Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Hücre Bilimi ve PTI Araştırma): Yazarlar, özellikle yıllar boyunca bu yöntemlerin geliştirilmesi için teknik ve entelektüel katkıları için aşağıdaki kişilere teşekkür etmek istiyorum Brian Gray (PTI Araştırma), Jan Fisher (Dartmouth Tıp Okulu), Alice Givan (Dartmouth Tıp Okulu), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc) ve Mary Waugh (Dartmouth Tıp Okulu). Onlar da Şekil 2&#39;de gösterildiği verileri oluşturulan Yıllık Araştırma Yöntemleri Dersler ve Flow Sitometri Uygulamaları, 2006 yılının Bowdoin sınıf teşekkür etmek istiyorum. Flow sitometri NIH Paylaşılan Enstrüman Programı ekipman hibe kısmen kurulmuş Roswell Park Kanser Enstitüsü Akım Sitometri Laboratuvarı, gerçekleştirilen ve Milli gelen Çekirdek Grant (5 P30 CA016056-29) destek alır edildiKanser Roswell Park Kanser Enstitüsü ve Abramson Kanser Merkezi Akış Sitometri ve NIH Paylaşılan Enstrüman Programı ekipman hibe kısmen kuruldu Pennsylvania Üniversitesi, Hücre Ayırma Kaynak Laboratuvarı Enstitüsü ve NIH # 2P30 destek alır Ulusal Kanser Enstitüsü&#39;nden CA016520. Şekil 3 ve 5&#39;te gösterilmiştir çalışmaları da PTI Research, Inc verilir Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Ulusal Enstitüsü (NIBIB) den SBIR hibe EB00228 tarafından kısmen desteklenmiştir

1. PKH26 Cep Takip Dye ile Genel Membran Etiketleme (Ref. 25; Şekil 1) <ol><li> 1.9 - 1.1 adımları steril tekniği kullanın. Trombosit kontaminasyonu en aza indirmek için bir son 300 xg spin ilavesi ile laboratuarın standart metod kullanılarak ~ 10 7 insan periferik kan mononükleer hücreleri veya lenfositler (hPBMC, hPBL) hazırlayın. Adım 2 kullanılmak için bir 500 ul alikot (5x10 6 hücre), rezerv, buz üzerinde 10 HBSS +% 1 BSA ve yerinde 7 / ml &#39;de hücreler yeniden süspanse edin. </li><li> Bir 12 x 75 mm&#39;lik polipropilen konik tüpe il 5x10 6 hücreleri (500 ul). 3,5 ml HBSS ile bir kez yıkayın. Dikkatle rezidüel sıvı artık 15-25 daha ul bırakarak, ancak hücreleri çıkarmak için özen, süpernatant aspire. Adım 1.4 &#39;de 2x hücre süspansiyonu hazırlamak için bu tüpü kullanın. </li><li> Basamak 1.2 &#39;de yıkama esnasında hücre, bir 12 x 75 mm&#39;lik polipropilen konik tüpe Seyreltici C etiketleme araç ve 0,5 ml (PKH26GL kit) ekleyin. Hazırlık için bu tüpü kullanınAdım 1.5 2x PKH26 çözümdür. </li><li> Aşama 1.2 &#39;den yıkanmış hücre peleti seyreltici C etiketleme araç 0.5 ml ilave edilir ve tek bir hücre süspansiyonu (2 x hücreleri) elde etmek için 3-4 kez aspire ve dağıtmak. Hücre canlılığı ve kurtarma azaltabilir kabarcık oluşumu ve karıştırma, aşırı kaçının. </li><li> Hemen Adım 1.4 2x hücre süspansiyonu hazırlandıktan sonra, Adım 1.3 ve vorteks için hazırlanan Dilüent C tüp etanol içinde 1.0 mM PKH26 boya stoku (PKH26GL kiti) 2.0 ul ekleyerek 2x (4 uM) boya çözeltisi hazırlamak eşit dağıtmak. </li><li> Hemen Adım 1.5 2x boya çözeltisinin hazırlanmasından sonra, hızla 2x boya çözeltisi içine Adım 1.4 2x hücre süspansiyonu Pipeti ve aynı anda aspire ve tamamen boya hücreleri dağıtmak için 3-4 kez vazgeçemeyeceği yapın:. Doğrudan 1.0 mM boya ekleyin hücreleri; 2x boya içine 2x hücreleri dökün; veya vorteks ise boya 2x 2x hücreleri ekleyin. Boyama neredeyse anlık olduğundan, bu tür yöntemleri daha az verimÖnerilen yöntem daha üniform şiddetleri (Şekil 2). </li><li> 1 dakika sonra, ısı inaktive serum veya hücre zarının içine boya alımını durdurmak için HBSS +5% BSA 1.0 ml ekleyin. Yeterince protein kullanmayı Başarısızlık yıkama adımları sırasında hücreleri ile pelet can ve diğer hücrelerin istenmeyen etiketleme neden bir deney mevcut boya agrega, oluşumu riski. % 10 ısıyla inaktive serum (CM) ve HBSS +% 1 BSA ile orta durdurma ayıraç olarak kullanılacak ise, bir 15 ml polipropilen konik tüpe boyanma gerçekleştirmek ve her adsorpsiyonu temin etmek durdurma reaktif en az 5.0 mL adi boya. </li><li> 5 dk için etiketli hücreler santrifüje @ ~ 400 x g. Hücreler çıkarmadan süpernatant dikkatlice aspire. Iyi recentrifugation önce pelet dispersiyon, CM veya HBSS +1% BSA 4 ml ile iki kez pelet yıkayın. Tüp duvarları üzerinde adsorbe edilen boyarmadde taşınmasını en aza indirmek ve yıkama verimliliği maksimize etmek için, fi sonra taze polipropilen tüp hücreleri aktarmakrst resüspansiyon. Not: yeterince lekeli hücreler topak belirgin bir pembe bir belirti sergileyecektir. </li><li> 1.0 ml HBSS +1% BSA yıkanmış hücre pelletini tekrar. , Hücreleri sayın hücre elde belirlemek, ve 10 7 / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon vermek için hacim ayarlayın. Dikkatli aspirasyon ile, hücre kurtarma ≥% 85 olmalıdır. Hücre kurtarma &lt;% 70 ise, devam etmeden önce nedenini belirlemek. Adım 2 kullanım için buz üzerinde 150 ul kısım (1.5x10 6 hücre) ve yeri çekin. </li></ol> 2. Enstrüman ve Test Ayar Kontrolleri Hazırlanması (Tablo 1) <ol><li> 1, 3, 4, 5 ve 7: beş 1.8 ml Eppendorf tüpleri içine her Adım 1.1 kaydedilmiş hücre süspansiyonu boyanmamış hücreleri 50 ul alikot (5x10 5). 2, 6 ve 8: PKH26 pos üç tüplerin her birine Aşama 1.9 &#39;den hücre 50 ul alikot (5x10 5). </li><li> Tüpler 1-8 için; 10 ul IgG bloğu (Reaktiflerin tabloya bakınız 100 mikrogram / IgG tüp) ekleve ortam sıcaklığında (20-25 ° C) sıcaklıkta 10 dakika için inkübe edilir. </li><li> Tüpler bir doygun 4, 5, 7 ila Tablo 1 &#39;de antikor miktarı (ler), ve 8 ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında ve ışıktan koruyarak için tüm örnekler (Tüpler 1-8) inkübe edilir. </li><li> Tüm örnekler HBSS +1% BSA 1.5 ml ekleyin, pelet santrifüj (5 dak 400 xg) ve dikkatli aspirasyon ile HBSS +1% BSA 1.5 ml ile bir kez yıkayın tarafından hücrelerin hücre kaybını önlemek için. </li><li> HBSS +1% BSA 500 ul her örnek süspanse edin. Sizin sitometresinde analiz edilecek numuneler için gereken, bir 12 x 75 mm yuvarlak dipli tüp transfer. Tablo 1 &#39;de olduğu gibi Tüpler 3, 6, 7 ve 8-100 mg / ml 7-AAD çalışma stok günlük (Reaktiflerin tabloya bakınız) 10 ul ekle. Akış sitometresi kurulum ve boyama doğrulama (3. Basamak) içinde kullanılmadan önce 30 dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin. </li></ol> 3. Akış Sitometresi Kurulum ve Boyama Doğrulama <ol><li> Doğrulayın akış cytometer günlük kalite kontrolü için laboratuvar kurdu prosedürlerini kullanarak, düzgün çalışıyor demektir. Bu sinyaller doğrulama kolayca kullanılmak üzere her spektral pencerede tespit edilir ve detektör çoğalma tepkileri izleme 14 için kullanılacak pencere içinde yoğunluk sinyali doğrusal orantılı olduğu varsayılır. Edilebilir </li><li> Lineer ekran ölçekler kullanılarak FSC vs Tüp 1 için SSC verileri edinin. Lenfosit popülasyonu nokta arsa sol alt kadranda düştüğü her dedektörün amplifikasyonu gibi ayarlayın, her iki parametreyi de off-ölçekli değildir ve eşikleme nedeniyle kesintiye uğramaz. 3.7 - Adımlar 3.3 Tüm örnekler için ungated FSC vs SSC verileri toplayın. </li><li> Tüm 4 floresan dedektörler için renk yok tazminat ve logaritmik ekran ölçekler kullanarak, Tüp 1 için veri edinin. / Hayır hücreleri ilk kanal birkaç biriken ölçekte boyanmamış lenfositlerin otofloresans yerleştirmek için her dedektörün yüksek gerilim (HV) ayarlayın. Her histogram analizi sınır ayarlamaboyanmamış hücrelerinin parlak% 2 karşılık gelmektedir. </li><li> Adımları 3.2 ve 3.3 &#39;te kurulan hiçbir renk tazminat ve HV ayarları kullanarak, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüp 2 için veri elde. PKH26 floresans izlemek için kullanılan dedektör için son kanal birkaç / hiçbir hücre ile, tüm PKH26 pos hücreleri 3. -4 dekadlarıdır tek bir simetrik pik olarak ölçekte göründüğünü doğrulayın. Orada birden zirveleri ya da tepe şekli çarpık ise, minimizasyonu ve karıştırma tekniği (Şekil 2) tuzlu özenle Adım 1&#39;i tekrarlayın. Eğer gerekirse, boya konsantrasyonu ayarlanır. </li><li> Adım 3.3 &#39;de kurulan ayarları kullanarak, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüp 3 için veri elde. 7-AAD floresans izlemek için kullanılan dedektör için, 7-AAD pos hücreleri (cansız hücreleri iyi çözümlenir yani, Adım 3.3 yılında% 2 sınır üzerinde düşüş olduğunu doğrulayınuygulanabilir 7-AAD neg hücreleri). </li><li> Adım 3.3 &#39;de kurulan ayarları kullanarak, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüp 4 için veri elde. CD8 pos hücreleri de boyanmamış hücreleri (yani, FITC dedektör için Adım 3.3 kurulan% 2 sınır üzerinde düşüş) çözümlenir doğrulayın. Tüp 5 ile tekrarlayın ve CD8 pos hücreleri de boyanmamış hücreleri (yani sonbahar APC dedektör için Adım 3.3 kurulan% 2 sınır yukarıda) çözümlenir doğrulayın. </li><li> Adım 3.3 &#39;de kurulan kullanarak ayarları, FSC, SSC ve tüm 4 floresans dedektörleri sinyalleri toplayarak, Tüpler 6, 7 ve 8 için veri elde. </li><li> Tüpler 1-5 ve diğer üç florokromlar izlemek için kullanılan dedektörler her florokrom için matris örtüşmeyen bir renk oluşturmak için renk kompanzasyon yazılımı için toplanan liste modunda dosyaları kullanın. Örnek 6 için liste modu dosyası için bu matrisi uygulayın ve doğrulayın PKH26 laboratuvar varlığıeling 7-AAD kut hücreleri algılamak için yeteneğini etkilemez. </li><li> A) 3 düzeldi altgrupları (CD3 neg neg CD4, CD3 pos CD4 neg ve CD3 pos CD4 pos) bir FITC vs ile tespit edilebilir: Renk Örnek 7 için liste modu dosyası için adım 3,8 matris örtüşen ve doğrulamak Uygula APC nokta arsa, ve anti-CD3-FITC ve anti-CD4-APC b) varlığında 7-AAD kutuplu hücreler tespit etme yeteneğine değiştirmez. , Anti-CD3-FITC varlığında PKH26 detektör toplanan veriler için üst sınır% 2 değiştirilmesi durumunda, gerekli olan sınır yeniden ayarlanması. </li><li> Adım 3,8 Örnek 8 için liste modu dosyası için renk örtüşme matris uygulayın. PKH26 etiketleme varlığında Adım 3.3 otofloresans kontrolü kullanarak bu kümesinden FITC, 7-AAD veya APC dedektörler için% 2 sınır değiştirir ise, Tablo 1 Tüp 7 kullanılarak gerektiğinde sınır (lar) yeniden ayarlayın ve doğrulayın o yine disting mümkündüruish CD3 pos CD4 pos, pos CD3 CD4 neg ve CD3 neg neg CD4 hücreleri ayarlanmış sınır (lar) kullanarak. </li></ol> 4. Boya Seyreltme tarafından Hücre Bölünmesi İzleme Proliferasyon Model Seçimi <ol><li> Sizin Sitometre üzerinde kanallar ve logaritmik yıllardır sayısına bağlıdır nesiller arasındaki aralığı belirleyin. Dijital aletleri için bu değer, tipik olarak 4 veya 5 on, dijital sinyal işlemcisi içinde kutuların sayısına göre belirlenir. Analog aletler üzerinde, yıllardır sayısı nadiren bütün bir sayıdır, doğru bir modelleme deneysel olarak tespit edilmesi onlarca yıl kesin sayısı gerektirir. Bunu yapmak için, üretici tarafından atanan göreceli yoğunlukları ile kalibre floresan boncuk karışımı veri deneyde kullanılan aynı detektör yüksek voltaj ayarlarında elde edilir. Boncuk tepe noktalarının konumu int açısından logaritmik ölçekli kalibrasyon sağlarGeçmiş on yılda densite aralığı. Özellikle, bu üretici tarafından değeri log karşı her bir boncuk tip için kanal numarasını çizilmesi ile yapılır. Boncuk veri değerleri için en uygun doğrunun eğimi kanal başına bağıl yoğunluk birimlerinin sayısını verir. Kanal sayısı ile çarpılır, bu değer daha sonra yoğunluğu iki kat azalma (yani, kızı nesil aralık) karşılık gelen kanal sayısı 14 hesaplanabilir hangi tam ölçek için günlük on sayısı olacaktır. </li><li> Nesiller arasında sabit bir aralık kullanmak veya aralık dalgalanmaya bırakmaya karar verin. A Standart (sabit) ayarı, her kuşağın yerini atamak Adım 4.5 belirlenen kuşak boşluk değerini kullanacak ve histogram farklı zirveleri yoksun olduğunda genellikle kullanılır. A Float ayar her kuşak peak pozisyonuna histogramın şekli ile tespit edilebilir ve ne zaman distinguishabl genellikle kullanılırE kuşak zirveleri belirgindir. </li><li> Tüm kuşaklar veya kayan genişliği için sabit bir tepe genişliği kullanacağınıza karar verin. Sabit bir genişlik tüm nesillere modellemek için uyarılmamış kontrol örneği için SD hesaplanan kullanır ve örnek ayırt nesiller zirveleri yoksun olduğunda genellikle seçilir. Bir yüzer genişlik programı bağımsız olarak her kuşak için SD değişmesini sağlar ve en iyi şekilde ayırt edilebilir kuşak zirveleri ile birlikte kullanılır. </li><li> Proliferasyonu analiz modülü (burada ModFit LT Sürüm 3.3) içeren bir program çalıştırın. (Örneğin, Tablo 1&#39;de Tüp 8 olarak zıt PKH26 pos hücreleri uyarılır 96 saat kültür) analiz edilecek veri kümesinin gelen uyarılmış PKH26 pos dosya yükleyin. </li><li> Bu durumda uygulanabilir kapılanan PKH26 (585/42) (7-AAD neg) CD3 pos lenfositler ve küçük moloz ve büyük agrega (Şekil 3) dışlamak için FSC vs SSC içinde, analiz için parametreleri seçin. TanımlarkenBu bölgelerde patlamalar genellikle bulunan yüksek forward scatter alanı vardır ve CD3 ekspresyonu uyarılır kültürlerde aşağı modüle olabilir dikkat etmek dikkatli olun. </li><li> Silahların Sihirbazı&#39;nı kullanarak yeni bir proliferasyon modeli oluşturun. Açık Veri Dosyası (Başlangıç ​​sekmesi) kullanarak, uyarılmamış PKH26 pos kontrol dosyası yüklemek ve bölünmemiş hücrelere karşılık gelen ebeveyn dağılımındaki pik kanalın konumunu tanımlamak. </li><li> Ebeveyn pik konumu ve genişliği (standart sapma) değerleri belirterek, uyarılmamış PKH26 pos kontrol dosyası analiz. Sabit bir zirve genişliği (SD) istenirse, Kilit SD kontrol edin. </li><li> PKH26 negatif kontrol (örn., PKH26 negatif hücreleri 96 saat kültür Tablo 1 &#39;de Tüp 7 zıt olarak) yerleştirin. PKH26 neg denetimi yukarıda dimmest nesil için pik kanalı ayarlayarak nesiller sayısını ayarlayın. Bu nu belirlermodeli doğru sığabilecek kızı nesillerin mber ve genellikle 6-9 nesiller. </li><li> Uyarılan numune için veri dosyasını (örneğin, Tablo 1 &#39;de Tüp 8 olarak zıt PKH26 kutuplu bir hücre stimüle 96 saat kültürü) açık olup Aşama 4.7&#39; de tanımlandığı gibi ebeveyn tepe pozisyon ve şizoaffektif bölgeleri değişmeden kalır teyit etmektedir. Sabit kuşak aralığı isteniyorsa, Standart model seçeneği seçin; aksi Yüzer seçeneğini seçin. </li><li> Adım 4.9 &#39;de tanımlanan aynı modeli kullanarak, veri kümesindeki her bir deney dosyasını analiz edin. Hem görsel hem de azaltılmış ki kare (RCS) değere göre tanımlanan ebeveyn tepe konumuna ufak ayarlamalar çok iyi oturması için gerekli olabilir. </li><li> Veri kümesinde her bir deneysel dosya için en iyi uygun sonucu arzu edilen çoğalma ölçümleri kaydedin. Mümkün ölçümleri kapsamlı bir açıklaması için bkz: Ref. 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr ve PK Wallace Life Technologies, Inc ve BD Biosciences değerlendirmeye için ticaret öncesi hücre izleme reaktifleri aldık. AD Bantly ve JS Moore değerlendirilmesi için reaktifler izleme ticaret öncesi hücre almış boyalar izleme çeşitli CellVue hücre ticaret öncesi karakterizasyonu için PTI Research, Inc Life Technologies, Inc ve finansman. K. Muirhead (Phanos Technologies, Inc danışmanlık hizmetleri sağlar (PKH ve CellVue boyalarının sahibi) ve Sigma-Aldrich ve Moleküler Hedefleme Technologies, Inc için yedekleme teknik destek sağlar SciGro, Inc tarafından istihdam ediliyor bu distribütörleri boyalar). Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Sigma-Aldrich tarafından desteklenmektedir.

Burada açıklanan yöntemler, en güvenilir membran boyalar 13,16,18 kullanarak hPBMC etiketleme ve membran veya protein boyalar 2,11,13,16 kullanarak lenfosit fenotiplen yayılması izleme için optimum sonuçlar vermek bizim kombine laboratuvarlarda bulunan olanlardır 18. Şekiller 1 ve 2 &#39;de gösterildiği gibi, parlak tekdüze etiketleme en kolay fizyolojik tuzları varlığında sınırlayan ve bir karıştırma tekniği kullanılarak elde edilir boya ile aynı konsantrasyon tüm hücrelerin hızlı ve homojen bir poz sonuçları. Membran boyalarla boyanması iki tabakalı lipid bölünme ile oluşur çünkü, ücretsiz boya konsantrasyonu değiştirebilecek diğer değişkenleri de etiketleme verimliliğini etkileyebilir. Örneğin, önceki Dilüent C resüspansiyon için tuz az verimli yıkama yuvarlak alt polistiren tüplerin sonuçlarında etiketlenmesi ve de özellikle, tüp duvarları üzerine adsorpsiyon boya nedeniyle azalan ücretsiz boya konsantrasyonudüşük boya konsantrasyonlarda. Her iki faktör konik alt polipropilen tüplere (Şekiller 3, 4 ve etiketleme kullanılarak yapıldığı zaman daha geniş kapsamlı leke dağılımları vermek eğilimindedir yayınlanmamış sonuçlar). Optimize boyama işlemleri kullanıldığında bile örnek yaşını ve türünü de pik genişliği etkileyebilir. Örneğin, 24 saat eski kan örnekleri veya TRIMA pheresis filtreleri aralığı izole lenfositler için CV ise% 14-20 den taze alınmış bir kan aralığı (Şekil 3, No. 13 ve yayınlanmamış sonuçlar) izole PKH26 Poz lenfositler için CV 25-30 % (Şekil 4 ve Ref. 18). Homojenlik ve cansız hücreler analiz dışında her ikisi de ayırt edilebilir kız zirveleri sırayla gözlenen verilerin (Şekil 5 ve 6 için uygun bir model çoğalma tercih etkiler boya seyreltme profil, belirgin ölçüde etkilememektedir edilebilir ölçüde Boyama </strong&gt;). ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) gibi çoğalması Endeksi ve Öncü Frekans (Şekil 3, 5 ve 6; Çizelge 3) gibi metrikler oluşturmak için kullanılan yazılım burada örnek olarak kullanılmasına rağmen, diğer yazılım paketleri de modül analiz içerir proliferasyon veri. Bunlar FCSExpress (De Novo Yazılım, Los Angeles, CA) ve FlowJo (Ağaç Yıldız, Inc, Ashland, OR). Tüm bu programlar iteratif konumu, yükseklik ve sıralı kızı nesiller temsil Gauss doruklarına SD (veya genişlik) değiştirerek ham veri için en uygun bulmak için bir non-lineer en küçük kareler analizi kullanın. Proliferatif İndeksi (PI) ve Prekürsör Frekans (PF) çoğalması ölçüde en sık kullanılan önlemlerdir. Tarafından tanımlandığı gibi ModFit PI, bir timidin alımının testinin &#39;uyarım endeksi &quot;benzer tahlil boyunca hücre sayısındaki artış, bir ölçüsüdür. PF ilk populat hücre fraksiyonu döndürürçoğalan uyarana cevap iyon. Terminoloji yazılım paketleri (örn., FlowJo ve ModFit &quot;Silahların Endeksi&quot; ne kastedildiği için farklı tanımları ve hesaplamaları kullanabilirsiniz) 22 arasında biraz değişir yana edebiyat okurken Dikkat, ancak tavsiye edilir. Protein boya kullanırken membran boyalarla etiketleme ve proliferasyon analizi için burada tartışılan önemli konular da rastlanmaktadır. Örneğin, karıştırma tekniği dikkat da CFSE (Şekil 6) 2-4,13,18,24 kullanıldığında düzgün dağılımlar ve ayırt edilebilir kız zirveleri elde etmek üzere, ölü / ölen hücrelerin dışlanması ile birlikte, dikkat edilmelidir. Fenotiplen canlılığı değerlendirmesi için florokromlar uygun seçimi özellikle KAKE 2-4,11,13,16,18 gibi görünür yayan protein boyalarla, aşırı spektral örtüşme ve antikor pozitif hücrelerin fark edememe önlemek için de önemlidir </sup&gt;. Izleme boya konsantrasyonu azaltılması bitişik spektral kanal tazminat sorunlar azalır ama yavru hücre yoğunlukları otofloresans örtüşmek başlamadan önce de izlenebilir hücre bölünmeleri sayısını sınırlar. Alternatif olarak, uzak kızıl yayan CellVue Bordo (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) veya menekşe yayan CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) gibi yeni hücre izleme boyaların dengeleme sorun (Şekil 6) azaltabilir kullanır. Membran boyalar genel olarak daha az toksisite 11,26 distorsiyonu üretmeğe temayül gösterir, ancak sonunda, bu boya ya da sınıf ile aşırı-etiketli hücre mümkündür. Bu, kullanılan izleme boya konsantrasyonu izlenir için hücrelerin işlevlerini (Şekil 6) 3,13,16,18 değiştirilmiş olmadığını doğrulamak için her zaman bu nedenle gereklidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya ekipman </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ticari olarak satın </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14175-079 </td><td> Fenol kırmızısı olmadan Kalsiyum ve magnezyum serbest, </td></tr><tr><td> İnsan IgG Cohn fraksiyon II ve III globulinler </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td laboratuvar titrasyon ile belirlenen&gt; doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Laboratuvar titrasyon tarafından belirlenen doyurarak konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 mg / ml; azid ücretsiz </td></tr><tr><td> Fare anti-insan CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 mg / ml; azid ücretsiz </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH 10-3M PKH26 ve Dilüent C içeren PKH26 kırmızı floresan hücre bağlayıcı kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT veya MINI26-1KT </td><td> Adım 1 usuller de geçerlidirPKH67 içeren kitleri veya diğer CellVue boyalar </td></tr><tr><td> EtOH ve Dilüent C 10-3M CellVue Claret içeren CellVue Claret kadar kırmızı floresan hücre bağlayıcı kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT veya MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (and-6)-carboxyfluorescein diasetat, süksinimidil ester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Sigara floresan; oluşturmak için membran esterazlarla yarılan floresan amino-reaktif carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) </td></tr><tr><td> DEAD / CANLI tamir edilebilir Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Steril 12 konik x 75 mm polipropilen tüpler ve kapakları </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Iyi membran boya boyama etkinliği (; süpernatant aspirasyon sırasında daha az hücre kaybı azalır boya adsorpsiyon) verir </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round alt Polistiren tüpler </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> Bioscience BD </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Ve APC ex; FITC, PKH26, ve 7-AAD (. Em sırasıyla 520 nm, 567 nm ve 655 nm, örneğin 488 nm) tespit edebiliyoruz herhangi sitometresinin. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII Cyan </td><td> Ve APC ex; FITC, PKH26, ve 7-AAD (. Em sırasıyla 520 nm, 567 nm ve 655 nm, örneğin 488 nm) tespit edebiliyoruz herhangi sitometresinin. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratuvar Hazırlayan </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, konsantre stok </td><td> NA </td><td> NA </td><td> PBS içinde 1 mg / ml idi. -20 ° C&#39;de alikotları ve mağaza içinde dondurun </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, kelkral stok </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 mikrogram / PBS ml 1 mg / ml dondurulmuş stok günlük hazırlamak. </td></tr><tr><td> IgG bloğu </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml insan IgG Cohn fraksiyonu II ve III globülinler + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Floresan hücre izleme boyalar, akım ve görüntü sitometrisi ile birlikte, in vitro ve in vivo olarak farklı hücre tipleri etkileşimleri ve kaderi çalışma hangi güçlü araçlardır. 1-5 tür boyalar kullanılarak yayınları binlerce, bazı anlamıyla olsa En sık görülen hücre izleme uygulamaları izleme şunlardır: <ol><li> kök ve progenitör hücre sükunet, proliferasyon ve / veya farklılaşma 6-8 </li><li> antijen tahrik zar transferi 9 ve / ya da öncü hücre proliferasyonunu ve 3,4,10-18 </li><li> immün düzenleyici ve efektör hücre fonksiyonu 1,18-21. </li></ol> Piyasada bulunan hücre izleme boyalar onların kimyaları ve floresans özellikleri yaygın değişebilir ama hücre etiketleme mekanizmasına dayalı iki sınıfa birine büyük çoğunluğu sonbaharda. &quot;Membran boyalar&quot;, yüksek lipofilik boyalar t vardır, PKH26 tiplemesindekihücre zarları 1,2,11 içine stabil ancak non-kovalent şapka bölümü. &quot;Protein boyalar&quot;, KAKE ile özdeşleşen, hücre proteinleri 4,16,18 stabil kovalent bağlar oluştururlar amino-reaktif boyalar vardır. Her sınıf kendi avantajları ve sınırlamaları vardır. Onların başarılı kullanımı için anahtar, özellikle birden çok boyalar farklı hücre tipleri izlemek için kullanılan renkli çalışmalarda, her sınıf 2-4,16,18,24 optimum kullanımını sağlamak kritik sorunları anlamak taşımaktadır. Protokoller hücre izleme boyalar kullanıldığında zayıf veya değişken sonuçlar üç yaygın nedenleri vurgulamak buraya dahil. Bunlar şunlardır: <ol><li> Parlak, homojen, tekrarlanabilir etiketleme ulaşmak için başarısızlık. Bu, herhangi bir hücre izleme çalışması için gerekli bir başlangıç ​​noktasıdır, ama protein boyalar veya antikorlar gibi denge bağlama reaktifleri kullanırken daha membran boyalar kullanarak farklı değişkenler için dikkat gerektirir. </li><li> Suboptimal florokrom kombinasyonlarnd / veya başarısızlık kritik tazminat denetimleri eklemek için. Boya floresan izleme genelde 10 2 - antikor floresans 10&#39;dan 3 kat daha parlak. Bu, izleme boya varlığında kullanılan diğer problar tespit etmek için imkan verecek olduğunu doğrulamak için elzemdir. </li><li> Pik modelleme yazılımı ile iyi bir uyum elde etmek için başarısız. Böyle bir yazılım habercisi frekans veya başka metriklere dayalı farklı popülasyonlar veya uyaranlara boyunca proliferatif cevap kantitatif karşılaştırılması sağlar. Iyi bir uyum elde edilmesi, ancak bir boya dilüsyon profilleri bozabilir hücreleri ölüyor ve gözlenen boya seyreltme profili özellikleri ile modelin altında yatan varsayımların eşleşen / ölü. Çıkarılmasını gerektirir </li></ol> Burada verilen örnekler hücre çoğalması izlemek membran ve / veya protein boyalar kullanılırken bu değişkenlerin sonuçları nasıl etkilediğini göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes at JoVE.com

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Immün hücre fonksiyonu ve proliferasyonu izlemek için hücre izleme boyalar başarıyla kullanımı pek çok kritik adımlar içerir. Biz yöntemleri açıklanmaktadır: 1) membran boyalarla parlak, homojen, tekrarlanabilir etiket-ing almak; 2) florokromlar ve veri toplama şartlarının belirlenmesi ve 3) boya seyreltme esas hücre çoğalması ölçmek için bir model seçerek.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Görüntüleme.  Roswell Park Cancer Institute. Immün hücre fonksiyonu ve proliferasyonu izlemek için hücre izleme boyalar başarıyla kullanımı pek çok kritik adımlar içerir. Biz yöntemleri açıklanmaktadır: 1) membran boyalarla parlak, homojen, tekrarlanabilir etiket-ing almak; 2) florokromlar ve veri toplama şartlarının belirlenmesi ve 3) boya seyreltme esas hücre çoğalması ölçmek için bir model seçerek.

Video: Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Biyoloji

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...