etmek kimyasalların kullanımını içerir. Her bir hücre döngüsü aşaması için anahtar metabolik işlemler kimyasal inhibitörleri ile hücre tedavisi sonraki aşamaya hücre döngüsünün ilerlemesini engelleme faydalıdırlar. Örneğin, tarafından G1 / S kavşakta ribonükleotid redüktaz inhibitörü hidroksiüre durur hücreleri deoxynucleotides, DNA&#39;nın yapıtaşlarını tedarik sınırlayıcı. Diğer önemli kimyasallar aphidicolin tedavisi dahil, mitotik iğ oluşumunu engelleyebilir, her ikisi de G1 tutuklama polimeraz alfa inhibitörü, kolşisin ve Nokodazol ile tedavi, M fazındaki hücrelerin durdurmak için ve nihayet, DNA zinciri terminatör 5-fluorodeoxyridine ile tedavi başlatmak için S fazı tutuklama 7-9. Bu kimyasallar ile tedavi belirli bir aşamasında hücre bütün bir nüfusun eşitleyerek etkili bir araçtır. Kimyasal kaldırılması ile, hücreler ağızdan hücre döngüsü katın. Test maddesi aşağıdaki sürümü Tedavisihücre döngüsü engelleme kimyasal noktalarında ortaya çıkan madde, bir yanıt üniform, hücre döngüsü aşaması spesifik popülasyondan olmasını sağlar. Ancak, kimyasal eşzamanlayıcılar birçok beri meydan okuyor çeşitli yanıt yollar (test ajanlar vs synchronizers için) katılımı dışında alay, genotoksik bilinen bileşiklerdir. Burada bölünme ve kızları hücre bölünmeye kadar, DNA&#39;nın kopyalanması aşamasında onların ilerlemesini aktif olarak bisiklet hücrelerinin bir alt takip etmek için metabolik bir etiketleme yöntemi açıklar. Sitometrisi miktar ile birleştiğinde, bu protokol yokluğunda hücre döngüsü kinetik ilerleme ölçümü için olanak ya mekanik veya kimyasal kaynaklı hücresel genellikle diğer hücre döngüsü senkronizasyon metodolojiler 10 ile ilişkili olduğunu vurguluyor. Aşağıdaki bölümlerde biz de biyomedikal araştırmalarda bazı uygulamalarını olarak, metodoloji tartışacağız.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Hücre döngüsü aşamaları ilerleme ve kinetikleri izleme ince değişiklikler Propidium iyodid ile BrdU ve toplam genomik DNA boyama yöntemi ile, nükleik asit metabolik etiketlenmesi bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, dolayısıyla da hücre siklus progresyonu etkileyen non-spesifik DNA hasarına, geliştirilmesinin önlenmesi, bisiklet hücrelerin kimyasal senkronizasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

measuring-cell-cycle-progression-kinetics-with-metabolic-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Görüntüleme.  University of British Columbia. Hücre döngüsü aşamaları ilerleme ve kinetikleri izleme ince değişiklikler Propidium iyodid ile BrdU ve toplam genomik DNA boyama yöntemi ile, nükleik asit metabolik etiketlenmesi bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, dolayısıyla da hücre siklus progresyonu etkileyen non-spesifik DNA hasarına, geliştirilmesinin önlenmesi, bisiklet hücrelerin kimyasal senkronizasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır.

Video: Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biyoloji

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...